Praktische aspecten van monstervoorbereiding en -opstelling van ¹H R_1ρ ontspanningsdispersie-experimenten met RNA

Dit protocol beschrijft RNA-monstervoorbereiding en NMR-opstelling voor proton R1rho ontspanningsdispersiemetingen om bevestigingsuitwisseling in RNA-moleculen te onderzoeken. Omdat protonen worden onderzocht, heeft de methode geen isotopenetikettering nodig en heeft deze direct toegang tot structurele kenmerken zoals verschoven base-pairing. De pipet is vrij modulair in die zin dat R1rho ontspanningsdispersie kan worden gemeten, zelfs als het monster met een andere methode wordt geproduceerd.

Begin met het voorbereiden van het plasmidemonster en het opzetten van een in vitro transcriptie en decolletéreactie zoals beschreven in het teksthandschrift. Incubeer de reactie een uur lang bij 37 graden Celsius. Verdun vervolgens een microliter van het monster vertienvoudigd in de laadoplossing.

En voer een microliter uit op een denaturering PAGE gel. Als de decolletéreactie succesvol is, schaalt u de reactie op het gewenste volume en voert u deze 's nachts uit. Voer vervolgens nog een denaturering PAGE gel uit en beoordeel of de decolletéreactie is voltooid.

In geval van onvolledig decolleté verwarmt u de reactieoplossing in een conventionele magnetron gedurende 15 seconden op 450 watt. Koel vervolgens de oplossing gedurende 40 minuten langzaam af tot 37 graden Celsius om de RNA en de decolletégeleider opnieuw teanneal. En let op de vorming van een nieuw neerslag.

Voeg meer anorganische pyrofosfatase toe en RNase H.Incubateer de reactie gedurende één tot drie uur bij 37 graden Celsius. Bevestig vervolgens de voltooiing van de decolletéreactie met denaturering PAGE. Wanneer de RNase H-decolletéreactie is voltooid, dooft u de reactie door EDTA toe te voegen aan een eindconcentratie van 50 millimol.

En vortex grondig. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 micron. En concentreer de oplossing op een volume dat kan worden geïnjecteerd in een HPLC-systeem voor zuivering.

Voordat u het geconcentreerde en gezuiverde monster aan de NMR-buis toevoegt, reinigt u de buis door met overvloedig water te spoelen. Dan RNase ontsmettingsreagens, water en 95% ethanol. Laat het na de laatste spoeling met water drogen.

Spoel de zuiger af met water en gebruik een pluisvrij doekje om schoon te maken met RNase decontaminatiereagens en 95% ethanol. Voeg na het drogen van de buis en zuiger 10% D2O toe aan het NMR-monster. Gebruik een grote pipettip om het RNA-monster over te brengen in de NMR-buis en deze langs de zijkant van de buiswand te laten stromen.

Steek de zuiger in de buis door deze met een snelle draaiende beweging naar beneden te duwen om luchtbellen te verwijderen en trek de zuiger vervolgens langzaam omhoog zonder nieuwe luchtbellen te creëren. En repareer het met paraffinewasfilm. Maak een nieuwe gegevensset op basis van een aromatische protonkoolstof HSQC-gegevensset die wordt gebruikt op volledig gelabelde RNA-monsters voor RNA-toewijzing.

Stel de algemene parameters en RD-specifieke parameters in. Stel vervolgens het protonspinslotvermogen in op 1,2 kilohertz om te testen. Genereer een vd-testlijst met slechts één item, nul milliseconden, stel TDF1 in op één en werk D30 bij om een testspectrum uit te voeren.

Nadat u een vd-testlijst hebt ingesteld, werkt u D30 en TDF1 bij. En plot de intensiteit van de piek voor verschillende spin lock lengtes. Identificeer de draaivergrendelingslengte waarbij de intensiteit van de oorspronkelijke piek afneemt tot een derde.

Maak op het resultaat van de testruns de definitieve vd-lijst die in het experiment moet worden gebruikt. Selecteer het aantal scans zodat de zwakste piek van de lijst een signaal-ruisverhouding van ten minste 10 heeft. De resultaten van verschillende decolletéreacties van tandemtranscripties worden hier weergegeven.

Een 20 nucleotide doel RNA werd gegenereerd in een succesvolle reactie. Mislukte reacties resulteerden in onvolledige en mislukte decolleté van het monster. HPLC-injectie van het RNA-monster onthulde een piek voor pure doel-RNA na 38 minuten.

Terwijl langere en kortere producten goed gescheiden waren van de piek van interesse. Analyse van de RNA-haarspeld toonde aan dat het aantal waargenomen imino-protonen overeenkwam met het aantal imino-protonen dat werd verwacht van een secundaire structuursimulatie. Het proton koolstof HSQC spectrum van de aromatische resonanties van de RNA vertoonde vier signalen na het vouwen.

En slechts drie signalen voor het vouwen. In de vertegenwoordiger op resonantiecurven verkregen voor twee verschillende H8-atomen en twee verschillende synthetische RNA-haarspelden, ervaart de G6H8 bevestigingsuitwisseling. Terwijl de A4H8 dat niet doet.

Voor G6H8 werden de gekleurde spinslotkrachten geselecteerd en werden off resonance-gegevens geregistreerd. In de CG-constructie waar de uitwisseling traag is, vertoonden de R1rho-rijwaarden versus offsetplot al een lichte asymmetrie van de curve, wat het teken van het chemische verschuivingsverschil delta omega aangeeft. Dit wordt nog duidelijker in het R2 plus REX-perceel waar de R1-bijdrage wordt verwijderd.

Aan de andere kant ervaart de GC-constructie snellere uitwisseling en de R1rho-waarden versus offsetplot presenteerden een bredere curve waar de extractie van delta omega zelfs in de R2 plus REX-plot minder duidelijk wordt. Zodra de RNA-dynamiek is opgehelderd, kunnen de toestanden worden gekarakteriseerd en gevangen. Deze gevangen toestanden kunnen bijvoorbeeld worden getest in biologische tests.

Deze methode stelt ons in staat om functionele, relevante basiskoppelingsverschuivingen te observeren in een actief microRNA miRNA-complex, lusherschikkingen in ribosomale RNA en basispaarstabiliteit van op enkele nucleotide-uitstulpingen.