Analyse van SAMHD1-beperking door flowcytometrie in humane myeloïde U937-cellen

Met toenemende belangstelling voor de rol van cellulaire factoren bij HIV-infectie van macrofagen, hebben we een flexibel analysesysteem ontwikkeld, met name voor SAM HG-analyse, dat niet tot expressie komt in U937-cellen. Het grote voordeel van het systeem is de flexibiliteit. Zodra het is ingesteld, kan het worden gebruikt om een verscheidenheid aan eiwitten, cellen of doelvirussen te analyseren.

Het is belangrijk om de gezondheid van de cellen te behouden en ook om comfortabel te zijn met multicolor flowcytometrie. Schakel de cytometer en computer 10 minuten voordat u met de analyse begint in. Zorg ervoor dat het afval leeg is en de schedetank vol is.

Log vervolgens in en open de analysesoftware. Nadat u de arm hebt bewogen, haalt u de waterbuis eraf. Stel het debiet in op hoog en druk op prime.

Wacht tot het licht uitgaat en herhaal dit proces nog drie keer. Plaats de waterbuis terug en laat drie minuten met een hoog debiet draaien. Stel vervolgens het debiet in op laag en druk op stand-by totdat u het hebt overgenomen.

Selecteer experiment, nieuw experiment en druk op OK om leeg experiment te selecteren, klik met de rechtermuisknop op het experiment en voeg een nieuw exemplaar toe. Druk op OK om het paneel leeg te maken. Klik met de rechtermuisknop om de naam te wijzigen met een geschikte naam en open het exemplaar door op het plusteken te klikken om een nieuwe buis te onthullen.

Dubbelklik op de buis om de cytometerinstellingen in de inspecteur te zien. Verwijder in het menu parameters de niet-vereiste fluorchromen, behalve de blauwe laser 53030 en de gele laser 61020. Maak op het werkblad een voorwaarts spreidingsgebied versus zijverstrooiingsgebied dot plot, YFP histogram, RFP histogram en RFP versus YFP dot plot door op het overeenkomstige pictogram te klikken en de assen te wijzigen door op het aslabel te klikken.

Laad de niet-geïnfecteerde, niet-getransduceerde besturing en druk op de machine. Druk vervolgens op acquire in het acquisitiedashboard. Pas de voorwaartse en zijwaartse spreidingsspanningen in het dashboard aan om de cellen in het kwadrant linksonder te plaatsen.

Poort rond deze populatie en label het als P één. Klik met de rechtermuisknop op de andere percelen en selecteer toon P één om het puin uit de volgende analyse te verwijderen. Pas de RFP- en YFP-spanningen naar beneden aan, zodat de piek links van het histogram zit.

Laad het besturingselement voor één kleur voor YFP en druk op acquire. Pas de YFP-spanning in het dashboard aan, zodat de meest fluorescerende cellen zich binnen het detectorbereik bevinden. Herhaal vervolgens hetzelfde voor het RFP-besturingselement.

Selecteer het experiment. Ga naar de compensatie-instelling en selecteer compensatiebesturingselementen maken en ok om naar een normaal werkblad te schakelen en selecteer vervolgens een niet-gekleurd normaal werkblad. Druk op de vlucht en verkrijg voor de onbevlekte controle.

Teken een poort P om de intacte cellen en noteer. Verwijder de buis en zet het apparaat op stand-by. Klik met de rechtermuisknop op P één.

Klik op toepassen op alle compensatieregelaars en schakel over naar het normale RFP-werkblad. Druk op de run en neem de RFP-besturing met één kleur op en de software zal automatisch de positieve cellen gateen. Zet het apparaat op stand-by en herhaal hetzelfde voor de YFP-besturing.

Selecteer experiment, ga naar compensatie-instelling, selecteer compensatie berekenen en klik vervolgens op link en opslaan. Schakel over naar het algemene werkblad en ga terug naar de monsterbuis. Verkrijg de cellen die zijn getransduceerd met wild type SAM HD één geïnfecteerd met HIV RFP, en controleer of vier verschillende populaties te zien zijn in de hoeken van de kwadranten die verticaal en horizontaal zijn uitgelijnd voor YFP en RFP.

Verwijder de buis en druk op stand-by. Laad het niet-getransduceerde, niet-geïnfecteerde monster opnieuw en druk op uitvoeren. Stel in het acquisitiedashboard de stoppoort in op P één en gebeurtenissen om 30.000 gebeurtenissen te registreren.

Druk op record. Herhaal hetzelfde voor andere monsters en controles door de volgende buis tussen elke buis te drukken. Wijzig de naam van de voorbeelden tijdens het uitvoeren of na het uitvoeren en exporteer de gegevens als punt-FCS-bestanden.

Open de software en sleep alle FCS-bestanden naar het dashboard. Selecteer de compensatiebesturingselementen en sleep ze naar de submap compensatie. Dubbelklik op de niet-vervormde, niet-geïnfecteerde buis om het bestand te openen en een versus-zijspreiding van een plot door te sturen.

Selecteer het gereedschap Polygoon en poort op de intacte celpopulatie met uitzondering van puin in de linkerbenedenhoek en geef het een naam aan cellen. Verplaats het label zodat de cellen niet worden verduisterd. Sleep deze poort naar de hele populatie buizen in de balk alle monsters.

Blader door de hele populatie met behulp van de horizontale pijlknoppen om de juiste gating voor elke buis te garanderen. Dubbelklik op de cellen en pas de assen aan op hoogte versus gebied. Selecteer de enkele grote populatie met behulp van een rechthoekige poort om doubletten uit te sluiten en om de software in staat te stellen deze automatisch als enkele cellen te benoemen.

Sleep vervolgens deze poort naar alle celpopulaties en controleer of de gating geschikt is voor alle monsters. Selecteer de populatie met afzonderlijke cellen voor het niet-geïnfecteerde, niet-getransduceerde monster. Wijzig de Y-as in gecompenseerde blauwe laser voor YFP en X-as in gecompenseerde gele laser voor RFP.

Selecteer het kwadrant gating gereedschap en klik rechtsboven op de negatieve celpopulatie. Pas deze voorlopige gating toe op alle populaties met één cel door naar de bovenliggende poort in de balk Alle steekproeven te slepen. Als de kwadrantpoorten de populatie niet naar tevredenheid scheiden, gate dan de individuele kwadranten met behulp van de polygoontool.

Scrol naar het wildtype SAM HD one only sample om de juiste gating tussen de niet-getransduceerde YFP-negatieve en YFP-positieve cellen te controleren. Gebruik de contourweergave om de negatieve cellen te onderscheiden van zwakke YFP-cellen. Gebruik de beste verdeling tussen YFP negatief en positief die geldig is voor alle monsters en blader door de monsters om de gating met betrekking tot YFP-positiviteit te controleren.

Scrol naar het niet-getransduceerde hiv-RFP-geïnfecteerde monster en controleer of de gating tussen het niet-geïnfecteerde RFP-negatief en het geïnfecteerde RFP-positief correct is. Gebruik indien nodig de contourweergave en blader door de resterende voorbeelden om te controleren of de gating geldig is voor alle monsters. Elk monster vereist vier kwadranten.

Q1 YFP positief, Q2 dubbel positief, Q3 RFP positief en Q4 dubbel negatief. Open de tabeleditor en sleep de vier kwadrantpoorten naar het dashboard. Selecteer om te archiveren en excelleer uit de vervolgkeuzelijst.

Kies uw bestandsbestemming en klik op Tabel maken. Sla de gegenereerde spreadsheet op volgens de lokale bestandsnaamgevingsconventies. Klik op het pictogram van de lay-outeditor om de representaties van plots en gatingstrategieën te exporteren.

Selecteer elke populatie en sleep deze naar de editor met de vereiste assen, labeling en spatiëring. Als u een lay-out wilt maken met dezelfde plots die worden weergegeven voor alle voorbeelden onder de batchsectie, voert u er een in de kolom in en drukt u op Batchrapport maken. Selecteer in het bestandsmenu de schaal naar breedte en vermijd pagina-einden.

Sla vervolgens op in het vereiste bestandsformaat. Genereer in de geëxporteerde spreadsheet de kolommen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik de juiste software voor gegevensanalyse om het gemiddelde te nemen van de replicerende gegevens voor elke SAM HD-constructie en bereken de waarden van de beperkingsverhouding.

Representatieve YFP versus RFP plots werden gegenereerd voor optimale en suboptimale data. De suboptimale dataplot geeft aan dat de hiv-infectie te laag was en problemen veroorzaakte met compensatie en gating. De beperkingsratio was 0,5, wat hoger is dan de verwachte ratio van 0,3.

De plot of restriction ratio voor varianten van SAM HD één met betrekking tot het wilde type en negatieve controle werden gegenereerd voor de optimale en suboptimale gegevens. In de optimale gegevens toonde het wilde type de verwachte beperking van ongeveer 0,2 en negatieve controle HD 206 tot zeven AA had de beperkingsverhouding van 1,0. De variant R372D verschilde significant van het wilde type, maar verschilde niet significant van de negatieve controle en verloor het vermogen om te beperken.

In de suboptimale gegevens gedroeg de negatieve controle zich zoals verwacht, maar het wilde type vertoonde een beperkingsratio van 0,5 vanwege de lage infectiegraad. De R143D vertoonde een intermediair fenotype dat statistisch verschilt van het wilde type en de negatieve controle. De variant G209S verschilde significant van het wilde type, maar verschilde niet significant van de negatieve controle en heeft dus het vermogen om te beperken verloren.

Het is belangrijk om voldoende van uw controlecellen te hebben, vooral als u nieuw bent in flowcytometrie. Hierna of parallel hieraan kan biochemische analyse van dezelfde mutanten worden uitgevoerd om een holistisch beeld te vormen.