Het vestigen van stabiele binaire culturen van symbiotische saccharibacteriën uit de mondholte

Saccharibacteriën zijn obligate parasieten die co-kweek met geschikte gastheerbacteriën vereisen. Omdat menselijke orale saccharibacteriën gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd voor de meeste individuen met behulp van bekende gastheerbacteriële soorten. Dit protocol stelt elke onderzoeker of laboratorium in staat om zijn eigen stammen te isoleren in binaire co-cultuur.

Deze techniek maakt gebruik van eenvoudige apparaten en apparatuur die aanwezig zijn in de meeste microbiologische laboratoria en is met succes gebruikt om meer dan 30 isolaten te gekweekt die zes soorten saccharibacteriën vertegenwoordigen. Dit protocol kan nuttig zijn voor de isolatie van andere kandidaat-gevolgde stralingssoorten, evenals saccharibacteriën uit verschillende omgevingen en andere zoogdieren indien geschikte actinobacteriële gastheren kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd. Andrew Collins, een voormalig postdoc in mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Om te beginnen, start culturen van gastheerbacteriën zoals arachnia propionica, met voldoende tijd voor hen om te groeien naar de vroege stationaire fase. Om de cultuur te initiëren, ent u twee tot vijf milliliter tryptische sojabouillon met 0,1% gistextract met arachnia propionica en incubeert u het gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Monteer vervolgens filterhouders met geët geëteerde 0,2 micrometer filtermembranen.

Wikkel ze in folie en steriliseer door autoclaaf, samen met centrifugebuizen en dopassemblages. Steriliseer extra benodigdheden in geval van onopzettelijk contact met niet-steriele oppervlakken. Verzamel tandplak door langs de tandvleeslijn te schrapen, met behulp van een steriel papierpunt, sierlijke curette of een steriele tandenstoker of pipetpunt, en breng het over naar een geschikte buffer zoals MRD of PBS.

Houd het monster op ijs totdat het klaar is om verder te gaan. Resuspend de tandplak krachtig met behulp van een combinatie van vortexing en pipetten met een kleine pipetpunt, voeg vervolgens het geresuspendeerde plaquemonster toe aan een buis met negen milliliter MRD-buffer. Pak een steriele filtereenheid voorzichtig uit met behulp van aseptische techniek.

Draai een kwartslag los en draai de filterhouder opnieuw vast om ervoor te zorgen dat de draden goed zijn ingeschakeld en het apparaat goed is gesloten. Was het membraan door 10 milliliter MRD-buffer door het apparaat te laten gaan met behulp van een spuit. Als u het monster op het gewassen filter wilt aanbrengen, verwijdert u de zuiger uit een spuit en bevestigt u deze aan het filterapparaat.

Plaats een steriele centrifugebuis onder dat filterapparaat om het filtraat op te vangen, giet vervolgens het gedispergeerde tandmonster in de spuit en laad het op het filter. Oefen vervolgens lichte druk uit op de zuiger om het monster door het filter te duwen. Was het membraan met nog eens 10 milliliter MRD-buffer en verzamel de stroom in dezelfde buis als het gefilterde monster.

Sluit vervolgens de buis aseptisch af en blijf op ijs. Maak een oriëntatiemarkering op de buis en dop om de locatie van de celpellet na centrifugeren te identificeren. Plaats de buis in een hogesnelheidscentrifuge met de markering aan de bovenzijde en centrifugeer de monsters gedurende een uur op 60.000 G bij vier graden Celsius.

Giet na het centrifugeren het supernatant voorzichtig uit en houd de pellet aan de bovenkant van de buis. Vervolgens resuspend de pellet in een tot twee milliliter MRD buffer door krachtig vortexen. Bereid kweekbuizen voor door twee milliliter geschikte groeimedia in de buizen te stoppen.

Voeg vervolgens 200 microliter nachtkweek van gastheerorganismen en 100 tot 200 microliter geresuspendeerd gefilterd monster toe aan elke buis. Incubeer de gecombineerde monsters onder omstandigheden die geschikt zijn voor het gastheerorganisme. Door voer de cellen om de twee tot drie dagen door 200 microliter van de binaire cultuur over te brengen naar twee milliliter vers groeimedium in een nieuwe buis.

Als de doorgepasseerde culturen geen groei vertonen bij 200 microliters van niet-geïnfecteerde gastheercultuur, bij het passeren van de cellen, keer dan ingeënte buizen terug naar de incubator. Aliquote 24 microliter van de PCR master mix in een 0,2 milliliter PCR buis. Plaats de buis bij één microliter met saccharibacteriën geïnfecteerde cultuur in een thermocyclus.

Stel het PCR-programma in zoals beschreven in het teksthandschrift. Laad en voer de PCR-producten uit op een 1%Agros gel. Een band van ongeveer 600 bases zal de aanwezigheid van saccharibacteriën bevestigen.

Om de zuiverheid van positieve culturen te bevestigen, voert u een 10-voudige seriële verdunning van de co-cultuur van saccharibacteriën uit in een steriele buffer en verspreidt u 100 microliters op een agarplaat. Incubeer de kweek onder geschikte groeiomstandigheden en let op besmette organismen. Een band van ongeveer 600 bases zal de aanwezigheid van saccharibacteriën bevestigen.

PCR-detectie kan negatief lijken in initiële infectieculturen als gevolg van een laag aantal saccharibacteriënysymbionts. Na een paar passages moet echter een sterk PCR-product verschijnen, wat aangeeft dat er een stabiele infectie is opgetreden. Het testen van verschillende gastheersoorten met hetzelfde saccharibacteriënfiltraat zal meestal een laag slagingspercentage hebben.

Omdat de symbiont gastheer interactie is zeer specifiek. Naarmate de geïnfecteerde culturen groeien, moet normale troebele groei verschijnen. Naarmate de symbiose zich vestigt, zullen geïnfecteerde culturen minder troebel lijken dan culturen van niet-geïnfecteerde gastheerorganismen.

Een besmette cultuur kan worden gezuiverd door geïnfecteerde kolonies te plukken na het plateren. Geïnfecteerde kolonies kunnen soms worden geïdentificeerd door een onregelmatige kolonievorm in vergelijking met niet-geïnfecteerde kolonies. Het aandeel van een regelmatige kolonie hangt af van de titer van saccharibacteriën in de binaire cultuur.

Als de titer laag is, zullen minder kolonies onregelmatig lijken, waardoor het gemakkelijk is om de geïnfecteerde kolonies te kiezen en een pure binaire cultuur te starten. Culturen lijken mogelijk niet positief voor verschillende passages. Dus sommige patiënten zullen nodig zijn.

Het is ook noodzakelijk om regelmatig te controleren op besmetting van binaire culturen, omdat dit de cultuur kan destabiliseren en kan leiden tot de dood van de saccharibacteriën. De binaire cultuur kan worden gebruikt voor allerlei laboratoriumexperimenten. DNA en RNA kunnen worden geëxtraheerd voor respectievelijk genoomsequencing en transcriptoomanalyse.

Pathogeniteit kan ook worden onderzocht met behulp van diermodellen.