Moleculaire veerconstante analyse door biomembrane force probe spectroscopie
20 november 2021
Een biomembrane force probe (BFP) is een in situ dynamic force spectroscopy (DFS) techniek. BFP kan worden gebruikt om de veerconstante van moleculaire interacties op levende cellen te meten. Dit protocol presenteert veerconstante analyse voor moleculaire bindingen gedetecteerd door BFP.
Deze video beschrijft stapsgewijze procedures voor het gebruik van Biomembrane Force Probe of BFP om de moleculaire veerconstante te meten. In krachtsonde is BFP onlangs opgedoken in het inheemse celoppervlak of in SITU Dynamic Force Spectroscopie-analyse. Het belangrijkste doel van deze techniek is het meten van single molecule binding genetica.
Deze data-analyseprocedure is een eenvoudige maar krachtige boodschap en levert mechanische informatie op, met name de dynamische kracht en ontsteking van het celmembraan dat moleculen tot expressie brengen. Tijdens de BFP-experimentcyclus kan het microbioom van de sonde met de rode bloedcel en probate, de doelcel en de moleculaire binding van de ligandreceptor tussen de sonde en het doelwit worden beschouwd als een serie verbonden hersensysteem. Op basis van de wet van Hooke is de reciproke van de totale veerconstante van een reeksgeschakeld veersysteem gelijk aan de som van de inverse veerconstante van elke afzonderlijke component, zoals de vergelijking laat zien.
De veerconstante van rode bloedcellen wordt berekend op basis van gebeurtenissenbeweging, die afhankelijk is van de radiaal van de sondemicropipette in de opening. De rode bloedcel, het cirkelvormige contactgebied tussen de rode bloedcel en de probate en de micropipet aspiraterende druk. De BFP-weggegevens worden verkregen door een zelfgemaakt virtueel instrument voor linkse weergave, dat de beweging van de doelmicropipet regelt door een PA-vertaler.
Een volledige PFP-aanraakcyclus bestaat uit vijf fasen. Approach.Impinge.Contact. Intrekken en dissociëren. In het begin wordt de Robusto APICS-positie aangeduid als X is gelijk aan 0 in zwarte deshine.
Het doelwit wordt vervolgens aangedreven door een stuk of vertaler om de robusto te impeneren en te comprimeren om negatieve probate beweging te veroorzaken. Je notult het als X kleiner dan nul in rode streepjeslijn. In de retract-fase gaat de rode busto-apex van de X kleiner dan nul-positie terug naar de X gelijk aan nulpositie, aangeduid als de compressiefase.
Als er een binding wordt gevormd tussen het ligandreceptormolecuulcomplex, zou de rode bloedcel verder verschillen van andere positieve richtingen. Deze X-periode groter dan nul wordt de trekfase van de terugtrekkingsfase genoemd. De terugtrekkingsfase is het meest kritieke deel om de veerconstante van het molecuul van binding te bepalen.
Verzamel kracht versus tijd weggegevens met behulp van het BSP-data-acquisitieplatform. Elke experiment registreert meestal 50 tot 200 aanraakcycli, Open de PFP-gegevensanalysesoftware. Klik op het gele mappictogram en selecteer het bijbehorende rijgegevensbestand door erop te dubbelklikken.
We staan op het programma. Klik vervolgens op de pijlknoppen omhoog en omlaag om tussen gebeurtenissen te schakelen. De uitsluitingscriteria voor uitschieters gebruiken om ongeldige gebeurtenissen uit te schermen.
Selecteer het exporterende gegevenstype dat wordt gedwongen om tijd op te maken en kies het juiste tijdsbereik. Klik op de knop Plotgegevens exporteren. De geëxporteerde gegevens worden standaard opgeslagen als tekstbestand.
Dit tekstbestand bevat twee kolommen met gegevens. Het is de eerste kolom die de tijd daddies vertegenwoordigt en de tweede kolom die de overeenkomstige kracht op elk tijdstip vertegenwoordigt. Plot de kracht versus tijd curve met behulp van spreadsheets software om de geforceerde versus verplaatsing curve te verkrijgen.
Vermenigvuldig de tijdswaarde van elk gegevenspunt met de PSO-beweging van Willow Steel. Nul het eerste gegevenspunt door de kleinste verplaatsingswaarde van elk gegevenspunt af te trekken. Deze horizontale transformatie heeft geen invloed op de daaropvolgende berekening van de veerconstante.
In de kracht versus verplaatsingscurve verschilden twee verschillende actorgroepen als de nieuwe krachthelling kan worden geïdentificeerd. Elk vertegenwoordigt de compressiefase en de 10-stijlfase. Pas een regressielijn toe aan elke gegevensgroep.
De lijn met steilere helling vertegenwoordigt de totale veerconstante bij een compressorfase aangeduid als K1. En de lijn die het kleinst was, vertegenwoordigt de lijn in deze 10-stijlfase, aangeduid als K2.As die ik heb genoemd, de totale veerconstante is de reciproke van de zoon van de serieveerconstante van elk onderdeel. Tijdens de drukfase van de beat-to-cell-modus wordt de moleculaire binding niet uitgerekt, daarom wordt de moleculaire bindingsveerconstante niet in aanmerking genomen. De veerconstante van de doelcel wordt beschreven als de weergegeven vergelijking waarbij K1 de totale veerconstante tijdens de compressorfase vertegenwoordigt.
In de 10-stijlfase van de beat to sell-modus is de totale veerconstante de zon van de uverse veerconstante van de moleculaire binding van rode bloedcellen. En de doelcel, gebruik de weergegeven vergelijking om de molecuulbindingsveerconstante te berekenen, die K2 de totale veerconstante vertegenwoordigt. Je leest de 10 stop fase.
In de beat to beat-modus, aangezien B-vervorming verwaarloosbaar is, benadert de term die de inverse van de doelcelveerconstante beschrijft nul, daarom is de totale veerconstante in de compressorfase gelijk aan de veerconstante van rode bloedcellen die als de volgende vergelijking wordt weergegeven. In de trekfase kan de veerconstante van de moleculaire binding worden berekend door het effect van de rode bloedcel af te trekken als de volgende vergelijking. Verzamel veerconstanten van de zijwind integrerende houding B, Beta 3-complex, de K562-cel en de Febrifugine-integrerende houding B Beta drie complex, bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de afgeleide veerconstanten op pick een Newton- of nanometerschaal.
Nu zou u een beter begrip moeten hebben van wat de vereisten zijn voor het meten en de veerconstante uit de VFD-gegevens. De verschillen tussen de beat to cell-modus en de beat-to-beat-modus moeten worden opgemerkt. Verschillende molecuul presenterende dienst zal verschillende afweer hebben voor de maat van de veerconstante.
Kortom, deze stapsgewijze procedure beschrijft hoe moleculaire veerconstanteanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van BFP. We voorzien dat er in de toekomst inspanningen zullen worden geleverd om de BFP-gegevensverzameling en DFS-analyse te automatiseren en te integreren in één computerrustprogramma. Het maken van de gehele BFP operatie data analyse gebruiksvriendelijker en high throughout.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De Biomembrane Force Probe (BFP) is een dynamische krachtspectroscopietechniek die wordt gebruikt om de veerconstante van moleculaire interacties op levende cellen te meten. Dit protocol beschrijft de analyse van veerconstanten voor moleculaire bindingen die door BFP worden gedetecteerd.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Dynamische krachtspectroscopie
- Moleculaire interacties
- Celmembraanmechanica
Achtergrond
- De BFP-techniek meet binding van enkele moleculen.
- Het geeft mechanische informatie over celmembranen.
- De analyse is gebaseerd op de wet van Hooke.
- Het betreft interacties tussen sondes en doelcellen.
Doel van het onderzoek
- Om moleculaire veerconstanten te meten.
- Om moleculaire bindingsdynamiek te analyseren.
- Om het begrip van celmembraaninteracties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van Biomembrane Force Probe (BFP).
- In situ dynamische krachtspectroscopie-analyse.
- Gegevensanalyse van moleculaire interacties.
- Toepassing van de wet van Hooke voor berekening van de veerconstante.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van moleculaire veerconstanten.
- Inzichten in de dynamiek van moleculaire bindingen.
- Demonstratie van de effectiviteit van BFP in levende celanalyse.
- Validatie van theoretische modellen door experimentele gegevens.
Conclusies
- BFP is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van moleculaire interacties.
- De techniek verbetert ons begrip van celmechanica.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere biologische studies omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Measuring molecular spring constants via biomembrane force probe spectroscopy provides quantitative mechanical insights into ligand-receptor interactions, supporting target validation by characterizing bond stability and conformational dynamics. This approach enables mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular mechanics to functional signaling, informing go/no-go decisions before compound screening. The method enhances predictive confidence in target selection by revealing force-dependent binding behaviors that correlate with physiological mechanosensing pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying bond stiffness and rupture forces under physiological loading rates.
- Operational Value: Enables direct comparison of molecular variants or mutants to identify stabilizing mutations that prolong bond lifetime.
- Scientific Value: Clarifies force-dependent conformational changes in receptors, supporting allosteric mechanism validation.
- Operational Value: Provides benchmark data for structure-guided design of therapeutics with optimized mechanical resilience.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-displacement curves that serve as orthogonal readouts for binding affinity in assay triage.
- Operational Value: Standardizes spring constant measurements across replicates using outlier exclusion criteria and regression fitting.
- Scientific Value: Distinguishes specific from nonspecific interactions based on tensile phase slope characteristics in bead-bead mode.
- Operational Value: Enables high-throughput collection of 50-200 touch cycles per experiment for robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular spring constants to cellular mechanosensing outputs, informing pathophysiological relevance in disease models.
- Operational Value: Supports continuity from purified systems to native cell surfaces via bead-cell and bead-bead modes.
- Scientific Value: Measures cell contribution to total spring constant, deconvolving target-specific molecular mechanics from probe or cell artifacts.
- Operational Value: Facilitates cross-platform comparison of molecular mechanics using standardized Hooke's law-based analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanical phenotyping of targets after initial binding confirmation but before large-scale screening, helping prioritize targets with favorable force-stability profiles.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring how molecular bonds respond to mechanical perturbation, revealing catch-bond or slip-bond behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spring constant outputs that enable rank-ordering of ligand variants or therapeutic candidates.
- Analytics: Employs linear regression on force-displacement data to derive spring constants (K1, K2) from compressive and tensile phases, enabling condition comparison.
- Translational Research: Links molecular mechanics to cell-scale responses by measuring target cell contribution in bead-cell mode, supporting mechanistic continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nanotool for mechanical phenotyping across diverse receptor-ligand systems, reducing revalidation effort in follow-up campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, quantitative measures of bond elasticity and force-dependent kinetics.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized data acquisition, outlier filtering, and exportable force-time datasets for external validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying mechanically fragile targets early, reducing investment in high-risk pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on bond stability metrics, complementing traditional affinity and selectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dynamic force spectroscopy, micropipette manipulation, and force calibration using red blood cell standards.
- Depends on custom-built BFP setup with piezoelectric translators and homemade virtual instrumentation for precise displacement control.
- Necessitates cross-team standardization of outlier criteria, time-range selection, and regression fitting protocols across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-cell to bead-bead mode to isolate molecular contributions from cellular mechanics.
- Limited by the need for stable molecular tethering and functional ligand-receptor expression on probe or target surfaces to avoid artifactual signals.
