Modelleren van de effecten van hemodynamische stress op circulerende tumorcellen met behulp van een spuit en naald

Dit protocol stelt kankercellen in een suspensie bloot aan korte pulsen van vloeistofschaarspanning om bepaalde aspecten na te bootsen van hoe gemetastaseerde kankercellen worden blootgesteld aan hemodynamische krachten terwijl ze zich in de bloedsomloop bevinden. Het is een relatief eenvoudige techniek om korte pulsen van hoge vloeistofschaarspanning toe te passen. Let bij het proberen van dit protocol op ongeappte naalden en buig ze niet, omdat dit de toegepaste krachtschaarspanning zal veranderen.

Deze procedure kan aërosolen produceren, dus gebruik passende veiligheidsmaatregelen. Laat om te beginnen 70 tot 90% samenvloeiende PC3-cellen uit de weefselkweekschaal vrij door het groeimedium aan te spireren en de schaal van 10 centimeter te wassen met vijf milliliter calcium- en magnesiumvrije PBS. Aspireer vervolgens de PBS en voeg een milliliter van 0,25% trypsine toe.

Observeer na de trypsinisatie de loslating van de cellen onder een omgekeerde microscoop. Om de trypsine te remmen, voegt u vijf milliliter DMEM/F12-medium toe dat 10% FBS bevat. Plaats vervolgens de celsuspensie in een conische buis en bepaal de celconcentratie en het totale celnummer.

Centrifugeer de celsuspensie gedurende drie minuten op 300 x g, aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in een serumvrij weefselkweekmedium. Snijd rond de bodem van 14 milliliter polystyreen buis op de zeven milliliter lijn en plaats de gemengde cel suspensie in de snijbuis. Verzamel afzonderlijk statische controlemonsters van cellen voordat de vloeistofschaarspanning wordt blootgesteld aan gebruik voor het uitvoeren van assays.

Om het resterende celsuspensiemonster bloot te stellen aan vloeistofschuivingsspanning, trekt u de celsuspensie in een spuit van vijf milliliter en bevestigt u een 30 gauge halve inch naald. Plaats en bevestig de spuit met een ongeappte naald op een spuitpomp en stel het debiet in om het gewenste niveau van vloeistofschaarspanning te bereiken. Laat de spuitpomp draaien en verzamel het geschoren monster in de snijbuis onder een hoek van ongeveer 45 graden om schuimvorming te verminderen.

Verwijder de spuit voorzichtig uit de spuitpomp en gebruik een tang om de naald te verwijderen, zorg ervoor dat u deze niet aanraakt. Herhaal de procedure totdat de celsuspensie is blootgesteld aan het gewenste aantal pulsen van vloeistofschaarspanning. Voer levensvatbaarheidstesten uit met de statische monsters voordat u de cellen blootstelt aan vloeistofschaarspanning.

Breng voor enzymatische assays 100 microliter aliquots uit de statische monsters in tweevoud over in een 96-putplaat. Verzamel vervolgens 100 microliters monsters na blootstelling aan vloeistofschaarspanning en plaats ze in een plaat met 96 putten. Voeg 20 microliter van een resazurin-oplossing van 0,15 milligram per milliliter toe aan elk monsterput en aan putten die alleen al 100 microliter medium bevatten.

Incubeer de putplaten in de weefselkweek-incubator van 37 graden Celsius gedurende twee uur, meet vervolgens de fluorescentie en absorptie met behulp van een plaatlezer en verkrijg het percentage levensvatbare cellen door het gemiddelde signaal van elk van de blootgestelde monsters van de vloeistofschaarspanning te vergelijken met het gemiddelde tot het statische controlemonster. Verzamel ook aliquots uit statische monsters om flowcytometrie en clonogene assays uit te voeren zoals beschreven in het teksthandschrift. In de representatieve analyse werd de levensvatbaarheid van syngenetische biopsie borstepitheelkankercellen beoordeeld met behulp van resazurineconversie na het blootstellen van cellen aan een aantal fluid shear stress pulsen.

Hoewel elke cellijn verschillende weerstandsprofielen vertoonde, was er geen significant verschil in levensvatbaarheid na 10 pulsen van blootstelling aan vloeistofschaarspanning. Extra kankercellijnen van verschillende weefseloorsprongen toonden de levensvatbaarheid van meer dan 20% aan na 10 pulsen van vloeistofschaarspanning, met uitzondering van MIA PaCa-2-cellen, die een levensvatbaarheid van minder dan 10% vertoonden als gevolg van gevoeligheid voor mechanische vernietiging door vloeistofschaarspanning. Let er bij het verzamelen van het statische monster voorafgaand aan het aanbrengen van afschuifspanning voor vloeistoffen op dat de celsuspensie homogeen wordt gemengd.

Verwijder de naald voorzichtig met een tang en buig of raak de naald niet aan. Naast het meten van de levensvatbaarheid van cellen, kan men veranderingen in genexpressie, celsignalering, proliferatie en migratie evalueren. Met behulp van dit als een model van blootstelling aan vloeistofschaar stress, kan men zowel bestuderen hoe kankercellen weerstaan vernietiging door vloeistofschaar stress en evalueren van de effecten van vloeistofschaar stress op de biologie van kankercellen.

Deze techniek is gebruikt door ons laboratorium en anderen om de effecten van vloeistofschaarspanning op circulerende tumorcellen te onderzoeken. Deze studies hebben aangetoond dat vloeistofschaarstress snel de mechanische eigenschappen van kankercellen verandert en dat dit bijdraagt aan het vermogen van kankercellen om vernietiging door vloeistofschaarstress te weerstaan.