Name: Laser micro-bestraling om DNA-rekrutering tijdens de S-fase te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Leer hoe DNA-reparatie-eiwitten zich gedurende de S-fase rekruteren met behulp van laser micro-bestraling en fluorescerend gelabelde PCNA in levende cellen. Deze methode biedt hoge resolutie voor celcyclus-specifieke analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken M. Pagano voor zijn voortdurende steun, evenals D. Simoneschi, A. Marzio en G. Tang voor hun kritische beoordeling van het manuscript. B. Miwatani-Minter bedankt R. Miwatani en B. Minter voor hun voortdurende steun. G. Rona bedankt K. Ronane Jurasz en G. Rona voor hun voortdurende steun.

<ol><li>Aleksandrov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+in+complex+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics in complex DNA lesions.</a> Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+dna+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).</li>
<li>Cheruiyot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29-binding+promotes+Exo1+damage+recruitment+and+suppresses+its+nuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities.</a> DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).</li>
<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
<li>Marsin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+XRCC1+in+the+coordination+and+stimulation+of+oxidative+DNA+damage+repair+initiated+by+the+DNA+glycosylase+hOGG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).</li>
<li>Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+human+XRCC1+gene%2C+which+corrects+defective+DNA+strand+break+repair+and+sister+chromatid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange.</a> Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).</li>
<li>Scharer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair in eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609(2013).</li>
<li>Oeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+protein+migration+and+localization+after+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation.</a> Science Reports. 9 (1), 3148(2019).</li>
<li>Mistrik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+and+stripes%3A+A+novel+quantitative+photo-manipulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique.</a> Science Reports. 6, 19567(2016).</li>
<li>Durand, R. E., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity%2C+mutagenicity+and+dna+damage+by+hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).</li>
<li>Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization%3A+reversible+induction+of+G2+synchrony+in+cultured+rodent+and+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).</li>
<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+phosphorylation%3A+Its+role+in+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy.</a> Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).</li>
</ol>

De auteurs stellen dat de publicatie van het gepresenteerde werk werd gesponsord door Nikon Corporation. De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Kritieke stappen en mogelijke probleemoplossing/wijzigingen in het protocol Een goed weefselkweekvat voor microbestraling is van cruciaal belang voor succes. De meeste beeldvormingssystemen met hoge resolutie zijn geoptimaliseerd voor een dikte van 0,17 mm afdekglas. Het gebruik van beeldvormingskamers met een hogere of lagere dikte of kamers gemaakt van plastic polymeren (niet geoptimaliseerd voor 405 nm-beeldvorming), kan de beeldkwaliteit aanzienlijk verminderen. Wanneer u glazen oppervlakken gebruikt, moet u ervoor zorgen dat ze weefselkweek zijn behandeld om de celadhesie te verbeteren. Als ze niet met weefselkweek worden behandeld, moeten deze kamers bijvoorbeeld worden bedekt met poly-D-lysine voordat de cellen worden gezaaid. Bij het platen van cellen in het kamerdekglas is een ideale celdichtheid van het grootste belang om onregelmatigheden in de celcyclus en extra stress voor de cellen te voorkomen. Een goede thermische evenwichtsverdeling van de microscoopcomponenten voorafgaand aan het experimenteren om een stabiele temperatuur te behouden, is cruciaal voor zowel het behoud van de focus gedurende de time-lapse-beeldvorming als is ook noodzakelijk om een homogene DDR in de tijd en monsters te garanderen.
Het is van cruciaal belang dat cellen zich in een gezonde toestand bevinden voorafgaand aan microbestraling om artefactuele gegevens te verminderen. Als cellen een onregelmatige morfologie hebben na infectie / selectie, laat cellen dan door meerdere passages gaan totdat de morfologie weer normaal wordt. Zorg er altijd voor dat de gebruikte cellijnen vrij zijn van mycoplasmabesmetting. Onder de vele nadelige effecten van mycoplasma-infectie, veroorzaakt het ook DNA-schade aan de gastheercellen en kan het hun DDR-routesbeïnvloeden 14,15. De meest gevoelige manier om mycoplasma in de celkweek te detecteren is via PCR (versus detectie met DAPI of Hoechst).
Optimale overexpressie van het reparatie-eiwit van belang moet vergelijkbaar zijn met endogene niveaus, maar hoog genoeg voor detectie. De promotor die wordt gebruikt op de virale vectoren, de virale titer tijdens infectie en de lengte van de infectietijd kunnen allemaal worden aangepast voor ideale expressieniveaus. Voor consistente resultaten kunt u individuele celklonen isoleren om homogene expressieniveaus en normale celmorfologie te garanderen. Het wordt aanbevolen om vectorconstructen te gebruiken die gelabelde PCNA niet overexpressie op hogere dan endogene niveaus voor een goede celcyclus en DNA-reparatiemarkerfunctie. Zelfs lage niveaus van PCNA-overexpressie zijn voldoende om S-fasecellen te onderscheiden. Retrovirale pBABE-vectoren zijn met succes voor dit doel gebruikt (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA kan worden getagd met monomere rode(bijv. mPlum, mCherry, mRuby, enz.) of monomere groene fluorescerende eiwitten (bijv. mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, enz.) die vervolgens kunnen worden gecombineerd met een afwisselend getagde POI. Het overexpresseren van een fluorescerend getagde POI heeft enkele beperkingen en overwegingen. Fluorescerende tags kunnen de normale eiwitfunctie en lokalisatie verstoren. Er moet dus rekening worden gehouden met de locatie van de tag (N- of C-terminal). Gebruik altijd monomere fluorescerende eiwitten, omdat oligomerisatie van niet-monomere varianten de functie van de POI kan beïnvloeden.
De laserinstellingen moeten voor elk beeldvormingssysteem worden bepaald, omdat veel componenten van het optische pad van invloed zijn op het werkelijke vermogen dat in de cellen wordt geleverd. Lasermicrobestraling kan verschillende soorten DNA-laesies veroorzaken, afhankelijk van de excitatiegolflengte, het uitgangsvermogen van de FRAP-laser en of er voorsensibiliserende middelen (zoals Bromodeoxyuridine of Hoechst) zijn gebruikt. 405 nm lasers kunnen oxidatieve DNA-schade veroorzaken, enkel- en dubbelstrengs breuken16,17. Door hogere laseruitvoerinstellingen te gebruiken, neemt het aantal DSB's toe. In dit protocol werden pre-sensibilisatiemethoden niet gebruikt, maar deze technieken worden sterk behandeld in de literatuur en opnieuw afgetopt in de onderstaande discussie. Naar onze mening is de beste manier om te testen of de gewenste laesie wordt gegenereerd, door te testen op de rekrutering van bekende DNA-schaderoutespecifieke genen. Rekrutering van NTHL1 of OGG1, componenten van de BER-route, suggereert de inductie van geoxideerde DNA-basen10,11,17,18,19,terwijl FBXL10 of XRCC5 de aanwezigheid van DSBs8,20,21aangeven. Rekrutering van XRCC1 kan zowel de aanwezigheid van geoxideerde DNA-basen als enkelstrengsbreuken (SSB)aangeven 22,23. XPC (d.w.z. RAD4) is een goede indicator van NER die de omvangrijke DNA-adducten verwijdert die worden gegenereerd door ultraviolet licht (UV)17,24. Omdat het rekruteren van exogene eiwitten bepaalde onregelmatigheden kan introduceren, kan immunofluorescente kleuring van endogene DNA-reparatie-eiwitten of markers (zoals γH2A.X voor dubbelstrengsbreuken) de aanwezigheid van specifieke DNA-laesies bevestigen. Als alternatief kunnen ook antilichamen tegen specifieke soorten DNA-laesies worden gebruikt. Om het geleverde laservermogen aan te passen, kunnen zowel de verblijftijd als het laservermogen worden gewijzigd.
Met behulp van wiskundige modellering kan een gedetailleerde kinetische analyse worden uitgevoerd die waardevolle inzichten kan bieden in de rekruteringseigenschappen van de POI (bijv. Bijdrage van meerdere DNA-bindingsdomeinen, gevoeligheid voor verschillende signaleringsgebeurtenissen, enz.). Geautomatiseerde wervingsevaluatie en celtracking kunnen worden gecombineerd om robuuste workflows 1,25te creëren.
Voordelen en beperkingen van DNA-presensibilisatie Presensibilisatie van DNA voorafgaand aan micro-bestraling is een veelgebruikt hulpmiddel voor DNA-reparatie eiwitrekrutering16,17. Sensibiliserend DNA voorafgaand aan microbestraling maakt het gevoeliger voor DSB's. De twee meest voorkomende methoden voor DNA-voorsensibilisatie zijn voorbehandeling van cellen met Bromodeoxyuridine (BrdU) of Hoechst-kleurstof. Voor systemen die niet in staat zijn tot microbestraling met hoge laservermogens, kunnen deze methoden nodig zijn voor het induceren van DNA-laesies zoals DSB's. Bovendien, bij afwezigheid van een doorgegeven lichtdetector of een fluorescerend signaal dat de celkern benadrukt (bijvoorbeeld bij het bestuderen van de rekrutering van niet-gecodeerde endogene DNA-reparatie-eiwitten), fungeert Hoechst als zowel een presensibiliserend hulpmiddel als een fluorescerende nucleaire kleuring. DNA-presensibilisatie kan echter aanzienlijke complicaties met zich meebrengt. BrdU (gebruikt bij een eindconcentratie van 10 μM) moet 24 uur (of tijdsequivalent aan een volledige celcyclus in de gebruikte cellijn) worden toegevoegd om correct in het DNA te worden opgenomen en kan celcyclusinterferentie veroorzaken26. Hoechst 33342 (gebruikt bij een eindconcentratie van 1 μg/ml) is cytotoxisch na lange incubatieperioden, maar heeft voldoende tijd nodig om de kern met de kleurstof te verzadigen. Daarom mag het alleen 15-20 minuten voorafgaand aan microbestraling worden aangebracht; anders zijn de wervingsgegevens niet consistent. De cellen die op deze manier worden gekleurd, kunnen niet langer dan een paar uur in cultuur worden gehouden27,28. Zorg ervoor dat u geen Hoechst 33358 gebruikt, die niet zo celdoorlatend is als de Hoechst 33342 kleurstof. Pre-sensibilisatie kan ook onnodige variatie tussen experimenten introduceren en maakt het experiment nog gevoeliger voor verschillen in celdichtheid (omdat dit de hoeveelheid opgenomen kleurstof / cel zal beïnvloeden).
Voordelen en beperkingen van confocale microscopie De beeldvormingssnelheid van confocale microscopie kan beperkend zijn in vergelijking met widefield-microscopie. Een confocale microscoop uitgerust met een resonerende scanner kan echter de beeldvormingssnelheid enorm verbeteren (ten koste van de resolutie) en in de buurt komen van de snelheden van spinning-disk microscopie. Drie functies maken het A1R HD25 confocale systeem een uitstekende keuze voor het hier gepresenteerde protocol. Ten eerste maakt de 25 mm FOV van het systeem het mogelijk om tussen de 15-20 cellen in een enkel gescand veld (versus 5-10 cellen in reguliere opstellingen) in beeld te brengen, waardoor het aantal acquisities dat nodig is om voldoende cellen te krijgen voor statistische analyse wordt beperkt. Ten tweede maken de FRAP-module en twee scankoppen het mogelijk om de cellen tegelijkertijd in beeld te brengen en te micro-bestralen, niet alleen sequentieel. Ten slotte biedt de flexibiliteit van zowel de resonantie- als galvanoscanners de mogelijkheid om gemakkelijk te schakelen tussen beeldvorming met een hoge temporele resolutie met een uitzonderlijke snelheid die het doven van fluoroforen minimaliseert, en beeldvorming met een hoge ruimtelijke resolutie die langzamere scansnelheden gebruikt om beelden te produceren met een hogere signaal-ruisverhouding. Hoewel het gebruikte systeem de bovengenoemde flexibiliteit mogelijk maakte, om te lijken op meer algemeen beschikbare confocale microscoopconfiguraties, werd alleen de galvanoscanner gebruikt in de gepresenteerde experimenten (voor zowel microbestraling als daaropvolgende beeldvorming).
Voordelen en beperkingen van microbestraling Hoewel microstraling een ongeëvenaarde ruimtelijke en temporele resolutie biedt, is het niet zonder beperkingen. DNA-schade door lasermicrostraling is sterk geclusterd naar specifieke delen van de kern in vergelijking met natuurlijk voorkomende schadelijke stoffen. De chromatinerespons als gevolg van microstraling kan dus verschillen van homogeen verdeelde schade. Bovendien is microbestraling tijdrovend en kan deze slechts op enkele tientallen cellen worden uitgevoerd, terwijl grote populatiegebaseerde biochemische methoden (chromatinefractionering, immunoprecipitatie, ChIP) een verhoogde robuustheid kunnen bieden door duizenden cellen tegelijk te bestuderen. Het verifiëren van waarnemingen door microbestraling met traditionele biochemische technieken is een effectieve strategie voor betrouwbare conclusies. Hoewel gelijktijdige microbestraling van veel cellen in een bepaalde FOV mogelijk is, heeft het beeldvormingssysteem meer tijd nodig om de taak uit te voeren. Daarom beperkt het meten van de dynamiek van eiwitten die zeer snel rekruteren voor DNA-laesies het aantal mogelijke ROIs voor microbestraling dat tegelijkertijd wordt gebruikt. Op het beeldvormingssysteem dat voor dit protocol wordt gebruikt, duurt de microbestraling van een enkele ROI van 1024 pixels lang 1032 ms met een verblijftijd van 1000 μs en 3088 ms met een verblijftijd van 3000 μs om te voltooien. Het gebruik van meerdere lijnen van ROI's zal de tijd die nodig is om micro-bestraling te voltooien aanzienlijk verlengen (bijv. 7 x 1024 pixel lange ROI duurt 14402 ms met een verblijftijd van 1000 μs en 21598 ms met een verblijftijd van 3000 μs). Deze tijd gaat verloren door beeldverwerving en moet in overweging worden genomen. Gebruik bij het in beeld brengen van snelle rekruteringsgebeurtenissen de kortst mogelijke ROI en micro-bestraling slechts één cel tegelijk.
Voordelen en beperkingen ten opzichte van synchronisatiemethoden Voor celcyclusspecifieke studies omvatten de bestaande methoden ofwel de synchronisatie van cellen in specifieke celcyclusfasen of het gebruik van fluorescerende reporters om de specifieke celcyclusfase van de cel te identificeren. Elk van deze methoden biedt echter zijn eigen uitdagingen en beperkingen.
Het FUCCI-systeem3 (gebaseerd op fluorescerend eiwit met gelabelde afgeknotte vormen van CDT1 en Geminin) is een bijzonder nuttig hulpmiddel voor celcyclusstudies, maar heeft beperkingen als het gaat om het onderscheiden tussen S- en G2-fasen van de celcyclus. Geminin niveaus zijn al hoog vanaf het midden van de S-fase en blijven hoog tot de M-fase, waardoor deze fasen moeilijk te scheiden zijn. Het gebruik van het FUCCI-systeem betekent ook dat twee optische kanalen van de microscoop niet kunnen worden gebruikt voor het afbeelden van de POI.
Niet-kankercellijnen kunnen worden gesynchroniseerd met G0 door de verwijdering van groeifactoren in het serum (serumuithongering) waardoor weinig of geen DNA-schade aan de cellen ontstaat. De meeste kankercellijnen zullen echter gedeeltelijk door de celcyclus blijven gaan, zelfs zonder voldoende hoeveelheden serum in hun media. Bovendien beginnen cellen gedeeltelijk de synchronisatie te verliezen tegen het einde van de G1, vroege S-fase. Naast serumgebrek zijn er tal van chemische methoden om celcyclussynchronisatie te bereiken. Hydroxyurea, aphidicolin en thymidine-blokken zijn methoden om DNA-replicatie te stoppen om cellen te synchroniseren in de vroege S-fase. Hoewel deze methoden goedkoop en eenvoudig zijn, introduceren ze replicatiestress die resulteert in DNA-schade. Van deze DNA-replicatieremmers is aangetoond dat ze de fosforylering van H2A induceren. X, een bekende marker van DSBs2,29. De methode van het gebruik van tagged-PCNA als marker voor S-fase cellen vermindert het potentieel voor artefacten veroorzaakt door chemische synchronisatie en kan worden toegepast op een breed scala aan cellijnen in vergelijking met serumuithongering.
Conclusie DNA-schade is een drijvende kracht voor genetische ziekten waarbij mutagene laesies kunnen leiden tot de kwaadaardige transformatie van cellen. Het richten op de DNA-synthesemachinerie is een fundamentele therapeutische strategie bij de behandeling van hyperproliferatieve ziekten zoals kanker. Om deze ziekten gerichter te behandelen, hebben we een beter begrip nodig van de eiwitten die DNA-laesies repareren. Het hier beschreven protocol helpt op microbestraling gebaseerde studies in de S-fase door de uitdagingen van traditionele synchronisatiemethoden te minimaliseren om mogelijke artefacten te verminderen en de reproduceerbaarheid van de experimenten te vergroten.

Verschillende DNA-reparatieroutes zijn geëvolueerd om de verschillende soorten DNA-laesies aan te pakken die in cellen kunnen ontstaan, die allemaal sterk gereguleerd zijn in zowel ruimte als tijd. Een van de meest kwetsbare periodes van de celcyclus is de S-fase, wanneer DNA-synthese plaatsvindt. Hoewel proliferatie fundamenteel is voor het leven, biedt het ook een grote uitdaging. Cellen moeten zorgen voor een getrouwe replicatie van hun genoom om te voorkomen dat mutaties worden doorgegeven aan toekomstige generaties. Bijgevolg biedt proliferatie een therapeutisch interventiepunt dat is gebruikt voor de ontwikkeling van therapeutische benaderingen op het gebied van oncologie.
Alle belangrijke technieken die worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitrekrutering bij DNA-laesies hebben hun sterke punten en beperkingen. Micro-bestraling heeft een betere ruimtelijke en temporele resolutie1 dan de meeste alternatieve methoden zoals immunofluorescente beeldvorming van ioniserende straling-geïnduceerde foci (IRIF), chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) of biochemische fractionering. Microbestraling doorspekt echter de robuustheid van de bovengenoemde technieken die een groot aantal cellen tegelijkertijd kunnen bemonsteren.
Om DNA-reparatie in S-fase te onderzoeken, moet men S-fasecellen kunnen onderscheiden in een asynchrone celkweekpopulatie. Er zijn veel bekende methoden om dit aan te pakken, waarbij de synchronisatie van cellen of visualisatie van de verschillende celcyclusfasen betrokken zijn. Beide benaderingen brengen echter aanzienlijke uitdagingen en mogelijke artefacten met zich mee. Chemische synchronisatiemethoden die veel worden gebruikt om cellen in de vroege S-fase te verrijken (bijv. Dubbele thymidineblok-, aphidicolin- en hydroxyurea-behandeling) bereiken synchronisatie door de inductie van replicatiestress en uiteindelijk DNA-schade zelf. Dit beperkt het gebruik van deze methoden om DNA-reparatieprocessen in S fase 2 tebestuderen. Synchronisatie door serumuithongering en -afgifte is slechts van toepassing op een beperkt aantal cellijnen, grotendeels met uitzondering van kankercellijnen die minder afhankelijk zijn van groeifactoren voor celcyclusprogressie in vergelijking met niet-getransformeerde cellijnen. Het Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) -systeem is een bijzonder nuttig hulpmiddel om de celcyclus te bestuderen, maar het heeft een fundamentele beperking bij het onderscheiden tussen S- en G2-celcyclusfasen3.
Hier wordt aangetoond dat het gebruik van fluorescerend gelabeld PCNA als een niet-invasieve marker voor S-fase de nadelen van chemische celcyclussynchronisatiemethoden beperkt, terwijl meer specificiteit en flexibiliteit mogelijk is dan het FUCCI-systeem. Als een enkele marker kan PCNA niet alleen S-fasecellen in een asynchrone populatie markeren, maar het kan ook de exacte progressie van cellen binnen de S-fase (d.w.z. vroege, midden- of late S-fase) laten zien4. Lage expressieniveaus van exogene, gelabelde PCNA zorgen voor minimale interferentie met zowel celcyclusprogressie als DNA-reparatieprocessen. Belangrijk is dat PCNA ook dient als een interne controle voor de juiste DNA-schade-inductie, omdat het betrokken is bij het herstel van verschillende DNA-laesies en wordt gerekruteerd naar lokaal geïnduceerde DNA-schadeplaatsen1,4.
De hier gepresenteerde experimenten laten zien hoe de rekruteringsdynamiek van EXO1b in S-fase kan worden gemeten en hoe dit wordt beïnvloed door de gevestigde PARP-remmer olaparib. EXO1b-nuclease-activiteit is relevant voor een breed scala aan DNA-reparatieroutes, waaronder mismatch-reparatie (MMR), nucleotide-excisieherstel (NER) en dubbelstrengsbreuk (DSB) -reparatie. In de S-fase speelt EXO1b een belangrijke rol bij homologe recombinatie (HR) door de vorming van 3' ssDNA-overhangen tijdens DNA-resectie5. EXO1b is verder betrokken bij DNA-replicatie met rollen in checkpoint-activering om vastgelopen DNA-vorken opnieuw op te starten, evenals primerverwijdering en Okazaki-fragmentrijping aan de achterblijvende streng tijdens strengverplaatsing in replicatie5. EXO1b-rekrutering naar beschadigde DNA-plaatsen wordt gereguleerd door de directe interactie met poly (ADP-ribose) (PAR)6,7. Vanwege de vele celcyclusspecifieke implicaties van EXO1b, is het een uitstekende keuze voor S-fase specifieke rekruteringsstudies met behulp van PCNA.

<table><tbody><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>Voor het blussen van formaldehyde</td></tr><tr><td>Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>primair antilichaam</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA voor blokkering</td></tr><tr><td>BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine)</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>pre-sensitiserend middel</td></tr><tr><td>Citifluor&trade; Mountant Solution AFR3</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17973-10</td><td>antifade bevattende PBS-oplossing voor beeldvorming</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>nucleïnezuurkleurstof</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>Celcultuurmedium voor HEK293T-cellen</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Vehicelcontrole en oplosmiddel</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>viraal expressievector voor EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (in pRetroQ)</td><td>custom cloning</td><td>na</td><td>EXO1b cDNA werd gekloond in de NheI, BamHI-plaatsen van pRetroQ-AcGFP1-N1-vector.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Media-aanvulling</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Phenol red vrij medium voor microscopie</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>secundair antilichaam</td></tr><tr><td>HEK293T cellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Cellijn voor viraal verpakken</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Buffermiddel om levend celbeeldvormingsmedium aan te vullen</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>pre-sensitiserend middel</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>McCoy&rsquo;s 5A (Modified) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>Celcultuurmedium voor U-2 OS cellen</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>niet-viraal PCNA-construct geschikt voor celcyclusmarker</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>niet-viraal PCNA-construct geschikt voor celcyclusmarker</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (in pBABE)</td><td>custom cloning</td><td>na</td><td>mPlum-PCNA cDNA werd gekloond van Addgene #55994 in de BamHI, SalI-plaatsen van pBABE (puro)</td></tr><tr><td>Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>confocal beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Nikon LUN4 laser unit</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>excitatiesysteem</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>FRAP-laserunit</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Confocal Controller Software</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Confocal besturingssoftware</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Inverted Microscope</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>inverted epifluorescente microscoopbasis</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>verlichtingssysteem</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (in pRetroQ)</td><td>custom cloning</td><td>na</td><td>NTHL1 cDNA werd gekloond in de NheI, SalI-plaatsen van pRetroQ-mCherry-N1-vector.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Live cell microscopie celcultuur kamer</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>PARP-remmer</td></tr><tr><td>Opti-MEM reduced serum media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Verdunningsmedium voor transiente transfectie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde aqueuze oplossing (32%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fixeermiddel</td></tr><tr><td>pBABE (hygro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>retroviraal expressievector (voor lage expressieniveaus)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>retroviraal expressievector (voor lage expressieniveaus)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>retroviraal expressievector (voor lage expressieniveaus)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>retroviraal expressievector (voor lage expressieniveaus)</td></tr><tr><td>PCNA Antibody (PC10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td><td>primair antilichaam</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Media-aanvulling</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Verhoog virale infectie-efficiëntie</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>retroviraal expressievector</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>retroviraal expressievector</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>retroviraal expressievector</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>retroviraal expressievector</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Virale verpakkingsvector</td></tr><tr><td>Sodium-pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Aanvulling voor levend celbeeldvormingsmedium</td></tr><tr><td>Triton X-100 aqueuze oplossing (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Verdun in PBS voor celpermeabilisatie buffer</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Verdun in PBS om cellen te splitsen</td></tr><tr><td>U-2 OS Cellen</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;HTB-96</td><td>Optimale cellijn voor microscopie experimenten</td></tr><tr><td>Universal Mycoplasma Detection Kit</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>PCR-gebaseerde Mycoplasma detectiekit</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Virale eiwit-omhulsel vector</td></tr></tbody></table>

laser micro-bestraling om dna-rekrutering tijdens de s-fase te bestuderen

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA-schadeherstel handhaaft de genetische integriteit van cellen in een zeer reactieve omgeving. Cellen kunnen verschillende soorten DNA-schade accumuleren als gevolg van zowel endogene als exogene bronnen zoals metabole activiteiten of UV-straling. Zonder DNA-reparatie wordt de genetische code van de cel aangetast, waardoor de structuren en functies van eiwitten worden ondermijnd en mogelijk ziekte wordt veroorzaakt. 
Het begrijpen van de spatiotemporale dynamiek van de verschillende DNA-reparatieroutes in verschillende celcyclusfasen is cruciaal op het gebied van DNA-schadeherstel. De huidige fluorescerende microscopietechnieken bieden geweldige hulpmiddelen om de rekruteringskitiek van verschillende reparatie-eiwitten na DNA-schade-inductie te meten. DNA-synthese tijdens de S-fase van de celcyclus is een eigenaardig punt in het lot van cellen met betrekking tot DNA-reparatie. Het biedt een uniek venster om het hele genoom te screenen op fouten. Tegelijkertijd vormen DNA-synthesefouten ook een bedreiging voor de DNA-integriteit die niet wordt aangetroffen in niet-delende cellen. Daarom verschillen DNA-reparatieprocessen aanzienlijk in de S-fase in vergelijking met andere fasen van de celcyclus, en die verschillen zijn slecht begrepen. 
Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding van cellijnen en de meting van de dynamiek van DNA-reparatie-eiwitten in S-fase op lokaal geïnduceerde DNA-schadeplaatsen, met behulp van een laserscannende confocale microscoop uitgerust met een 405 nm laserlijn. Tagged PCNA (met mPlum) wordt gebruikt als een celcyclusmarker in combinatie met een AcGFP-gelabeld reparatie-eiwit van belang (d.w.z. EXO1b) om de DNA-schaderekrutering in de S-fase te meten.

Cellen pakken elk type DNA-laesie aan op een specifieke manier die ook afhangt van de fase van de celcyclus waarin ze zich bevinden. Na microbestraling worden bijvoorbeeld dubbelstrengs breuken (DSB) verwerkt door niet-homologe eindvoeging (NHEJ) of HR, afhankelijk van de celcyclusfase. Nucleasen die het meest uitgebreid werken tijdens de S- en G2-fasen van de celcyclus creëren DNA-overhangen die cruciaal zijn voor een goede HR. Om de evaluatie van cellen in de S-fase te bevorderen, werd PCNA gebruikt als een eenkleurige celcyclusmarker. Figuur 1A toont het lokalisatieprofiel van mPlum-PCNA tijdens de progressie van de celcyclus. PCNA heeft een volledig homogene verdeling in de kern in de G1- en G2-fase (terwijl het ook meestal wordt uitgesloten van de nucleoli). In de S-fase lokaliseert PCNA naar plaatsen van DNA-replicatie, die kunnen worden gevisualiseerd als heldere vlekken in de kern. In vroege S-fase cellen zijn de vlekken relatief klein en gelijk verdeeld over de kern van de cel. In het midden van de S-fase worden de vlekken wazig en lokaliseren ze meer naar de omtrek van de kern en de nucleoli. In de late S-fase nemen de vlekken in aantal af, maar worden ze steeds groter naarmate PCNA zich concentreert op late replicatielocaties(figuur 1B). Belangrijk is dat exogene PCNA-expressie van de pBABE-vectorbackbone minder was dan de endogene niveaus, maar voldoende was voor detectie door microscopie die potentiële artefacten in celcyclusprogressie en DDR minimaliseert. Figuur 1C toont de mate van PCNA-overexpressie in vergelijking met endogene niveaus. Houd er rekening mee dat de band die overeenkomt met mPlum-PCNA langzamer migreert vanwege het grotere formaat.
We wilden DSB's introduceren tijdens microbestraling om de PARP1/2-afhankelijke rekrutering van EXO1b voor deze laesies in de S-fase te onderzoeken. Figuur 2A laat zien dat lage doses energie (1000 μs verblijftijd) niet leiden tot de rekrutering van EGFP-FBXL10, een DSB-responder (onderdeel van het FRUCC-complex 8), terwijl het voldoende was om de rekrutering van NTHL1-mCherry, een base excision repair (BER) pathway-eiwit, te induceren naar plaatsen van oxidatieve DNA-schade10,11,12. Bij 3000 μs verblijftijd, zowel EGFP-FBXL10 als NTHL1-mCherry rekruteren, wat een laseroutput aantoont die zowel oxidatieve laesies als DSB's genereert. Figuur 2B versterkt deze resultaten en toont immunofluorescentiekleuring tegen γH2A.X (DSB-marker), die duidelijk duidelijker is bij het gebruik van hogere energiedoses. PCNA dient als zowel een celcyclusmarker als een marker voor succesvolle microbestraling, omdat het adequaat rekruteert met beide laserbewoningstijdinstellingen. Belangrijk is dat zowel exogene als /of endogene fluorescerende eiwit-gelabelde PCNA kan worden gebruikt voor deze reporterfunctie, omdat ze zich op dezelfde manier gedragen(figuur 3). Endogeen getagde PCNA werd ontworpen door mRuby in frame met het eerste exon in één allel van de PCNA locus13 in te brengen (de cellijn was een soort geschenk van Jörg Mansfeld).
Figuur 4A en figuur 4C tonen de rekrutering van AcGFP-gelabelde EXO1b in S-fasecellen. EXO1b bereikt ongeveer 1 minuut het maximale accumulatieniveau op microbestralingsplaatsen en begint daarna langzaam los te weken van de DNA-laesies. Verrijkingen op microstralingsplaatsen worden aangegeven door een > 1 relatieve fluorescentie-eenheid op de grafiek. In aanwezigheid van olaparib is de accumulatie van EXO1b op de laserstreep na 1 minuut aanzienlijk minder in vergelijking met de voertuigbesturing. Deze resultaten komen in overeenstemming met de literatuur6,7. Figuur 4B toont representatieve regio's voor kwantificering (gebieden A, B en C) zoals beschreven in punt 6 van het protocol. Figuur 4D toont de vergelijkbare expressieniveaus van endogene EXO1b en exogene EXO1b-AcGFP in cellen die worden gebruikt voor microstraling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> Figuur 1: Lokalisatiepatroon van PCNA. (A) Afbeeldingen tonen het lokalisatiepatroon van stabiel geïntegreerd, exogene PCNA gedurende de celcyclus in U-2 OS-cellen. (B) Afbeeldingen tonen PCNA-focipatronen in verschillende stadia van de S-fase (vroeg, midden en laat) in U-2 OS-cellen. (C)Western blot met endogene en exogene niveaus van PCNA in de U-2 OS-cellen die worden gebruikt voor beeldvorming. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> Figuur 2: Inductie van DSB's door geoptimaliseerd laservermogen. (A) Laserinstellingen kunnen worden geoptimaliseerd om verschillende vormen van DNA-schade te induceren. U-2 OS-cellen die zowel EGFP-FBXL10 als NTHL1-mCherry stabiel tot expressie brengen, werden gebruikt om respectievelijk DSB's en plaatsen van oxidatieve laesies te identificeren. Microbestraling met een 405 nm laserlijn werd uitgevoerd op asynchrone U-2 OS-cellen met een verblijftijd van 1000 μs of 3000 μs. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. (B) Immunofluorescente kleuring tegen γH2A.X werd gedaan op menselijke retinale pigmentepitheelcellen (hTERT RPE-1) met mRuby-tagged endogene PCNA. Cellen werden gefixeerd en verwerkt 5 minuten na micro-bestraling met een verblijftijd van 1000 μs of 3000 μs. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> Figuur 3: Vergelijkbare rekrutering van endogene mRuby-PCNA en exogene mPlum-PCNA naar microbestralingsplaatsen bij 1000 μs of 3000 μs lasertijd. Zowel endogene als exogene gelabelde PCNA vormen replicatiehaarden tijdens de S-fase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> Figuur 4: PARP1/2-afhankelijke rekrutering van EXO1b in S-fase. U-2 OS-cellen die stabiel EXO1b-AcGFP en mPlum-PCNA tot expressie brengen, werden microbestraald met 405 nm FRAP-laserlijn met behulp van 3000 μs verblijftijd. A)Representatieve beelden van microbestraalde cellen op de aangegeven tijdstippen na voorbehandeling met mediumcontrole (DMSO) of olaparib (1 μM). Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. (B) Representatieve afbeeldingen van gedefinieerde gebieden van A-, B- en C-gebieden voor de wervingsanalyse. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. (C) DNA-schade rekruteringsdynamiek werd vastgelegd door live celbeeldvorming. Relatief gemiddelde fluorescentiewaarden en beelden werden elke 5 s gedurende 12 minuten verkregen. Voor elke aandoening werden ≥30 cellen geëvalueerd. Gemiddelde relatieve fluorescentiewaarden (ononderbroken zwarte lijnen) en standaardfout (bereik gevisualiseerd door een gearceerd gebied) werden uitgezet tegen de tijd. Stippellijn toont rekruteringswaarden op 1 minuut na micro-bestraling. Het verschil tussen de behandeling met DMSO (n=32) en olaparib (n=31) werd berekend met behulp van een Mann-Whitney-test. Asterix duidt op p<0,0001. (D) Western blot vergelijkt de expressieniveaus van endogene EXO1b en exogene EXO1b-AcGFP in cellen die worden gebruikt voor microbestraling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om S-fase cellen efficiënt te identificeren voor downstream microscopiestudies, zoals het meten van DNA-reparatie eiwitrekrutering door lasermicrobestraling.

Laser micro-bestraling om DNA-rekrutering tijdens de S-fase te bestuderen

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Dit protocol helpt om de ruimtelijke en temporele rekrutering van DNA-schadehersteleiwitten te begrijpen, rekening houdend met de celcyclusfase. Voor celcyclusdiscriminatie gebruiken we fluorescerend eiwitgelabeld PCNA als een marker van de S-fase, die artefacten omzeilt die zijn geïntroduceerd door andere celcyclussynchronisatiemethoden. Dit in combinatie met op laser gebaseerde microbestraling geeft een ongeëvenaarde spatiotemporale resolutie voor DNA-schadeherstel eiwitkinetiek.Succesvol in routinematig gebruik van ons protocol bouwt voort op basiskennis van confocale beeldvorming. Plaats 24 uur voor de microbestraling in totaal acht bij 10 tot de vierde cellen in 500 microliter tot één milliliter media op een afdekglas met vier goed kamer. Wissel een uur voor de microbestraling het reguliere groeimedium uit met beeldvormend medium dat olaparib of een voertuigcontrole zoals DMSO bevat.Schakel ten minste vier uur vóór de beeldvorming de omgevingskamer en de microscoopcomponenten in. Schakel de verwarming, kooldioxidetoevoer en de vochtigheidsregelaar in. Initialiseer lichtbronnen samen met de laserlijnen ten minste een uur voordat u de cellen naar de microscoop overbrengt.Olie het microscoopobject en plaats een kamerglas onder de microscoop. Om S-fasecellen in een asynchrone populatie te selecteren, zoekt u door het oculair naar het unieke lokalisatiepatroon van de mPlum-tag PCNA in S-fase en selecteert u een gezichtsveld met voldoende S-fasecellen voor microbestraling. Stel het gebied in dat van belang is voor microbestraling door de bijbehorende software te gebruiken om binaire lijnen in te voegen.Om het gewenste aantal regels en afstand in te stellen, klikt u op binair, selecteert u vervolgens lijn, cirkel en ellips invoegen om het gewenste aantal lijnen te tekenen, converteert u deze binaire lijnen in stimulatie-ROI's door op ROI te klikken, binair naar ROI te verplaatsen, klikt u vervolgens met de rechtermuisknop op een van de ROI's en selecteert u gebruiken als stimulatie ROI S1. Plaats deze lijnen in het gezichtsveld zodat ze door de kern van de cellen gaan. Vóór microbestraling, om PCNA-foci te identificeren voor latere analyse, maakt u een afbeelding met een hogere resolutie van het gezichtsveld door de benodigde parameters in te stellen in de compacte GUI A1 LFOV en de vensters van het A1 LFOV-scangebied, gevolgd door op de opnameknop te drukken. Om de microbestraling in te stellen, opent u het tabblad ND-stimulatie en opent u vervolgens het tijdschemavenster om een reeks prestimulatiebeelden en vervolgens een reeks poststimulatiebeelden te verkrijgen met behulp van de Galvano-scanners.Stel drie fasen in het tijdschemavenster in. Selecteer in de kolom acquisitie en stimulatie respectievelijk acquisitie, stimulatie en acquisitie voor de drie fasen. Stel voor de stimulatiefase S1 in als roi.Stel in het Galvano XY-venster het 100% laservermogen in voor de 405 nanometer laserlijn en stel de verblijftijd in voor microstraling. Als u timelapse-beeldvorming wilt instellen voor het gewenste tijdvenster en de gewenste intervallen, gebruikt u het tijdschema A1 LFOV compact GUI en de A1 LFOV-scangebiedvensters. Optimaliseer het laservermogenspercentage, de versterking en de offset-instellingen om het bleken van foto's tijdens het maken van afbeeldingen in het compacte GUI-venster A1 LFOV te verminderen.Afhankelijk van de kinetiek van het eiwit, verleng of verkort u het interval tussen beelden of de duur van de totale timelapse door het gewenste interval en de gewenste duur voor de derde fase-acquisitierij in het tijdsschemavenster in te stellen. Druk nu op run om de microbestraling en de daaropvolgende timelapse-beeldvorming uit te voeren. Sla aan het einde van de timelapse-beeldvorming de stimulatie-RUP's op als afzonderlijke afbeeldingen, die nuttig zullen zijn voor het identificeren van de coördinaten van microbestraling in alle downstream-software die voor analyse wordt gebruikt.PCNA heeft een volledig homogene verdeling in de kern in G1- en G2-fasen. In de S-fase lokaliseert PCNA naar plaatsen van DNA-replicatie, die kunnen worden gevisualiseerd als heldere vlekken in de kern. In vroege S-fase cellen zijn de vlekken relatief klein en gelijk verdeeld over de kern van de cel.Terwijl ze zich in het midden van de S-fase ontwikkelen, worden de vlekken wazig en lokaliseren ze meer naar de omtrek van de kern en de nucleoli. In de late S-fase nemen de vlekken in aantal af, maar worden ze steeds groter naarmate PCNA zich concentreert op late replicatielocaties. Lage doses energie, zoals 1.000 microseconden verblijftijd, induceren geen rekrutering van EGFP-FBXL10, een dubbelstrengs break responder, maar zijn voldoende om rekrutering van NTHL1-mCherry te induceren, een base excisie reparatie pathway eiwit dat wordt gerekruteerd naar plaatsen van oxidatieve DNA-schade.Na een verblijftijd van 3.000 microseconden worden zowel EGFP-FBXL10 als NTHL1-mCherry gerekruteerd, wat een laseruitvoer aantoont die zowel oxidatieve laesies als dubbelstrengsbreuken genereert. EXO1b bereikt ongeveer een minuut een maximaal niveau van accumulatie en microbestralingsplaatsen en begint dan langzaam los te gaan van de DNA-laesies. In aanwezigheid van olaparib is de accumulatie van EXO1b op de laserstreep op één minuut aanzienlijk minder in vergelijking met de voertuigbesturing.Het is van cruciaal belang dat de microscoop voldoende tijd krijgt om op te warmen en dat de cultuur en omstandigheden optimaal zijn voor elk experiment om consistente resultaten te garanderen. Daarnaast is het belangrijk om uw laserinstellingen te optimaliseren met verschillende DNA-schadeverslaggevers om te testen op specifieke DNA-laesies. Overweeg na microbestraling om resultaten te valideren met klassieke biochemische methoden, zoals fractionering, immunoprecipitatie of ChIP.Deze benaderingen bemonsteren een grotere celpopulatie en bieden dus statistische sterkte.

laser-micro-irradiation-to-study-dna-recruitment-during-s-phase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Het testen van visuele gevoeligheid bij hagedissen met behulp van een operante conditionering paradigma dat het afspelen van video van de random-dot kinematograms en computer-gegenereerde ongewervelde dieren in dienst heeft.

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Een gedetailleerd protocol is beschreven voor de beeldvorming van de real-time vorming van DNA-herstel complexen...

Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis</em

Acute nierschade (AKI) bij de mens is een veel voorkomend klinisch probleem wordt veroorzaakt door schade aan de epitheliale cellen die de nieren nefronen bevatten, en de AKI wordt geassocieerd met een hoge sterfte van...

Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Leer hoe DNA-reparatie-eiwitten zich gedurende de S-fase rekruteren met behulp van laser micro-bestraling en fluorescerend gelabelde PCNA in levende cellen. Deze methode biedt hoge resolutie voor celcyclus-specifieke analyse.

Laser micro-bestraling om DNA-rekrutering tijdens de S-fase te bestuderen

Meer video's verkennen