Een high-throughput enzymgekoppelde activiteitstest om de interactie van kleine moleculen met het dNTPase SAMHD1 te onderzoeken
16 april 2021
SAMHD1 is een deoxynucleosidetrifosfaattrifosfohydrolase met een cruciale rol in de gezondheid en ziekte van de mens. Hier presenteren we een veelzijdige enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest, ingezet in een microplaatformaat met 384 putjes, die de evaluatie van kleine moleculen en nucleotide-analogen als SAMHD1-substraten, activatoren en remmers mogelijk maakt.
Deze methode stelt ons in staat om te karakteriseren welke chemotherapiegeneesmiddelen worden gehydrolyseerd door SAMHD1 en kan worden gebruikt als een screeningstest om kleine molecuulremmers van dit enzym te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en goedkoop is en een enorme hoeveelheid informatie oplevert over hoe verschillende kleine moleculen interageren met dit enzym. De procedure wordt gedemonstreerd door Miriam, een postdoc uit de groep.
Bereid om te beginnen een volledige SAMHD1-reactiebuffer voor door Tween-20 en TCEP toe te voegen aan de eindconcentraties van respectievelijk 0,005% en 0,3 millimolaar. Bereid EDTA-stopoplossing voor door EDTA toe te voegen aan een eindconcentratie van 7,9 millimolair in de volledige SAMHD1-reactiebuffer. Bereid malachietgroene of MG-werkoplossing voor door 10 delen MG-voorraadoplossing te mengen met 2,5 delen 7%ammoniummolybdaat en 0,2 delen 11%Tween-20.
Verdun de testverbindingen met behulp van een meerkanaalspipet serieel in het desbetreffende oplosmiddel tot 100 keer de uiteindelijke concentratie in een doorzichtige polypropyleen plaat met 96 putjes met ronde bodem. verdun deze verbindingen verder tot 25 keer de uiteindelijke concentratie met volledige SAMHD1-reactiebuffer om de uiteindelijke concentratie van het oplosmiddel onder de 1% te houdenBreng vijf microliter verdunde component over naar de juiste putjes van een doorzichtige testplaat met platte bodem van 384 putjes en herhaal de procedure met controlemonsters met alleen oplosmiddelen. Verdun voor de bereiding van het enzymmastermengsel het recombinante humane SAMHD1-eiwit en de recombinante pyrofosfatase in een volledige SAMHD1-reactiebuffer tot vier keer de gewenste eindconcentratie.
Bereid activator of substraat dGTP voor door de oplossing te verdunnen in een volledige SAMHD1-reactiebuffer om een concentratie van 50 micromolaire te bereiken. Aan de putjes met samengestelde verdunningen en alleen oplosmiddelcontrole, doseer vijf microliter SAMHD1 pyrofosfatase-mastermix en voeg aan de geen enzymcontroleputjes vijf microliter volledige SAMHD1-reactiebuffer toe. Doseer vervolgens 10 microliter dGDP-oplossing in alle putjes om de reactie te starten en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Om de reactie te stoppen, voegt u 20 microliter EDTA-stopoplossing toe. Nadat u 10 microliter MG-werkoplossing aan alle putjes hebt toegevoegd, mengt u de inhoud met behulp van een orbitale microtiterplaatschudder en centrifugeert u de plaat gedurende één minuut bij 1000 x g. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en lees de absorptie af op 630 nanometer in een microtiterplaatlezer.
Bereken de standaarddeviatie van de positieve controleputjes en bereken vervolgens het gemiddelde. Bereken op dezelfde manier voor de negatieve controleputten de standaarddeviatie en bereken vervolgens het gemiddelde. Bereken de Z-factor is een indicator van de kwaliteit van de test.
Normaliseer elke extinctiewaarde naar de gemiddelde waarden van positieve en negatieve controles. De positieve controle instellen als 100%SAMHD1 activiteit en de negatieve controle als 0%SAMHD1 activiteit. De SAMHD1-activiteit van de grafiek is een functie van de concentratie van de verbinding en past in een dosisresponscurve met vier parameters voor variabele helling, waardoor de halve maximale remmende concentratie van de verbinding kan worden bepaald.
Verdun nucleotide-analoge voorraden en vul de SAMHD1-reactiebuffer aan tot vier keer de uiteindelijke concentratie en breng vijf microliter over naar de juiste putjes van een assayplaat met 384 putjes. Om enzym SAMHD1 of pyrofosfatase-mastermix te bereiden, verdunt u recombinant humaan SAMHD1-eiwit en Escherichia coli-pyrofosfatase in een volledige SAMHD1-reactiebuffer tot tweemaal de gewenste eindconcentratie. Bereid alleen pyrofosfatase-oplossing door recombinant Escherichia coli-pyrofosfatase te verdunnen tot tweemaal de gewenste eindconcentratie in volledige SAMHD1-reactiebuffer.
Bereid op dezelfde manier activatoren GTP en dGTP alpha S voor door de voorraad in volledige SAMHD1-reactiebuffer te verdunnen tot vier keer de uiteindelijke concentratie. Doseer vijf microliter van de activator, ofwel GDP of dGTP alfa S of volledige SAMHD1-reactiebuffer in de juiste putjes van een 384-wells assayplaat die de nucleotide-analogen bevat. Start de reactie door 10 microliter SAMHD1 pyrofosfatase-mastermix, pyrofosfatase alleen of volledige SAMHD1-reactiebuffer in de juiste putjes te doseren en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
Voeg na het stoppen van de reactie met behulp van EDTA-stopoplossing 10 microliter MG-werkoplossing toe aan alle putjes. Zodra de inhoud is gemengd, centrifugeert u de plaat gedurende één minuut op 1000 x g en incubeert u gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Meet vervolgens de extinctie op 630 nanometer.
Bereken de gemiddelde extinctiewaarden voor de reactieputjes met alleen pyrofosfatase, die de achtergrondwaarde zullen zijn. Trek vervolgens de achtergrondwaarde af van de corresponderende putjes in de SAMHD1- of pyrofosfatasereacties. Zet ten slotte de gecorrigeerde absorptiewaarden voor elk nucleotide-analoog uit met buffer GTP- en dGTP-alfa-S-omstandigheden.
In de huidige studie nam het absorptiemiddel toe met toenemende natriumfosfaatconcentratie na incubatie met malachietgroen reagens en bereikte het een verzadiging bij een concentratie van 0,25 millimolair. Het lineaire detectiebereik van fosfaat is zichtbaar van 0,004 tot 0,03 millimolair. De vereiste van testcomponenten om meetbare SAMHD1-activiteit te bereiken, wordt geïllustreerd.
Noch SAMHD1, noch pyrofosfatase alleen zou een organisch fosfaat kunnen genereren in aanwezigheid van dGTP. Wanneer echter alle testcomponenten aanwezig waren, werd een toename van het signaal waargenomen. De dosis-responscurves verkregen voor SAMHD1-remmerverbindingen toonden aan dat toenemende concentraties de SAMHD1-activiteit effectief remmen.
Hydroxyurea remt de SAMHD1-activiteit in vitro niet, wat werd aangegeven door onaangetaste SAMHD1-activiteit bij toenemende hydroxyureadoses. dGTP-binding aan beide allosterische plaatsen activeert SAMHD1, waardoor daaropvolgende hydrolyse van dit nucleotide mogelijk is, terwijl de andere drie canonieke dNTP's eerst GTP-activering van de eerste allosterische plaats vereisen voordat ze de tweede allosterische plaats kunnen binden en vervolgens op de katalytische plaats kunnen worden gehydrolyseerd. Voor nucleotide-analogen is clofarabinetrifosfaat een allosterische plaats twee-activator en een substraat als activiteit wordt waargenomen in aanwezigheid van GTP.
Terwijl cytarabinetrifosfaat alleen in staat is om de katalytische plaats in te nemen, omdat dGTP-alfa S nodig is om activiteit waar te nemen. Er werd geen activiteit waargenomen met gemcitabinetrifosfaat. Na de identificatie van kleine moleculen die SAMHD1 in deze test remmen door middel van fysieke benaderingen, zoals thermische verschuivingstests, kan worden gebruikt om de betrokkenheid van het doelwit te ondervragen.
De hier getoonde methode heeft ons geholpen te begrijpen welke van de kankermedicijnen kunnen worden gehydrolyseerd door SAMHD1 en dit enzym vast te stellen als een potentieel therapeutisch doelwit om resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een robuuste high-throughput enzymgekoppelde malachietgroen-assay voor het karakteriseren van de activiteit en inhibitie van Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1). De methode maakt indirecte meting van de SAMHD1-activiteit mogelijk door de kwantificering van anorganisch fosfaat dat vrijkomt tijdens nucleotidehydrolyse, wat de studie van interacties van kleine moleculen, waaronder inhibitoren en allosterische regulatoren, met dit enzym faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Enzymologie
- Kankerfarmacologie
Achtergrond
- SAMHD1 reguleert de intracellulaire pools van deoxynucleosidetrifosfaat (dNTP) door dNTP's te hydrolyseren.
- Het is betrokken bij het nucleotidemetabolisme, therapieresistentie en diverse pathologieën.
- Inzicht in de regulatie en functie van SAMHD1 is van cruciaal belang voor de therapeutische ontwikkeling.
- Eenvoudige high-throughput assays zijn nodig om interacties van kleine moleculen met SAMHD1 te onderzoeken.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen en demonstreren van een eenvoudige, goedkope en high-throughput assay voor SAMHD1-activiteit.
- Het karakteriseren van bekende inhibitoren en substraten van SAMHD1, waaronder anticancermiddelen.
- Het ontrafelen van de mechanismen van SAMHD1-katalyse en de regulatie door allosterische activatoren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van SAMHD1-reactiebuffer, EDTA-stopoplossing en malachietgroen-werkoplossing.
- Seriële verdunning van testverbindingen en controles in 384-wells plaatformaat.
- Enzymreacties met recombinant humaan SAMHD1 en pyrofosfatase, met nucleotide-substraten of analogen.
- Colorimetrische detectie van anorganisch fosfaat via malachietgroen-reagens en absorptiemeting bij 630 nm.
- Normalisatie van gegevens, berekening van de Z-factor voor assay-kwaliteit en het fitten van dosis-responscurves om de potentie van inhibitoren te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- De assay detecteert SAMHD1-activiteit betrouwbaar alleen wanneer alle componenten aanwezig zijn.
- Bekende SAMHD1-remmers vertonen dosisafhankelijke inhibitie; hydroxyure remt SAMHD1 in vitro niet.
- dGTP fungeert als een allostere activator, terwijl andere dNTP's GTP nodig hebben voor activatie.
- Clofarabine-trifosfaat fungeert als zowel een allostere activator als substraat; cytarabine-trifosfaat vereist een dGTP-analoog voor activiteit; gemcitabine-trifosfaat wordt niet gehydrolyseerd.
- De assay kan kleine molecuulremmers identificeren en substraatspecificiteit karakteriseren.
Conclusies
- De enzymgekoppelde malachietgroen-assay is een krachtig high-throughput instrument voor het bestuderen van de SAMHD1-activiteit en -inhibitie.
- Het maakt screening van kleine molecuulremmers en karakterisering van interacties met nucleotide-analogen mogelijk.
- Deze methode ondersteunt de identificatie van SAMHD1 als therapeutisch doelwit om drugresistentie bij kanker te overwinnen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
High-throughput enzymgekoppelde activiteitsassays voor SAMHD1 maken een snelle, kwantitatieve analyse mogelijk van interacties tussen kleine moleculen en een belangrijke regulator van het nucleotidemetabolisme. Deze capaciteit is cruciaal voor targetvalidatie, mechanistische risicoreductie en portfoliotriage in pijplijnen voor oncologische en antivirale geneesmiddelenontwikkeling. Het malachietgroen-assayformaat ondersteunt schaalbare screening en robuuste datageneratie voor zowel inhibitor- als substraatprofilering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt systematische analyse van SAMHD1 als therapeutisch doelwit mogelijk door kwantificering van modulatie door kleine moleculen.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door directe meting van de enzymactiviteit in reactie op kandidaatverbindingen.
- Faciliteert functionele validatie van allosterische regulatoren en remmers die relevant zijn voor pathways van geneesmiddelresistentie.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd high-throughput platform voor het screenen van verbindingenbibliotheken tegen SAMHD1.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor dosis-respons en IC50-bepaling.
- Maakt schaalbaarheid van de assay en hergebruik van het platform mogelijk over diverse klassen van verbindingen en analogen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door drug-enzyminteracties te karakteriseren die relevant zijn voor therapieresistentie.
- Ondersteunt de continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie van kandidaat-inhibitoren of substraten.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door substraatspecificiteit en inhibitorpotentie te verduidelijken.
Integratie van pijplijn en workflow
Deze assay bevindt zich op het snijvlak van targetvalidatie, leadidentificatie en preklinische mechanistische studies voor targets binnen het nucleotidemetabolisme.
- Discovery Biology: Kwantificeert veranderingen in enzymactiviteit om therapeutische hypothesen te testen en reguleringsmechanismen te verduidelijken.
- Screening: Levert robuuste, reproduceerbare resultaten voor de triage van verbindingen en hit-validatie.
- Analytics: Maakt dosis-responscurve-fitting, Z-factor-berekening en normalisatie mogelijk voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro enzymmodulatie met potentiële in vivo mechanismen van geneesmiddelresistentie.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Aanpasbaar voor andere fosfaatvrijmakende enzymen voor toepassing in een breder portfolio.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-engagement en de effectiviteit van inhibitoren.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de opzet van assays, standaardisatie en high-throughput data-acquisitie.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaatmoleculen en mechanistische targets mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in enzymologie, assay-ontwikkeling en kwantitatieve data-analyse.
- Toegang tot recombinante eiwitproductie en high-throughput platlezers is noodzakelijk.
- Strenge standaardisatie van controles en normalisatieprocedures tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar aan diverse nucleotide-analogen en libraries van kleine moleculen met minimale wijzigingen in het protocol.
- Het detectiebereik en de achtergrondcorrectie moeten worden gevalideerd voor elke nieuwe enzym- of substraatklasse.
