Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Voor zover wij weten, is dit het eerste voorbeeld van een op kralen gebaseerd multiplexingprotocol dat twee reportersignalen gebruikt om tegelijkertijd twee resultaten per analyt te meten. Met deze techniek kan de gebruiker antigeenspecifieke IgM en IgG tegelijkertijd meten, met minder monster en een kortere tijd tot resultaten. Hoewel deze dual reporter-methode specifiek is voor antilichaamisotyping, kan deze worden aangepast om andere analytparen te meten, zoals post-translationele modificaties of vrije versus gebonden medicijnvormen.

Vandaag demonstreren we onze procedure met Dr. Steve Angeloni, een senior field application scientist voor Luminex Corporation. Om te beginnen met de serologische test van dual reporter IgG en IgM, bereidt u de vereiste multiplexkraalmengsels van de individuele paarkraal en controleert u de kraalvoorraden in een concentratie van één keer 10 tot de zes kralen per milliliter. Verdun vervolgens de serummonsters 100-voudig door 10 microliter serum toe te voegen aan 990 microliter PBS-TBN-buffer en verdun de monsters vervolgens nog eens tienvoudig door 20 microliter van de 1:100 verdunning toe te voegen aan 180 microliter PBS-TBN.

Wanneer de kralenmengsels en serummonsters klaar zijn, voegt u 50 microliter van de multiplexkraalmengsels toe aan de toegewezen putjes van een 96-well niet-bindende microtiterplaat en voegt u vervolgens 50 microliter van de verdunde serummonsters toe aan de juiste putjes. Zodra alle monsters zijn toegevoegd, bedekt u de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeert u gedurende 15 minuten op een verwarmde platenschudder bij 37 graden Celsius. Scheid vervolgens de kralen van het reactiemengsel door de plaat gedurende twee minuten op een magnetische platenscheider te plaatsen.

Houd de plaat op de magneet, verwijder de folieafdichting. Keer vervolgens de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veeg het supernatant voorzichtig uit de putten. Terwijl u de plaat nog steeds op de magneet houdt, dep u de plaat op absorberend papier.

Om de reactieputten te wassen, verwijdert u de plaat van de plaatmagneet en voegt u 150 microliter PBS-TBN toe aan elke put. Bedek de plaat met een verse folieafdichting en incubeer gedurende twee minuten op de verwarmde shaker voordat u deze nog twee minuten terug op de plaatmagneet plaatst. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, keert u de plaat om om het supernatant weg te gooien en det u de plaat op absorberend papier.

Verwijder na de tweede PBS-TBN-was de plaat van de magneet en voeg 100 microliter vers detectiereagensmengsel toe aan elke put. Nadat u de plaat hebt bedekt met een microplaatfolieafdichting, plaatst u deze gedurende 15 minuten op een verwarmde platenschudder en vervolgens gedurende twee minuten op een magnetische platenscheider. Terwijl de plaat op de magneet zit, gooit u het detectiereagensmengsel weg door de plaat om te keren over een afvalcontainer en deze op absorberend papier te devlekken.

Was de reactieputten met PBS-TBN tweemaal zoals eerder aangetoond en verwijder vervolgens de plaat van de magneet. Voeg 100 microliter PBS-TBN toe aan elke put, bedek de plaat met folieafdichting en schud gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder de folieafdichting en ga verder met het aflezen van 50 microliter van het monster uit elke put in de stroomanalysator.

Als u de plaat wilt lezen, selecteert u het vervolgkeuzemenu in de linkerbovenhoek, navigeert u naar Plaatconfiguratie, laadt u de eerder geconfigureerde plaat en selecteert u Plaat uitvoeren. Werp de plaatdrager uit door het pictogram Uitwerpen te selecteren, laad de plaat vervolgens op de plaatdrager en selecteer het pictogram Intrekken om de plaatdrager in te trekken. Zodra de plaatdrager zich in de analyzer heeft uitgestrekken, selecteert u het pictogram Uitvoeren om de plaat te lezen.

Voeg voor de dual reporter neutralisatietest 50 microliter van de multiplexkraalmengsels toe aan toegewezen putten van een niet-bindende microtiterplaat met 96 putten, voeg vervolgens 25 microliter van twee microgram per milliliter ACE2 toe aan elke put en bedekt de plaat met een folieafdichting. Voeg na een incubatie van twee minuten op een verwarmde platenschudder 25 microliter van 1:500 serumverdunningen toe aan de toegewezen putjes. Zodra alle monsters zijn toegevoegd, voert u de incubatie-, was-, detectie- en analysestappen uit zoals eerder aangetoond voor de serologische test.

Een test van anti-IgM geconjugeerd aan de DyLight 405 reporter kleurstof met behulp van serummonsters binnen vijf tot 60 dagen na het begin van de symptomen en een IgG strip serummonster produceerde geen hoog signaal voor het spike-antigeen. Voor monsters met een hoge IgM-gemiddelde fluorescentie-intensiteit werden de hoogste signalen gezien voor het receptorbindende domein en nucleocapside antigenen. Hoewel de IgM-titer in sommige monsters verhoogd had moeten zijn, waren de waargenomen intensiteitsniveaus van gemiddelde fluorescentie niet hoger dan 140 MFI-eenheden.

Bovendien ontbrak het de controlekraal voor IgM aan een significant dynamisch bereik voor de mediane fluorescentie-intensiteit bij gebruik van DyLight 405 geconjugeerd aan anti-IgM in vergelijking met een fycoerythrin met het label anti-IgM in dezelfde concentratie. Voor IgG-detectie had het briljante violette conjugaat hogere mediane fluorescentie-intensiteitssignalen dan het streptavidin-conjugaat van fluorfore Super Bright 436. De signaalintensiteit voor het briljante violette geconjugeerde varieerde echter over de ACE2-titraties.

Deze signaalfluctuatie door het briljante violette geconjugeerde over ACE2-concentraties interfereerde ook met het bepalen van de procentuele remming door ACE2 over het bereik van IgG-titers. Voor IgM-detectie vertoonde het fycoerythrin anti-IgM hogere signalen dan die gegenereerd door DyLight 549 anti-humaan IgM. Bij het bepalen van ACE2 procent remming van IgM binding, was er een klein maar onbeduidend verschil tussen de twee IgM detectiereagentia.

Dus een van de belangrijkste stappen in de procedure is om uw multiplexkraalmix van uw individuele kralenvoorraden te bereiden en ervoor te zorgen dat u dat correct doet. Deze procedure kan dus ook worden gebruikt om de werkzaamheid van vaccins te meten en de immuunresponsen op andere pathogenen te monitoren.