Name: In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer hoe menselijke tandheelkundige pulpstamcellen in vitro worden geïnduceerd tot insulineproducerende cellen via integratieve en niet-integratieve protocollen. Deze methode ondersteunt regeneratieve therapieën voor diabetes type I.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SK, WR en QDL werden ondersteund door de Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO en PP werden ondersteund door Chulalongkorn Academic Advancement in Its 2nd Century Project. CS werd ondersteund door een onderzoeksondersteunende subsidie van de Faculteit Diergeneeskunde, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University en Government Research Fund.

Dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee, Faculteit Tandheelkunde, Chulalongkorn University. Menselijke DPC's (hDPSCs) werden geïsoleerd uit menselijke tandpulpweefsels die werden geëxtraheerd uit zowel premolaren als kiezen als gevolg van problemen met verstandskiezen. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten volgens een goedgekeurd protocol (HREC-DCU 2018/054).
1. Integratief inductieprotocol
<ol><li>Voorbereiding van lentiviral vector die PDX1 draagt
	<ol>
<li>Gebruik humane embryonale nier (HEK) 293FT cellen voor virale verpakking. Kweek en onderhoud deze cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine en 1% Antibiotic-Antimycoticum.</li>
		<li>Genereer PDX1-lentivirusvectoren door co-transfectie van 10 μg elk van de verpakking en envelopplasmiden en 20 μg van het beoogde genplasmide in HEK293FT-cellen met behulp van calciumfosfaattransfectiesysteem, bijvoorbeeld psPAX2, pMD2. G, en menselijke pWPT-PDX111. Zorg ervoor dat de cellen 80%-90% samenvloeien tijdens de tijd van infectie.</li>
		<li>Verzamel het medium dat lentivirale deeltjes bevat op 48 en 72 uur na transfectie.</li>
		<li>Filtreer het verzamelde medium door een filter van 0,45 μm; concentreer de virussen met een centrifugaalfilter bij 100 kDa nominale moleculaire gewichtsafsnijding (NMWCO).</li>
	</ol></li>
	<li>PDX1 overexpressie<ol>
<li>Gebruik passage 3-5 hDPSC die 70-80% samenvloeiend zijn. Probeer de cellen te verkleinen en te tellen met behulp van een celteller. Zaai 1 x 106 hDPSC's op een met weefselkweek behandelde schaal van 60 mm en incubeer 's nachts.</li>
		<li>Voeg 24 uur later verse virusdeeltjes toe die zijn verkregen uit stap 1.1.4 om voorbehandelde cellen van polybreen (4 μg/ml polybreen, 30 min onder 37 °C en 5% CO2)bij de gewenste vermenigvuldigende infectie (MOI) over te brengen. In dit geval is MOI bijvoorbeeld 20. Houd de cellen in de celkweek-incubator gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.</li>
		<li>Gooi na de infectieperiode van 24 uur het medium met virale deeltjes weg. Voeg verse kweekmedia toe en blijf de cellen 48 uur laten groeien. Alle culturen worden onderhouden op 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Controleer de geaggregeerde morfologie van de getransfecteerde cellen voordat u doorgaat naar de inductiestap. PDX1-transductie wordt bevestigd door genexpressieanalyse (Aanvullende figuur 1). OPMERKING: Controleer de celmorfologie onder een microscoop voordat u doorgaat met de volgende stappen.</li>
		<li>Oogst en ga verder met een inductieprotocol in drie stappen (stap 1.3) als een micromilieu-inductiebenadering.</li>
	</ol></li>
	<li>Inductieprotocol in drie stappen OPMERKING: Het inductieprotocol in drie stappen resulteerde in de reeks pancreasdifferentiatie van hDPSC's naar respectievelijk definitief endoderm, pancreasendoderm/endocriene en pancreas bètacellen/IPC's met behulp van serumvrij medium (SFM)-A, SFM-B en SFM-C.<ol>
<li>Gooi het kweekmedium weg en was vervolgens de transduceerde hDPSC's met 1x fosfaatgebufferde oplossing (PBS).</li>
		<li>Voeg 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende 1 min bij 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Voeg het kweekmedium toe om de trypsineactiviteit te stoppen en spoel de cellen voorzichtig door om de suspensie met één cel te krijgen. Tel de cellen en aliquot 1 x 106 cellen in elke verzamelbuis.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 468 x g (relatieve centrifugaalkracht: RCF), 4 °C, gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en bewaar de celkorrel.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 3 ml van het eerste pancreasinductiemedium, d.w.z. serumvrij medium (SFM)-A. Zaai de cellen op een cultuurplaat met lage aanhechting (60 mm). Houd de cellen 3 dagen op 37 °C en 5% CO2. OPMERKING: Observeer de morfologie van cellen onder een omgekeerde microscoop voordat u doorgaat naar de volgende stap.</li>
		<li>Verwijder SFM-A en voeg 3 ml van het tweede inductiemedium toe, d.w.z. SFM-B. Houd de cellen de komende 2 dagen op 37 °C, 5% CO2. OPMERKING: Observeer de morfologie van cellen onder een omgekeerde microscoop voordat u doorgaat naar de volgende stap.</li>
		<li>Verwijder SFM-B en voeg 3 ml van het derde inductiemedium toe, d.w.z. SFM-C. Houd de cellen de komende 5 dagen in een celkweek-incubator die op 37 °C wordt gehouden met 5% CO2. Verander het medium om de 48 uur. Observeer hun morfologie na 5 dagen. OPMERKING: Elk inductiemedium wordt aangevuld met verschillende reagentia zoals beschreven; SFM-A: 1% runderserumalbumine (BSA), 1x insuline-transferrine-selenium (ITS), 4 nM activine A, 1 nM natrium butyraat en 50 μM bèta-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS en 0,3 mM taurine; en SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurine, 100 nM glucagon-achtig peptide (GLP)-1, 1 mM nicotinamide en 1x niet-essentiële aminozuren (NEAAs).</li>
		<li>Zorg ervoor dat u de celmorfologie na elke stap onder een omgekeerde microscoop controleert. De cellen zullen meer geaggregeerd worden en als kolonies drijven.</li>
		<li>Verzamel celkolonies voor verdere analyse. Controleer op koloniemorfologie en grootte. Uitvoeren van pancreas gen marker expressie analyse en functionele analyse (Glucose gestimuleerdE C-peptide secretie test).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Niet-integratief inductieprotocol
OPMERKING: Het niet-integratieve protocol is het backbone-protocol voor het leveren van de IPC 's met het inductieproces in drie stappen als een micromilieu-inductiebenadering8,9.
<ol><li>Gebruik passage 3-5 hDPSCs bij 70%-80% samenvloeiing.</li>
	<li>Gooi het kweekmedium weg en was hDPSC's met 1x PBS.</li>
	<li>Voeg 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende 1 min bij 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Voeg het kweekmedium toe om de trypsineactiviteit te stoppen en pipetteer de cellen voorzichtig om de suspensie met één cel te verkrijgen. Tel cellen en aliquot 1 x 106 cellen in elke verzamelbuis.<ol>
<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Resuspend de pellet in SFM-A en zaad op een lage bevestigingscultuurplaat (60 mm). Kweek de cellen gedurende 3 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Controleer de celmorfologie onder een omgekeerde microscoop.</li>
		<li>Verwijder SFM-A, voeg SFM-B (dag 3) toe en houd de cellen vervolgens de komende 2 dagen onder 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Verwijder SFM-B, voeg SFM-C (dag 5) toe en houd de cellen vervolgens de komende 5 dagen onder 37 °C, 5% CO2. SFM-C wordt elke 48 uur vervangen. OPMERKING: Elk inductiemedium wordt aangevuld met verschillende reagentia zoals beschreven; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM activine A, 1 nM natrium butyraat en 50 μM bèta-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS en 0,3 mM taurine; en SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurine, 100 nM GLP-1, 1 mM nicotinamide en 1x NEAAs.</li>
		<li>Zorg ervoor dat u de celmorfologie na elke stap en op dag 10 onder de omgekeerde microscoop controleert. OPMERKING: De cellen worden meer geaggregeerd en drijven als kolonies.</li>
		<li>Verzamel celkolonies voor verdere analyse. Controleer op koloniemorfologie en grootte. Uitvoeren van pancreas gen marker expressie analyse en functionele analyse (Glucose gestimuleerdE C-peptide secretie test).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+diabetes+atlas%3A+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li>
<li>Danaei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+fasting+plasma+glucose+and+diabetes+prevalence+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+370+country-years+and+2.7+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants.</a> Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).</li>
<li>Diabetes Care. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+hypoglycemia+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Minimizing hypoglycemia in diabetes.</a> Diabetes Care. 38 (8), 1583(2015).</li>
<li>Health Quality Ontario. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%3A+an+evidence-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ontario+Health+Technology+Assessment+Series%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation: an evidence-based analysis.</a> Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).</li>
<li>Brennan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+the+Edmonton+protocol+of+islet+transplantation+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States.</a> American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).</li>
<li>Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+encapsulation%3A+Physiological+possibilities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations.</a> Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).</li>
<li>Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Producing+Cell+Transplantation+Platform+for+Veterinary+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice.</a> Frontiers in Veterinary Science. 7, 4(2020).</li>
<li>Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feasibility+study+of+an+in+vitro+differentiation+potential+toward+insulin-producing+cells+by+dental+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).</li>
<li>Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+protocols+for+an+in+vitro+generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).</li>
<li>Kuncorojakti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%2FPluronic+F127-based+encapsulation+supports+viability+and+functionality+of+human+dental+pulp+stem+cell-derived+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 23(2020).</li>
<li>Ritz-Laser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+beta-cell+specific+transcription+factor+Pdx1+inhibits+glucagon+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription.</a> Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).</li>
<li>Pampusch, M. S., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+and+expansion+of+primary+T+cells+in+nine+days+with+maintenance+of+central+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li>
<li>Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+transfection+efficiency+of+pIDUA%2Fnanoemulsion+complexes+in+a+mucopolysaccharidosis+type+I+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).</li>
<li>Balak, J. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+ex+vivo+lentiviral+transduction+of+primary+human+pancreatic+exocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15870(2019).</li>
<li>Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+Activin+A+or+nicotinamide+with+the+pancreatic+transcription+factor+PDX1+support+differentiation+of+human+amnion+epithelial+cells+toward+a+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage.</a> Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).</li>
<li>Spaeth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+novel+role+for+the+Pdx1+transcription+factor+in+islet+%CE%B2-Cell+maturation+and+proliferation+during+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning.</a> Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).</li>
<li>Bastidas-Ponce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+and+Pdx1+cooperatively+regulate+postnatal+maturation+of+pancreatic+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells.</a> Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).</li>
<li>Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX1%2C+Neurogenin-3%2C+and+MAFA%3A+critical+transcription+regulators+for+beta+cell+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240(2017).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+transcriptome+profiling+of+progenitor-like+colonies+derived+from+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172(2017).</li>
<li>Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hrabe+de+Angelis%2C+M.+Modeling+coexistence+of+oscillation+and+Delta%2FNotch-mediated+lateral+inhibition+in+pancreas+development+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis.</a> Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).</li>
<li>Xu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+promotes+the+differentiation+of+human+dental+pulp+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+for+improving+the+diabetes+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1576(2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+under+microgravity+conditions-use+of+stem+cells+and+specialized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).</li>
<li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).</li>
<li>Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in pancreatic development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48(2015).</li>
<li>Motoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+specific+soluble+factors+promotes+the+functional+maturation+of+transcription+factor-mediated%2C+pancreatic+transdifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells.</a> PLoS One. 13 (5), 0197175(2018).</li>
<li>Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+pancreatic+acinar+cells+dedifferentiate+into+an+embryonic+progenitor-like+state+in+3D+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4040(2019).</li>
<li>Wedeken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+murine+pancreatic+progenitors+require+epidermal+growth+factor+and+nicotinamide+for+self-renewal+and+differentiation+in+a+serum-+and+conditioned+medium-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture.</a> Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).</li>
<li>Trott, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+self-renewing+pancreatic+progenitors+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+EMSC-islet+co-localizing+composites+for+xenogeneic+porcine+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).</li>
<li>Gauthaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-embryonic+human+Wharton%27s+jelly+stem+cells+do+not+induce+tumorigenesis%2C+unlike+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells.</a> Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Schiesser, J. V., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+beta+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).</li>
<li>Chmielowiec, J., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+and+expansion+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+Diabetic+Studies%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors.</a> The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het bereiken van een hogere IPC-productie van MSC's speelt een essentiële rol in diabetestherapie. De kritische stappen van het integratieve protocol zijn afhankelijk van de kwaliteit van cellen die moeten worden gebruikt voor de transductie en de kwaliteit van transducte cellen. Sommige celvereisten die moeten worden gecontroleerd op succesvolle transductie, zorgen voor celgezondheid, celbankbeheer en cellen bevinden zich in een mitotically actieve toestand. Verder speelt het monitoren van de levensvatbaarheid van trans...

Diabetes mellitus is een voortdurende wereldwijde zorg. Een rapport van de International Diabetes Federation (IDF) schatte dat de wereldwijde prevalentie van diabetes zou toenemen van 151 miljoen in 2000 tot 415 miljoen in 20151,2. De meest recente epidemiologische studie heeft voorspeld dat de geschatte wereldwijde prevalentie van diabetes zal toenemen van 451 miljoen in 2017 tot 693 miljoen in 20451. Het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol werd voor het eerst aangetoond in 2000, toen werd aangetoond dat het de endogene insulineproductie handhaafde en de normoglycemische toestand stabiliseerde bij type I diabetespatiënten3. De toepassing van het Edmonton-protocol kampt echter nog steeds met een knelpuntprobleem. Het beperkte aantal cadaverische alvleesklierdonoren is het belangrijkste probleem, omdat elke patiënt met type I diabetes ten minste 2-4 eilandjesdonoren nodig heeft. Bovendien kan het langdurig gebruik van immunosuppressiva levensbedreigende bijwerkingen veroorzaken4,5. Om dit aan te pakken, heeft de ontwikkeling van een potentiële therapie voor diabetes in het afgelopen decennium zich voornamelijk gericht op de generatie van effectieve insulineproducerende cellen (IPC's) uit verschillende bronnen van stamcellen6.
Stamcellen werden een alternatieve behandeling bij veel ziekten, waaronder diabetes type I, die wordt veroorzaakt door het verlies van bètacellen. Transplantatie van IPC's is de nieuwe veelbelovende methode voor het beheersen van de bloedglucose bij deze patiënten7. In dit artikel worden twee benaderingen gepresenteerd voor het genereren van IPC's, integratieve en niet-integratieve inductieprotocollen. Het inductieprotocol bootste het natuurlijke pancreasontwikkelingsproces na om de gerijpte en functionele IPC's8,9te krijgen .
Voor deze studie werden hDPSC's gekenmerkt door flowcytometrie voor MSC-oppervlaktemarkerdetectie, multilineagedifferentiatiepotentieel en RT-qPCR om de expressie van stamheidseigenschap en proliferatieve genmarkers te bepalen (gegevens niet getoond)8,9,10. hDPSC 's werden geïnduceerd in de richting van definitief endoderm, pancreasendoderm, pancreas-endocriene en pancreas bètacellen of IPC's (figuur 1), respectievelijk7. Om de cellen te induceren, werd een inductiebenadering in drie stappen gebruikt als een backbone-protocol. Dit protocol werd een niet-integratief protocol genoemd. In het geval van integratief protocol werd de essentiële pancreastranscriptiefactor, PDX1, overexpressie in hDPSC's gevolgd door de inductie van overexpressie PDX1 in hDPSC's met behulp van een differentiatieprotocol in drie stappen. Het verschil tussen niet-integratief en integratief protocol is de overexpressie van PDX1 in het integratieve protocol en niet in het niet-integratieve protocol. De pancreasdifferentiatie werd in deze studie vergeleken tussen de integratieve en niet-integratieve protocollen.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation, USA</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Corning&reg; 60 mm TC-behandelde Cultuurschaal</td><td>Corning&reg;</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade;</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferd zout (PBS) poeder, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>Eén pak wordt gebruikt voor het bereiden van 1 L PBS oplossing met steriele DDI</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral Vector Dragend PDX1 Voorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; Ultra-15 Centrifugaalfilter</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Human pWPT-PDX1 plasmide</td><td>Addgene</td><td>12256</td><td>Gift van Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256</td></tr><tr><td>Millex-HV Spuitfiltereenheid, 0.45&nbsp;&micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmide</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Gift van Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259</td></tr><tr><td>Polybrene Infectie/Transfectiereagens</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plasmide</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Gift van Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260</td></tr><tr><td>Drie-stappen Inductie Protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activine A Recombinant Humaan Eiwit</td><td>Merck Millipore</td><td>GF300</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serum albumine (BSA, Cohn fractie V, vetzuurvrij)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon-achtig peptide (GLP)-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3265</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrine-Selenium (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële Aminozuren (NEAA's)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Niet-behandelde celcultuurschaal, 60mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701011</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

Vanaf 2000 werd het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol voor de behandeling van diabetes mellitus type I nog steeds geconfronteerd met enkele obstakels. Deze omvatten het beperkte aantal cadaverische alvleesklierdonoren en het langdurig gebruik van immunosuppressiva. Mesenchymale stamcellen (MSC's) worden beschouwd als een potentiële kandidaat als een alternatieve bron van eilandjesachtige celgeneratie. Onze vorige rapporten hebben met succes de vaststelling van inductieprotocollen geïllustreerd voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) tot insulineproducerende cellen (IPC's). De inductie-efficiëntie varieerde echter sterk. In dit artikel demonstreren we de vergelijking van hDPSC's pancreasinductie-efficiëntie via integratieve (micro-environmentale en genetische manipulatie) en niet-integratieve (micro-environmentale manipulatie) inductieprotocollen voor het leveren van hDPSC-afgeleide IPCs (hDPSC-IPCs). De resultaten suggereren een duidelijke inductie-efficiëntie voor zowel de inductiebenaderingen in termen van 3-dimensionale koloniestructuur, opbrengst, pancreas mRNA-markers en functionele eigenschap bij multidoseringsglucose-uitdaging. Deze bevindingen zullen de toekomstige oprichting van een klinisch toepasbaar IPCs- en pancreaslijnproductieplatform ondersteunen.

In dit artikel werden de resultaten van beide inductieprotocollen vergeleken. De diagrammen van beide inductieprotocollen zijn geïllustreerd in figuur 2A,C. In beide protocollen werd de evaluatie uitgevoerd onder een lichtmicroscoop en werden beelden geanalyseerd met ImageJ. hDPSCs waren in staat om kolonie-achtige structuren te vormen vanaf de eerste dag van inductie in beide inductieprotocollen. De morfologie van de kolonie was rond en dicht, en alle kolonies dreven in de ...

Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC's).

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

Deze video toont de in vitro inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen. Stamcellen geven een alternatieve behandeling bij veel ziekten, waaronder diabetes type I, die biolaging van bètacellen veroorzaken. Transplantatie van insulineproducerende cellen zal de nieuwe veelbelovende methode zijn om levenslang te veroorzaken.In deze video worden twee benaderingen beschreven voor het genereren van insulineproducerende cellen, waaronder het integratieve en niet-integratieve inductieprotocol. En in dit deel wordt het integratieprotocol voor het induceren van insulineproducerende cellen uit menselijke tandpulpstamcel uitgelegd. Voor het inductieprotocol is het voor het mengen van het natuurlijke pancreasontwikkelingsproces.Om de natuurlijke en functionele insulineproducerende cellen te krijgen. Voor het genereren van insulineproducerende cellen uit mesenchymale stamcellen zoals tandpulpstamcellen wordt een multistaps inductieprotocol gebruikt. Mesenchymale stamcellen worden gebruikt in het woord definitief endoderm, pancreasendoderm, pancreas endocriene en vervolgens pancreas bètacel of insulineproducerende cellen respectievelijk.Om de cellen te induceren, w

in-vitro-induction-human-dental-pulp-stem-cells-toward-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

Hier beschrijven we een 4-traps protocol om menselijke embryonale stamcellen te differentiëren naar NKX6-1 + alvleesklier voorlopercellen in vitro. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van humane pluripotente stamcellijnen.

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.

Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

Hier presenteren we een protocol voor menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen isolatie en vermeerdering teneinde het prion-eiwit expressie tijdens neuronale differentiatie.

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een primaire cultuur van stamcellen van tandpulp met behulp van de explantatiecultuurmethode en karakterisering van deze cellen op basis van ICSCRT-richtlijnen. De cellen die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden beschouwd als mesenchymale stamcellen voor verdere toepassingen.

Primaire cultuur van stamcellen van tandpulpa

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol legt de nadruk op de extractie, kweek en conservering van multipotente stamcellen uit tandpulp door middel van enzymatische vergisting. Bovendien toont het hun potentieel aan om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, wat het belang van precisie en consistentie in het proces benadrukt.

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

Leer hoe menselijke tandheelkundige pulpstamcellen in vitro worden geïnduceerd tot insulineproducerende cellen via integratieve en niet-integratieve protocollen. Deze methode ondersteunt regeneratieve therapieën voor diabetes type I.

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

Meer video's verkennen