Controle van celgeometrie door infrarood laserondersteunde micropatterning

Micropatterning is een krachtige techniek die door wetenschappers wordt gebruikt om verbanden tussen celvorm en de activiteit van intercellulaire machines te begrijpen. Hoewel verschillende technieken onderzoekers in staat stellen om de celvorm te moduleren, vereisen deze technieken vaak gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk is voor sommige biologielaboratoria. Deze video begeleidt u door de stappen die nodig zijn om micropatterning te automatiseren op een in de handel verkrijgbaar multifoton imaging-systeem.

Een voordeel van dit protocol is dat het het gebruik van gespecialiseerde apparatuur vermijdt. Patronen kunnen ook gemakkelijk worden gewijzigd zonder fotomaskers te verfijnen, wat meestal het meest tijdrovende proces is bij micropatterning. Onze beeldverwerkingstool genereert gemiddelde celafbeeldingen die een representatieve verdeling van eiwitten op een onbevooroordete en geautomatiseerde manier weerspiegelen.

Hoewel we coverslips gebruiken in onze experimenten, kunt u met de geautomatiseerde workflow ook patronen maken op dia's en borden met glazen bodem. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat een goede microscoopopstelling van cruciaal belang is voor het systeem om het juiste brandpuntsvlak en patroon op een geautomatiseerde manier in beeld te brengen. Bereid de PVA-oplossing volgens de instructies voor.

Voeg een deel HCL toe aan acht delen PVA. Draai de buis een paar keer voorzichtig om om te mengen. Giet twee milliliter van de oplossing in een kleine Petrischaal en dompel een schone voorbewerkte deksellip in de vloeistof.

Incubeer vijf minuten op kamertemperatuur op een shaker. Verwijder voorzichtig de afdeklip van de oplossing. Gebruik de coverslip spinner om de vacht 40 seconden te draaien.

Maak ondertussen het pincet schoon. Breng de afdeklip over in een doos en droog 's nachts op vier graden. Zet de microscoopsoftware aan.

Stel eerst de laserlijn in op 750 nanometer. Stel vervolgens een nieuwe optische configuratie in met de naam Image. Dit is de optische basisconfiguratie die ons in staat stelt om de coverslip door reflecties te beelden.

Laat andere opties standaard staan en selecteer de juiste doelstelling. Configureer de hardware-instellingen onder deze optische configuratie. Stel de infraroodlaser in als onze stimulatielaser.

Plaats de bundelsplitser in het lichtpad om de IR-laser te gebruiken voor beeldvorming. Selecteer de Galvano scanner unit en de juiste D scan detector. Selecteer een scangrootte en verblijftijd die voldoende is om kleine objecten op de coverslip vast te leggen.

Zorg ervoor dat de optie IR-laser gebruiken is ingeschakeld. Pas het laservermogen en de detectorgevoeligheid aan om een helder, maar niet verzadigd beeld van het coverslipoppervlak te verkrijgen. Stel in het venster scangebied zoom in op één om het hele gezichtsveld vast te leggen.

Sla de optische configuratie op. Nu zullen we een reeks optische configuraties opzetten waarmee de microscoop zich kan concentreren, het ROI-masker kan laden en patronen op een geautomatiseerde manier kan genereren. De eerste optische configuratie stelt ons in staat om een fiduciaire marker af te drukken die wordt gebruikt om automatisch scherp te stellen op het huidige gezichtsveld.

Dupliceer de optische configuratie van de afbeelding en wijzig de naam ervan, Fiduciaire markering afdrukken. Aangezien we in deze stap afdrukken, verplaatst u de straalsplijter uit het lichtpad en vervangt u deze door een geschikte dichroïsche spiegel. Selecteer de kleinste scangrootte om tijd te besparen.

Aangezien er in deze stap geen beeldvorming vereist is, stelt u de detectorgevoeligheid in op nul. Verhoog de laserkracht om afdrukken mogelijk te maken. Stel in het venster scangebied zoom in op maximum en plaats het scangebied in het midden van het gezichtsveld.

Nu zullen we een Z-stack experiment opzetten om eventuele oneffenheden in het PVA-oppervlak te verklaren. Stel de beweging in op de Z-positie ten opzichte van relatief. Selecteer het juiste Z-apparaat.

Dupliceer vervolgens de optische configuratie van de afbeelding en wijzig de naam ervan, Autofocus automatisch. Selecteer de kleinste scangrootte en verlaag de zoomfactor in het scangebiedvenster, zodat het gezichtsveld iets groter is dan de fiduciaire markering. Dit zorgt ervoor dat andere kleine functies op de coverslip de autofocus niet verstoren.

Selecteer Automatisch scherpstellen in het menu Apparaten. Stel de scandikte in op die in het Z-stack experiment. De microscoop scant door dit bereik en vindt het beste brandpuntsvlak met behulp van de fiduciaire marker.

Dupliceer vervolgens de optische configuratie van de afbeelding en wijzig de naam ervan, ROI laden. Stel de scangrootte in die identiek is aan die van het ROI-masker, omdat het masker wordt geladen op een afbeelding die met deze optische configuratie is gemaakt. We gebruikten 2048 pixels om een optimale balans te bereiken tussen resolutie en snelheid.

Nu zullen we de optische configuratie instellen die wordt gebruikt om de coverslip te patroon. Dupliceer de optische configuratie van de afdrukfiduciaire markering en hernoem deze, Micropattern. Stel zoomfactor in op één.

Verhoog het stimulatielaservermogen om PVA te ablate. Selecteer een geschikte scansnelheid. Stel in het ND-stimulatievenster een ND-stimulatie-experiment in.

Voeg een paar fasen toe aan het tijdschema en stel elk in op stimulatie. Zorg ervoor dat het stimulatiegebied en de duur correct zijn. Schakel in hetzelfde venster de functie faseverplaatsing hoofd Z in voor elke fase.

Dit verklaart opnieuw eventuele afwijkingen in de Z-richting. Stel ten slotte een optische configuratie in om een zichtbaar label op de coverslip te maken dat ons kan helpen de patronen te lokaliseren. Dubbele afdrukfiduciaire markering en hernoem deze, labeloppervlak.

Verhoog het laservermogen aanzienlijk en stel zoom in op één. Breng de PVA-gecoate afdeklip over op een houder. Voor een rechtopstaande microscoop moet u ervoor zorgen dat het PVA-oppervlak naar beneden is.

Voeg water toe aan de hoeken om de afdeklip te stabiliseren. Monteer de houder op het microscooppodium. Verlaag het doel en voeg daartussen water toe.

Schakel in de microscoopsoftware de IR-lasersluiter in en voer automatische uitlijning uit voorafgaand aan het patroon. Overschakelen naar de optische configuratie van de afbeelding. Scan het gezichtsveld terwijl u het doel langzaam dichter bij de coverslip beweegt.

In het begin zal het beeld extreem zwak lijken. Plaats het objectief dichter bij de coverslip totdat de helderheid van het beeld iets toeneemt. Dit is het afdeklipoppervlak dat naar het doel is gericht.

Blijf het doel verplaatsen totdat de helderheid afneemt en weer toeneemt. Dit is het PVA-oppervlak dat we zullen patroon. Concentreer u op elk klein kenmerk, zoals onvolkomenheden of stof, en stel nul in op de Z-schijf.

Schakel over naar de optische configuratie van het labeloppervlak. Klik op Capture. Ga terug naar beeldvorming en scan.

Glasschade toont aan dat het etiket succesvol is bedrukt. Verplaats het werkgebied met één tot twee gezichtsvelden om glasdeeltjes te voorkomen. Scan om te bevestigen.

Open in het menu apparaten de macro voor fasebeweging. Stel de variabelen M en N in op het gewenste aantal weergavenveld dat wordt gevormd. Sla de macro op en voer deze uit.

Nadat de patroons zijn voltooid, schakelt u over naar de optische configuratie van de afbeelding en scant u door de patronen. Patrooneilanden in elk gezichtsveld moeten duidelijke grenzen hebben en licht gelijkmatig reflecteren. Patronen die donkerder en ongelijk lijken suggereren onvolledige PVA-verwijdering.

Dit komt meestal door onvoldoende laservermogen of onjuist brandpuntsvlak. Als het laservermogen te hoog is ingesteld, kan dit er ook voor zorgen dat de PVA gaat borrelen. Na het plateren van cellen op coverslips, moeten cellen zich verspreiden en de vorm van het patroon aannemen.

Dit is een immunofluorescentiebeeld van een menselijke fibroblast die op een kruisboogpatroon wordt geplateerd. De cel toont een actinerijke rand van lamellipodia. Dikke, ventrale spanningsvezels langs de twee zijden en dorsale stressvezels verbonden door dwarsbogen.

Myosine lichtketting zat achter de dichte lamellipodia rand en vertoonde een gerigeerd patroon langs actine bundels. Met behulp van onze aangepaste beeldverwerkingstool genereerden we een gemiddeld beeld van onze eiwitten van belang. Deze afbeelding laat zien dat de hierboven beschreven actinestructuren consistent zijn over een groot aantal patronen.

Hoewel we individuele structuren van myosine verliezen na middeling, is de lokalisatie langs actinebundels behouden. Na het bekijken van deze video zou u een micropatroonworkflow moeten kunnen instellen met behulp van een commercieel beschikbaar multifotonsysteem met minimaal handmatig werk. Het is belangrijk om het laservermogen voor uw eigen systeem te optimaliseren om onvolledige patronen te voorkomen of PVA Maximale efficiëntie kan worden bereikt door de parameters in autofocus- en micropatterningstappen aan te passen.

Naast het onderzoeken van cellulaire trajecten met celmorfologie, kan deze techniek ook worden toegepast op geneesmiddelenscreening en andere toepassingen die gevoelig zijn voor variaties in celvorm.