Name: Een high-throughput enzymgekoppelde activiteitstest om de interactie van kleine moleculen met het dNTPase SAMHD1 te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer een high-throughput enzymgekoppelde malachietgroen-assay om de activiteit en inhibitie van SAMHD1 te karakteriseren. Deze methode meet indirect de enzymactiviteit door anorganisch fosfaat te kwantificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Thomas Lundbäck en leden van het laboratorium van Thomas Helleday voor advies en ondersteuning. Een deel van dit werk werd gefaciliteerd door de Protein Science Facility van het Karolinska Institutet/SciLifeLab (http://ki.se/psf), en we erkennen het National Cancer Institute (NCI), de Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) en het Developmental Therapeutics Program (DTP) (http://dtp.cancer.gov) voor het leveren van een verbinding. Financiering werd verstrekt door subsidies die aan S.G.R. werden toegekend door de Zweedse Onderzoeksraad (2018-02114), de Zweedse Kankervereniging (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), het Zweedse Kinderkankerfonds (PR2019-0014) en het Karolinska Institutet.

Een schematisch overzicht van de onderstaande methoden is weergegeven in figuur 1 en een gedetailleerde lijst van materialen en reagentia is beschikbaar in de tabel met materialen.
1. Bereiding van analysebuffers.
<ol><li>Opstellen van voorraadbuffers. OPMERKING: Aangezien de test gevoelig is voor de detectie van fosfaten, wat alledaags kan zijn, moet u glaswerk drie keer spoelen met ultrapuur of dubbel gedestilleerd water om besmetting te voorkomen. Alle buffers kunnen bij kamertemperatuur (RT) worden opgeslagen.<ol><li>Bereid 1 l SAMHD1-reactiebufferoplossing (RB) (25 mM Tris-Acetaat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2) door 4,5 g Trisacetaat, 2,3 g NaCl en 0,2 g MgCl2 op te lossen in ongeveer 800 ml water voordat u de pH 8 en het uiteindelijke volume instelt.</li>
		<li>Bereid 5 ml 0,1 M TCEP-stockoplossing door 1 ml 0,5 M TCEP te verdunnen in 4 ml water.</li>
		<li>Bereid 50 ml 11% Tween-20 bouillonoplossing door 5 ml 100% Tween-20 te verdunnen in 44,5 ml water. OPMERKING: Tween-20 is lichtgevoelig.</li>
		<li>Bereid 50 ml 0,5 M EDTA-stopoplossing door 9,3 g EDTA op te lossen in ongeveer 40 ml water voordat u de pH 8 en het uiteindelijke volume aanpast.</li>
		<li>Bereid Malachietgroen (MG) bouillonoplossing (3,2 mM malachietgroen in H2SO4) door langzaam 60 ml geconcentreerd zwavelzuur toe te voegen aan 300 ml water in een bruine glazen fles. Koel de oplossing af tot RT en los 0,44 g malachietgroen op. VOORZICHTIGHEID: De reactie van zwavelzuur met water is exotherm en dus kan de fles opwarmen en een drukopbouw veroorzaken; Zorg ervoor dat deze druk regelmatig wordt afgelaten. OPMERKING: De resulterende oranje oplossing is lichtgevoelig (vandaar bruine fles) en stabiel gedurende ten minste 1 jaar bij RT. Na verloop van tijd kan zich neerslag vormen, zorg ervoor dat alleen het supernatans wordt gebruikt.</li>
		<li>Bereid 50 ml 7% ammoniummolybdaatoplossing door 3,75 g ammoniummolybdaat op te lossen in 50 ml water. NOTITIE: Na verloop van tijd kan zich neerslag vormen, zorg ervoor dat alleen het supernatans wordt gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van volledige analysebuffers OPMERKING: Dit moet gebeuren op de dag van het experiment<ol><li>Bereid complete SAMHD1 RB (25 mM Tris-Acetaat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20). Gebruik eerder bereide 11% Tween-20 en 0,1 M TCEP-voorraden om deze componenten in een eindconcentratie van 0,005% voor Tween-20 en 0,3 mM voor TCEP toe te voegen aan de SAMHD1 RB-voorraad.</li>
		<li>Bereid EDTA-stopoplossing (25 mM Tris-Acetaat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20, 7,9 mM EDTA). Om SAMHD1 RB te voltooien, gebruikt u 0,5 M EDTA-voorraadoplossing om EDTA toe te voegen tot een eindconcentratie van 7,9 mM.</li>
		<li>Bereid MG-werkoplossing (2,5 mM malachietgroen, 1,4% ammoniummolybdaat, 0,18% Tween-20) voor door 10 delen MG-stockoplossing te mengen met 2,5 delen 7% ammoniummolybdaat en 0,2 delen 11% Tween-20.</li>
	</ol></li>
</ol>2. SAMHD1-remmingstest en bepaling van verbinding IC50
OPMERKING: De definitieve testomstandigheden zijn weergegeven in tabel 1.
<ol><li>Bereiding van verbindingen in de analyseplaat OPMERKING: Verbindingen met een klein molecuulgewicht worden meestal opgelost in 100% DMSO- en nucleotide-analogen in water. De materiaalconcentratie varieert van 10 tot 100 mM en wordt beïnvloed door de potentie en oplosbaarheid van de verbindingen, samen met de DMSO-tolerantie van de test. Controleer of de uiteindelijke DMSO-concentratie in de reactie niet hoger is dan 1% om er zeker van te zijn dat de enzymactiviteiten niet worden beïnvloed door dit oplosmiddel. Het is een goede gewoonte om de tolerantie van de test ten opzichte van het oplosmiddel voorafgaand aan het experiment te testen.<ol><li>Bereid serieel verdunde testverbindingen in een eindconcentratie van 100x in het relevante oplosmiddel (bv. 100% DMSO voor kleine moleculen of water voor nucleotide-analogen) in een doorzichtige polypropyleen plaat met ronde bodem en 96 putjes met behulp van een meerkanaalspipet of geautomatiseerde vloeistofbehandelingsapparatuur. OPMERKING: Afhankelijk van de stabiliteit van de verbinding kunnen verdunningsplaten van tevoren worden voorbereid, verzegeld en opgeslagen bij -20 °C. Laat de platen in evenwicht komen met RT voordat u doorgaat met het protocol.</li>
		<li>Gebruik volledige SAMHD1 RB verdun verbindingen tot 25x de eindconcentratie (om de uiteindelijke concentratie van het oplosmiddel onder de 1% te houden) en breng 5 μL over naar de juiste putjes van een doorzichtige testplaat met platte bodem met 384 putjes. Herhaal de procedure met controlemonsters met alleen oplosmiddelen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van reactiecomponenten OPMERKING: Dit moet gebeuren op de dag van de test. Recombinante humane aliquots van SAMHD1 en E. coli-pyrofosfatase (PPase) worden langdurig opgeslagen bij -80 °C, verdund met respectievelijk 9,1 mg/ml en 23,0 mg/ml in opslagbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM TCEP). Na ontdooiing worden aliquots kortstondig bewaard bij -20 °C.<ol><li>Bereid enzym (SAMHD1/PPase) mastermix voor door recombinant humaan SAMHD1-eiwit en recombinant PPase in volledig SAMHD1 RB te verdunnen tot 4x de gewenste eindconcentratie, dus 1,4 μM SAMHD1 en 50 E/ml PPase.</li>
		<li>Bereid activator/substraat dGTP voor door dGTP-voorraad (meestal 10 of 100 mM in water) te verdunnen in volledige SAMHD1 RB tot 2x de eindconcentratie, dus 50 μM dGTP.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de test uit OPMERKING: Alle testcomponenten moeten in evenwicht zijn met RT. Vloeistoftoevoegingen kunnen worden uitgevoerd met een meerkanaalspipet of een dispenser voor bulkreagensvloeistof.<ol><li>Doseer 5 μL SAMHD1/PPase-mastermix op een proefplaat met 384 putjes die samengestelde verdunningen en alleen oplosmiddelhoudende controles bevat. Doseer 5 μL volledige SAMHD1 RB aan geen enkele enzymcontroleput. Pre-incubeer enzymen en verbindingen gedurende 10 minuten bij RT.</li>
		<li>Doseer in alle putjes 10 μL 2x dGTP-oplossing om de reactie op gang te brengen.</li>
		<li>Incubeer de reactie gedurende 20 minuten bij RT.</li>
		<li>Stop de reactie door 20 μL EDTA-stopoplossing in alle putjes te doseren. OPMERKING: Het experiment kan hier desgewenst worden gepauzeerd.</li>
		<li>Voeg 10 μL MG werkoplossing toe aan alle putjes. VOORZICHTIGHEID: MG-werkoplossing bevat zwavelzuur.</li>
		<li>Zorg voor het mengen van de putinhoud met behulp van een orbitale microtiterplaatschudder en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij RT.</li>
		<li>Lees de absorptie af bij een golflengte van 630 nm in een microtiterplaatlezer.</li>
	</ol></li>
	<li>Datavisualisatie en -analyse
	<ol><li>Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de positieve en negatieve controleputjes (positieve, volledige reactie met oplosmiddel; negatief, dGTP alleen met oplosmiddel). Bereken de Z-factor37 als indicator voor de kwaliteit van de analyse.</li>
		<li>Normaliseer elke absorptiewaarde naar de gemiddelde waarden van de positieve en negatieve controles, waarbij de positieve controle wordt ingesteld op 100% SAMHD1-activiteit en de negatieve controle op 0% SAMHD1-activiteit.</li>
		<li>Plot SAMHD1-activiteit (%) als functie van de concentratie van de verbinding en pas in een dosis-responscurve met vier parameters voor variabele helling, waardoor verbinding IC50 kan worden bepaald.</li>
	</ol></li>
</ol>3. SAMHD1-activator en substraatscherm
OPMERKING: De uiteindelijke testomstandigheden zijn weergegeven in tabel 2. Recombinante SAMHD1- en PPase-aliquots worden langdurig opgeslagen bij -80 °C, verdund bij respectievelijk 9,1 mg/ml en 23,0 mg/ml, in opslagbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM TCEP) bij -80 °C. Eenmaal ontdooid, worden aliquots op korte termijn bewaard bij -20 °C.
<ol><li>Bereiding van nucleotide-analogen in de testplaat
	<ol><li>Verdun nucleotide-analoge voorraden (meestal 10 of 100 mM in water) tot 4x de eindconcentratie in volledig SAMHD1 RB, in ons geval 800 μM nucleotide-analoog, en breng 5 μL over naar de juiste putjes van een assayplaat met 384 putjes.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van reactiecomponenten OPMERKING: Dit moet gebeuren op de dag van de test<ol><li>Bereid enzym (SAMHD1/PPase) mastermix voor door recombinant humaan SAMHD1-eiwit en recombinant E. coli-PPase te verdunnen in volledig SAMHD1 RB tot 2x de gewenste eindconcentratie, dus 0,7 μM SAMHD1 en 25 E/ml PPase.</li>
		<li>Bereid PPase alleen-oplossing door recombinant E. coli-PPase in volledig SAMHD1 RB te verdunnen tot 2x de gewenste eindconcentratie, dus 25 E/ml PPase.</li>
		<li>Bereid activatoren GTP (AS1) en dGTPαS (AS1 en AS2) verdunnende bouillon (meestal 10 of 100 mM in water) in volledige SAMHD1 RB tot 4x de eindconcentratie, dus 50 μM GTP of dGTPαS.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de test uit OPMERKING: Alle testcomponenten moeten in evenwicht zijn met RT. Vloeistoftoevoegingen kunnen worden uitgevoerd met een meerkanaalspipet of een dispenser voor bulkreagensvloeistof.<ol><li>Doseer op een assayplaat met 384 putjes die nucleotide-analogen bevat 5 μL van de activator (GTP of dGTPαS) of vul SAMHD1 RB aan in de juiste putjes.</li>
		<li>Start de reactie door 10 μL SAMHD1/PPase-mastermix, PPase alleen, of volledige SAMHD1 RB in de juiste putjes te doseren.</li>
		<li>Incubeer de reactie gedurende 20 minuten bij RT.</li>
		<li>Stop de reactie door 20 μL EDTA-stopoplossing toe te dienen aan alle putjes. OPMERKING: Het experiment kan hier desgewenst worden gepauzeerd.</li>
		<li>Voeg 10 μL MG werkoplossing toe aan alle putjes. VOORZICHTIGHEID: MG-werkoplossing bevat zwavelzuur.</li>
		<li>Zorg voor het mengen van de putinhoud met behulp van een orbitale microtiterplaatschudder en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij RT.</li>
		<li>Lees de absorptie af bij een golflengte van 630 nm in een microtiterplaatlezer.</li>
	</ol></li>
	<li>Datavisualisatie en -analyse
	<ol><li>Bereken de gemiddelde extinctiewaarden voor de PPase-reactieputjes (negatieve controle of achtergrondsignaal). OPMERKING: Als positieve controle van een SAMHD1 allosterische activator en substraat kan dGTP in de plaat worden opgenomen. In dit geval kunt u deze voorwaarde gebruiken om de Z-factor te berekenen als indicator voor de kwaliteit van de test.</li>
		<li>Trek de achtergrondwaarde af van de corresponderende putjes in de SAMHD1/PPase-reacties.</li>
		<li>Plot gecorrigeerde absorptiewaarden voor elk nucleotide-analoog met buffer-, GTP- en dGTPαS-omstandigheden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Franzolin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deoxynucleotide+triphosphohydrolase+SAMHD1+is+a+major+regulator+of+DNA+precursor+pools+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The deoxynucleotide triphosphohydrolase SAMHD1 is a major regulator of DNA precursor pools in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14272-14277 (2013).</li>
<li>Coggins, S. A., Mahboubi, B., Schinazi, R. F., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+functions+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 functions and human diseases.</a> Viruses. 12 (4), 382(2020).</li>
<li>Goldstone, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+restriction+factor+SAMHD1+is+a+deoxynucleoside+triphosphate+triphosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase.</a> Nature. 480 (7377), 379-382 (2011).</li>
<li>Powell, R. D., Holland, P. J., Hollis, T., Perrino, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aicardi-Goutieres+syndrome+gene+and+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1+is+a+dGTP-regulated+deoxynucleotide+triphosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (51), 43596-43600 (2011).</li>
<li>Morris, E. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+Allostery+and+catalysis+in+the+anti-viral+protein+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The missing link: Allostery and catalysis in the anti-viral protein SAMHD1.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1013-1027 (2019).</li>
<li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2015).</li>
<li>Herold, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SAMHD1+with+the+Vpx+protein+to+improve+cytarabine+therapy+for+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting SAMHD1 with the Vpx protein to improve cytarabine therapy for hematological malignancies.</a> Nature Medicine. 23 (2), 256-263 (2017).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+a+biomarker+for+cytarabine+response+and+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia.</a> Nature Medicine. 23 (2), 250-255 (2017).</li>
<li>Hollenbaugh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+and+inhibitors+of+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Substrates and inhibitors of SAMHD1.</a> PloS One. 12 (1), 0169052(2017).</li>
<li>Knecht, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+cancer+drug+interactions+with+the+catalytic+and+allosteric+sites+of+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The structural basis for cancer drug interactions with the catalytic and allosteric sites of SAMHD1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10022-10031 (2018).</li>
<li>Oellerich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inactivation+of+hypomethylating+agents+by+SAMHD1+provides+a+rationale+for+therapeutic+stratification+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Selective inactivation of hypomethylating agents by SAMHD1 provides a rationale for therapeutic stratification in AML.</a> Nature Communications. 10 (1), 3475(2019).</li>
<li>Herold, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+protects+cancer+cells+from+various+nucleoside-based+antimetabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 protects cancer cells from various nucleoside-based antimetabolites.</a> Cell Cycle. 16 (11), 1029-1038 (2017).</li>
<li>Rothenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+a+key+regulator+of+the+lineage-specific+response+of+acute+lymphoblastic+leukaemias+to+nelarabine%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is a key regulator of the lineage-specific response of acute lymphoblastic leukaemias to nelarabine.</a> Communications Biology. 3 (1), 324(2020).</li>
<li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+enhances+nucleoside-+analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 enhances nucleoside- analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824(2017).</li>
<li>Castellví, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+modulation+of+SAMHD1+activity+by+CDK4%2F6+inhibitors+improves+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pharmacological modulation of SAMHD1 activity by CDK4/6 inhibitors improves anticancer therapy.</a> Cancers. 12 (3), 713-719 (2020).</li>
<li>Rassidakis, G. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+expression+of+SAMHD1+in+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29+blasts+correlates+with+improved+outcome+upon+consolidation+chemotherapy+with+high-dose+cytarabine-based+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">Low-level expression of SAMHD1 in acute myeloid leukemia (AML) blasts correlates with improved outcome upon consolidation chemotherapy with high-dose cytarabine-based regimens.</a> Blood Cancer Journal. 8 (11), 98(2018).</li>
<li>Rudd, S. G., Schaller, T., Herold, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+a+barrier+to+antimetabolite-based+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is a barrier to antimetabolite-based cancer therapies.</a> Molecular & Cellular Oncology. 4 (2), 1287554(2017).</li>
<li>Rudd, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotide+reductase+inhibitors+suppress+SAMHD1+ara-CTPase+activity+enhancing+cytarabine+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotide reductase inhibitors suppress SAMHD1 ara-CTPase activity enhancing cytarabine efficacy.</a> EMBO Molecular Medicine. 41, 10419(2020).</li>
<li>Seamon, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+SAMHD1+dNTPase+by+tetramer+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of SAMHD1 dNTPase by tetramer destabilization.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (28), 9822-9825 (2014).</li>
<li>Seamon, K. J., Stivers, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+enzyme-coupled+assay+for+SAMHD1+dNTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput enzyme-coupled assay for SAMHD1 dNTPase.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (6), 801-809 (2015).</li>
<li>Mauney, C. H., Perrino, F. W., Hollis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+inhibitors+of+the+dNTP+triphosphohydrolase+SAMHD1+using+a+novel+and+direct+high-throughput+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of inhibitors of the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1 using a novel and direct high-throughput assay.</a> Biochemistry. 57 (47), 6624-6636 (2018).</li>
<li>Morris, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+SAMHD1+inhibitor+complexes+reveal+the+mechanism+of+water-mediated+dNTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of SAMHD1 inhibitor complexes reveal the mechanism of water-mediated dNTP hydrolysis.</a> Nature Communications. 11 (1), 3165(2020).</li>
<li>Hansen, E. C., Seamon, K. J., Cravens, S. L., Stivers, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+activator+and+dNTP+substrates+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1+generate+a+long-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GTP activator and dNTP substrates of HIV-1 restriction factor SAMHD1 generate a long-lived activated state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (18), 1843-1851 (2014).</li>
<li>Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+malachite+green+procedure+for+orthophosphate+determination+and+its+use+in+alkaline+phosphatase-based+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay.</a> Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).</li>
<li>Hyun, M., Bohr, V. A., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+the+WRN-1+RecQ+helicase+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of the WRN-1 RecQ helicase of Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 47 (28), 7583-7593 (2008).</li>
<li>Lin, H. -H., Huang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+flavonol+inhibition+of+DnaB+helicase%3A+real-time+monitoring%2C+structural+modeling%2C+and+proposed+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of flavonol inhibition of DnaB helicase: real-time monitoring, structural modeling, and proposed mechanism.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012 (4), 735368(2012).</li>
<li>Yang, M., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+measurement+of+DNA+replicative+helicase+from+Bacillus+stearothermophilus+by+malachite+green+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">ATPase activity measurement of DNA replicative helicase from Bacillus stearothermophilus by malachite green method.</a> Analytical Biochemistry. 509, 46-49 (2016).</li>
<li>Allard, B., Cousineau, I., Spring, K., Stagg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+CD73+enzymatic+activity+using+luminescence-based+and+colorimetric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of CD73 enzymatic activity using luminescence-based and colorimetric assays.</a> Methods in Enzymology. 629, 269-289 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+sulfonyl+piperazine+LpxH+inhibitors+analyzed+by+an+LpxE-coupled+malachite+green+assay%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of sulfonyl piperazine LpxH inhibitors analyzed by an LpxE-coupled malachite green assay.</a> ACS Infectious Diseases. 5 (4), 641-651 (2019).</li>
<li>Carreras-Puigvert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structural%2C+biochemical+and+biological+profiling+of+the+human+NUDIX+hydrolase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structural, biochemical and biological profiling of the human NUDIX hydrolase family.</a> Nature Communications. 8 (1), 1541(2017).</li>
<li>Valerie, N. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUDT15+hydrolyzes+6-thio-deoxyGTP+to+mediate+the+anticancer+efficacy+of+6-thioguanine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NUDT15 hydrolyzes 6-thio-deoxyGTP to mediate the anticancer efficacy of 6-thioguanine.</a> Cancer Research. 76 (18), 5501-5511 (2016).</li>
<li>Carter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NUDT22+Is+a+UDP-glucose%2Fgalactose+hydrolase+exhibiting+a+unique+structural+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Human NUDT22 Is a UDP-glucose/galactose hydrolase exhibiting a unique structural fold.</a> Structure. 26 (2), 295-303 (2018).</li>
<li>Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTH1+inhibition+eradicates+cancer+by+preventing+sanitation+of+the+dNTP+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool.</a> Nature. 508 (7495), 215-221 (2014).</li>
<li>Page, B. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+NUDT5+inhibitors+block+hormone+signaling+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted NUDT5 inhibitors block hormone signaling in breast cancer cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 250(2018).</li>
<li>Zhang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+chemical+probe+against+NUDT15%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a chemical probe against NUDT15.</a> Nature Chemical Biology. 16 (10), 1120-1128 (2020).</li>
<li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+druggability+assessment+of+the+NUDIX+hydrolase+protein+family+as+a+workflow+for+target+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In silico druggability assessment of the NUDIX hydrolase protein family as a workflow for target prioritization.</a> Frontiers in Chemistry. 8, 443(2020).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67(1999).</li>
<li>Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+malachite+green+procedure+for+orthophosphate+determination+and+its+use+in+alkaline+phosphatase-based+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay.</a> Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).</li>
<li>Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+guidance+manual%5BTitle%5D)+AND+%22Eli+Lilly+%26+Company+and+the+National+Center+for+Advancing+Translational+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assay guidance manual.</a> Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+enzymology+in+drug+discovery%3A+a+fresh+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).</li>
<li>Tsesmetzis, N., Paulin, C. B. J., Rudd, S. G., Herold, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleobase+and+nucleoside+analogues%3A+resistance+and+re-sensitisation+at+the+level+of+pharmacokinetics%2C+pharmacodynamics+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Nucleobase and nucleoside analogues: resistance and re-sensitisation at the level of pharmacokinetics, pharmacodynamics and metabolism.</a> Cancers. 10 (7), 240(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De enzymgekoppelde activiteitstest die hier wordt beschreven, is een colorimetrische test met hoge doorvoer die de indirecte meting van dNTP-hydrolyse door SAMHD1 mogelijk maakt. Deze methode maakt gebruik van het vermogen van anorganisch PPase van E. coli, dat, wanneer het in overmaat in het reactiemengsel wordt opgenomen, elk anorganisch trifosfaat dat door SAMHD1 wordt gegenereerd, omzet in drie individuele vrije fosfaten die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van het eenvoudige en economische malachietgroene reagens. We leveren deze test in een 384 microwell-plaatformaat, dat ideaal is voor het screenen van samengestelde bibliotheken, en demonstreren de toepasbaarheid en veelzijdigheid van deze techniek bij de identificatie en karakterisering van SAMHD1-remmers, activatoren en substraten.
Zoals bij alle in vitro biochemische screeningstests, zijn er een aantal kritieke stappen en belangrijke overwegingen, en veel hiervan worden diepgaand besproken in de vrij beschikbare Assay Guidance Manual39. De integriteit van de gezuiverde recombinante enzymen, zowel SAMHD1 als het gekoppelde enzym anorganisch PPase, is uiterst belangrijk en moet worden bevestigd voordat de test wordt vastgesteld. En dienovereenkomstig moet elke nieuwe zuivering van deze enzymen worden onderworpen aan een bepaald niveau van batchtests, aangezien variabiliteit van batch tot batch inconsistenties in de resultaten kan veroorzaken. Idealiter zou het gebruik van een orthogonale directe assay, zoals HPLC, die detectie van zowel het substraat als het reactieproduct mogelijk maakt, moeten worden gebruikt om de dNTP-trifosfohydrolase-activiteit van het gezuiverde recombinant SAMHD1 dat wordt gebruikt, te verifiëren.
Wat de beperkingen van deze test betreft, is het principe één dat het de dNTPase-activiteit van SAMHD1 op een indirecte manier meet, waarbij gebruik wordt gemaakt van de activiteit van anorganisch PPase, wat een aantal implicaties heeft. Het is belangrijk om te bevestigen dat PPase weinig tot geen activiteit bezit ten opzichte van nucleotiden die in de test worden gebruikt, en evenzo dat geïdentificeerde remmende kleine moleculen geen activiteit bezitten ten opzichte van PPase. Met betrekking tot screening kan een tegenscreening tegen PPase dus een belangrijke overweging zijn. De aanwezigheid van PPase in de reactie maakt het ook van cruciaal belang om een orthogonale test te gebruiken om de bevindingen te bevestigen. Met betrekking tot directe activiteitstesten zijn er tot op heden een aantal gerapporteerd, waaronder TLC 9,20,23 en HPLC 9,21, die substraatuitputting en productvorming nauwkeurig detecteren. Bovendien zou de b4NPP-test21, die ook een hoge doorvoer heeft, kunnen worden gebruikt om potentiële remmers te testen; Het is echter niet ideaal om substraten of allosterische activatoren te testen. Biofysische tests, zoals differentiële scanning fluorimetrie (DSF), die we eerder hebben gerapporteerd met SAMHD118, kunnen ook bijzonder krachtig zijn bij het identificeren en karakteriseren van liganden. Een andere beperking van de test, specifiek zoals weergegeven in de opstelling hier voor het identificeren van substraten en activatoren, is het gebruik van de niet-hydrolyseerbare dGTP-analoog dGTPαS als een AS1- en AS2-activator. Hoewel dit activering van SAMHD1 mogelijk maakt zonder waarneembare activiteit in de test, is dGTPαS een competitieve remmer van SAMHD1, en dus zal het gebruik van hoge concentraties het enzym inactiveren. Naarmate ons begrip van SAMHD1 vordert, zouden toekomstige studies moleculen kunnen gebruiken die uitsluitend elke plaats van SAMHD1 bezetten, waardoor dit potentiële probleem teniet wordt gedaan.
Zoals we hier hebben laten zien, is deze methode veelzijdig en kan deze worden gebruikt om een aantal biochemische vragen te beantwoorden. We hebben twee varianten van deze test beschreven, één voor de identificatie van allosterische regulatoren en substraten van SAMHD1, en één voor de karakterisering van remmers, maar verdere aanpassingen kunnen worden gemaakt. Met betrekking tot potentiële remmers maakt deze test, die op microtiterplaten is gebaseerd, deze zeer geschikt voor stroomafwaartse onderzoeken naar het werkingsmechanisme39,40. Evenzo kan deze techniek voor verdere karakterisering van substraten en allosterische regulatoren worden gebruikt om kinetische parameters van katalyse te bepalen, zoals we hebben uitgevoerd voor de actieve metaboliet van cytarabine en clofarabine7. Een nadeel is echter dat de enzymgekoppelde test die hier wordt gerapporteerd een eindpunttest is, en dus, hoewel zeer geschikt voor screening, zou een continue test beter geschikt zijn voor sommige mechanistische studies. Arnold et al. rapporteerden een continue enzymgekoppelde test die gebruik maakt van de biosensor MDCC-PBP6, die berust op het gebruik van het periplasmatische fosfaatbindende eiwit (PBP) gelabeld met coumarinemaleimide (MDCC) fluorofoor dat kan binden aan een vrije fosfaatgroep. MDCC-PBP is zeer gevoelig en maakt het mogelijk om zeer lage fosfaatconcentraties te kwantificeren, waarbij de responstijd van de sensor in de tijdschaal van milliseconden tot seconden ligt.
SAMHD1 speelt een aantal belangrijke functies in de menselijke gezondheid en ziekte2 , waarvan er vele in verband kunnen worden gebracht met zijn centrale rol bij het handhaven van intracellulaire dNTP-niveaus1. Identificatie van een hoogwaardige chemische sonde in de richting van de dNTPase-activiteit van SAMHD1 zou dus een krachtig hulpmiddel zijn bij het definiëren van deze verbanden, en de enzymgekoppelde test die hier wordt gerapporteerd, zou gemakkelijk kunnen worden gebruikt om dergelijke sondes te identificeren. Bovendien, als nucleoside-gebaseerde geneesmiddelen, waarvan er vele worden gemoduleerd door SAMHD1, vormen ze een diverse en belangrijke groep therapeutische41; chemische sondes kunnen verder worden ontwikkeld tot geneesmiddelen om SAMHD1 in de klinische setting aan te pakken, met als doel de werkzaamheid van deze therapieën te verbeteren. Het is ook van cruciaal belang om de volledige omvang van de interactie van deze op nucleosiden gebaseerde verbindingen met SAMHD1 te begrijpen, een vraag die ook kan worden beantwoord met behulp van deze enzymgekoppelde test. Alles bij elkaar genomen is de enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest zoals hier gerapporteerd, een goedkope, veelzijdige test met hoge doorvoer die kan worden gebruikt om ons begrip van dit belangrijke enzym te vergroten.

Steriel alfamotief en histidine-aspartaatdomeinbevattend eiwit 1 (SAMHD1) is een centrale regulator van nucleotidehomeostase in zoogdiercellen1 met vele rollen in de gezondheid en ziekte van de mens2. Dit enzym is in staat om deoxynucleosidetrifosfaten (dNTP's) te hydrolyseren tot hun verwante deoxynucleoside- en anorganische trifosfaatmoleculen 3,4, waarbij deze activiteit allosterisch wordt gereguleerd door (d)NTP-abundantie (besproken in referentie5). Elk SAMHD1-monomeer bevat twee allosterische plaatsen (AS1 en AS2) en één katalytische plaats, en de vorming van het actieve enzym vereist de geordende assemblage van een homotetrameer bij (d)NTP-binding. Dimerisatie van SAMHD1-monomeren wordt eerst geactiveerd door de binding van een guaninetrifosfaat (GTP of dGTP) aan AS1, en daaropvolgende tetramerisatie wordt bereikt wanneer een extra dNTP-molecuul bindt aan AS2, waardoor substraattoegang tot de katalytische plaats en daaropvolgende hydrolyse mogelijk wordt.
SAMHD1-substraten omvatten de vier canonieke dNTP's 3,4 samen met enkele basische en suikergemodificeerde nucleotiden, waaronder de trifosfaatmetabolieten van verschillende op nucleosiden gebaseerde geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van virale infecties en kanker, waarvan er verschillende ook kunnen dienen als allosterische activatoren 6,7,8,9,10,11. Bijgevolg moduleert SAMHD1 de werkzaamheid van veel van deze verbindingen in ziektemodellen 7,8,9,10,11,12,13,14,15, en bovendien, in het geval van het deoxycytidine-analoog cytarabine (ara-C), dat al tientallen jaren standaardbehandeling is voor acute myeloïde leukemie (AML), dicteert het eigenlijk Werkzaamheid van de behandeling bij deze ziekte 7,8,16. SAMHD1 is dus een potentiële biomarker en therapeutisch doelwit om de werkzaamheid van op nucleosiden gebaseerde therapieën te verbeteren17, en dienovereenkomstig hebben wij en anderen geprobeerd strategieën te identificeren om SAMHD1 in cellen te inactiveren. We stelden het gebruik van viraal eiwit X (Vpx) voor als een biologische remmer om SAMHD1 aan te pakken voor afbraak in kankercellen7, maar deze benadering heeft een aantal beperkingen (besproken in referentie12), en we hebben onlangs ook een indirecte benadering gerapporteerd om SAMHD1-activiteit te onderdrukken via remming van ribonucleotide-reductase die we hebben aangetoond in verschillende modellen van AML18. Een aantal studies hebben geprobeerd kleine moleculen te identificeren die in staat zijn om SAMHD1 direct te remmen, en tot op heden zijn er verschillende van dergelijke moleculen gerapporteerd, maar alleen remming in vitro gedocumenteerd 6,9,19,20,21,22. Als gevolg hiervan onderstreept een gebrek aan kleine moleculen die de SAMHD1-activiteit in cellen krachtig remmen, in combinatie met de complexe mechanismen van SAMHD1-katalyse van nucleoside-gebaseerde therapieën, de noodzaak van verder onderzoek. Robuuste en idealiter high-throughput vatbare methoden voor het onderzoeken van de interactie van kleine moleculen met SAMHD1 zijn dus ideaal om substraten, allosterische regulatoren en remmers van dit klinisch relevante enzym te identificeren.
Er zijn verschillende methodologieën beschikbaar die de dNTPase-activiteit van SAMHD1 rechtstreeks meten, zoals dunnelaagchromatografie (TLC)9,20,23 en high-performance vloeistofchromatografie (HPLC)9,21, maar deze zijn niet gemakkelijk geschikt voor high-throughput-opstellingen. Een uitzondering is de test gerapporteerd door Mauney et al., die gebruik maakt van het vermogen van SAMHD1 om bis (4-nitrofenyl)fosfaat (b4NPP) te hydrolyseren tot p-nitrofenol en p-nitrofenylfosfaat wanneer Mn2+ wordt gebruikt als het activerende kation, wat resulteert in een colorimetrische verandering die gemakkelijk kan worden gemeten in een microtiterplaat21. Deze test is met succes gebruikt voor de identificatie en karakterisering van SAMHD1-remmers, maar er moet worden opgemerkt dat hydrolyse optreedt in afwezigheid van (d)NTP-activatoren en in de aanwezigheid van een waarschijnlijk niet-fysiologisch activerend kation, beide zijn belangrijke kanttekeningen om te overwegen. Dit maakt deze test ook minder toepasbaar op de studie en identificatie van allosterische regulatoren van SAMHD1.
In deze context kan een enzymgekoppelde benadering in combinatie met het malachietgroene reagens, zoals beschreven in dit rapport, een veelzijdige methode zijn om indirect de dNTPase-activiteit van SAMHD1 te meten en bovendien de impact van verschillende kleine moleculen daarop te onderzoeken. De malachietgroentest is een robuuste en betrouwbare colorimetrische techniek voor de detectie van vrij anorganisch fosfaat (Pi), gebaseerd op de vorming van een molybdofosforzuurcomplex dat leidt tot een colorimetrische verandering gemeten bij 620 nm24. Aangezien SAMHD1-hydrolyse de trifosfaatgroep vrijmaakt uit nucleotidesubstraten, is het dus noodzakelijk om deze reactie te koppelen aan een (pyro)fosfatase-activiteit, die vrij anorganisch fosfaat zal genereren, voorafgaand aan de toevoeging van het malachietgroene reagens. De malachietgroentest is gevoelig en kosteneffectief en wordt veel gebruikt voor de identificatie en karakterisering van remmers en substraten voor enzymen die anorganische fosfaatgroepen afgeven, hetzij in hun reacties, hetzij in aanwezigheid van een koppelingsenzym. Het is op grote schaal toegepast bij de karakterisering van de ATPase-activiteiten van helicasen 25,26,27, of de studie van CD73-enzymatische activiteit, die de afbraak van AMP tot adenosine en anorganisch fosfaat bemiddelt 28. Bovendien is het, wanneer het wordt gekoppeld, gebruikt bij de ontdekking van antibiotica die gericht zijn op de UDP-2,3-diacylglucosamine pyrofosfatase LpxH, een essentieel enzym in de meeste Gram-negatieve pathogenen29. Met betrekking tot kankeronderzoek is de enzymgekoppelde benadering uitgebreid ingezet tegen de NUDIO-hydrolasen, een familie van nucleotidemetaboliserende enzymen, zowel bij de karakterisering van substraten 30,31,32 als bij de identificatie en ontwikkeling van geneesmiddelen en chemische sondes 33,34,35,36.
Met betrekking tot het dNTPase SAMHD1 is deze benadering in verschillende rapporten gebruikt. Met behulp van exopolyfosfatase Ppx1 van Saccharomyces cerevisiae als koppelingsenzym, werd deze test gebruikt om verschillende nucleotide-analogen te testen als substraten, activatoren of remmers van SAMHD1, en resulteerde in de identificatie van de trifosfaatmetaboliet van het antileukemische geneesmiddel clofarabine als activator en substraat6. Bovendien is het, met anorganische pyrofosfatase van Escherichia coli als koppelingsenzym, gebruikt bij de screening van een bibliotheek van klinisch goedgekeurde verbindingen tegen SAMHD1 om remmers te identificeren20. In ons onderzoek gebruikten we deze benadering om aan te tonen dat ara-CTP, de actieve metaboliet van ara-C, een SAMHD1-substraat is, maar geen allosterische activator7 en gebruikten we deze test vervolgens om aan te tonen dat verschillende kleine moleculen die AML-modellen op een SAMHD1-afhankelijke manier konden sensibiliseren voor ara-C, SAMHD118 eigenlijk niet direct remden. In dit rapport zullen we deze veelzijdige methode in detail beschrijven en de toepasbaarheid ervan demonstreren, in een high-throughput ontvankelijke opstelling, voor de identificatie van remmers, activatoren en substraten van SAMHD1.

<table><tbody><tr><td>2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1001</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1002</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>2'-Deoxyguanosine-5'-(&alpha;-thio)-triphosphate (dGTP&alpha;S)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-424</td><td>Niet-hydrolyseerbaar dGTP analoog voor SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP)</td><td>GE Healthcare</td><td>27-1870-04</td><td>SAMHD1 allosterische activator en substraat gebruikt in remmingstest en activator/substraat test</td></tr><tr><td>2'-Deoxythymidine-5'-[(&alpha;,&beta;)-imido]triphosphate (dTMPNPP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-907-1</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 remmingstest</td></tr><tr><td>2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1004</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0901</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 remmingstest</td></tr><tr><td>384 well clear flat-bottom&nbsp; microplate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>262160</td><td>Testplaat</td></tr><tr><td>96 well clear U-bottom polypropylene&nbsp; microplate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267245</td><td>Verdunningsplaat</td></tr><tr><td>Ammonium heptamolybdate tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td>Reagens vereist voor malachietgroen werkreagens</td></tr><tr><td>ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1170</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-874</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>VWR</td><td>23486.297</td><td>Oplosmiddel</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>EDTA stopoplossing component</td></tr><tr><td>Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP)</td><td>Jena bioscience</td><td>NU-1607</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Prism 8</td><td>Gegevensanalyse en visualisatie</td></tr><tr><td>Guanosine 5&prime;-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>Allosterische activator voor SAMHD1 activator/substraat test</td></tr><tr><td>His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase&nbsp; (PPase)</td><td>Geproduceerd in huis met behulp van Protein Science Facility, Karolinska Institutet</td><td>-</td><td>Recombinant PPase-eiwit, hydroliseert anorganisch trifosfaat en pyrofosfaat tot orthofosfaat zodat het een complex kan vormen met malachietgroen</td></tr><tr><td>His-tagged human SAMHD1</td><td>Geproduceerd in huis met behulp van Protein Science Facility, Karolinska Institutet</td><td>-</td><td>Recombinant SAMHD1-eiwit, hydroliseert dNTP's in zijn overeenkomstige nucleoside en anorganisch trifosfaat</td></tr><tr><td>Hydroxyurea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8627</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 remmingstest</td></tr><tr><td>Lomofungin</td><td>National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP)</td><td>NSC106995</td><td>Verbinding getest in SAMHD1 remmingstest</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>SAMHD1 reactiebuffer component</td></tr><tr><td>Malachite green Carbinol hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213020</td><td>Malachietgroen stock component</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Hidex</td><td>Hidex Sense Microplate reader</td><td>Gegevensverwerving, absorptie meting bij 630 nm golflengte</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td>SAMHD1 reactiebuffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>SAMHD1 reactiebuffer component</td></tr><tr><td>Sodium phosphate (Na3PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>Vereist voor fosfaat standaardcurve</td></tr><tr><td>Sulphuric acid 95-97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84720</td><td>Malachietgroen stock component</td></tr><tr><td>Tris-Acetate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1258</td><td>SAMHD1 reactiebuffer component</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>SAMHD1 reactiebuffer component</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>SAMHD1 reactiebuffer en malachietgroen werkreagens component</td></tr></tbody></table>

een high-throughput enzymgekoppelde activiteitstest om de interactie van kleine moleculen met het dntpase samhd1 te onderzoeken

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Steriel alfamotief en ZvH-domeinbevattend eiwit 1 (SAMHD1) is een cruciale regulator van intracellulaire deoxynucleosidetrifosfaat (dNTP)-pools, omdat dit enzym dNTP's kan hydrolyseren tot hun overeenkomstige nucleosiden en anorganische trifosfaten. Vanwege zijn cruciale rol in het nucleotidemetabolisme, de associatie met verschillende pathologieën en zijn rol bij therapieresistentie, wordt momenteel intensief onderzoek gedaan naar een beter begrip van zowel de regulatie als de cellulaire functie van dit enzym. Om deze reden is de ontwikkeling van eenvoudige en goedkope high-throughput vatbare methoden om de interactie van kleine moleculen met SAMHD1 te onderzoeken, zoals allosterische regulatoren, substraten of remmers, van vitaal belang. Voor dit doel is de enzymgekoppelde malachietgroene test een eenvoudige en robuuste colorimetrische test die kan worden ingezet in een plaatformaat van 384 microwells, waardoor de indirecte meting van SAMHD1-activiteit mogelijk is. Aangezien SAMHD1 de trifosfaatgroep vrijgeeft uit nucleotidesubstraten, kunnen we een pyrofosfatase-activiteit aan deze reactie koppelen, waardoor anorganisch fosfaat wordt geproduceerd, dat kan worden gekwantificeerd door het malachietgroene reagens door de vorming van een fosfomolybdaatmalachietgroen complex. Hier tonen we de toepassing van deze methodologie om bekende remmers van SAMHD1 te karakteriseren en om de mechanismen te ontcijferen die betrokken zijn bij SAMHD1-katalyse van niet-canonieke substraten en regulatie door allosterische activatoren, geïllustreerd door nucleoside-gebaseerde antikankergeneesmiddelen. De enzymgekoppelde malachietgroene test is dus een krachtig hulpmiddel om SAMHD1 te bestuderen en kan bovendien ook worden gebruikt bij de studie van verschillende enzymen die fosfaatsoorten afgeven.

Het protocol dat in figuur 1 wordt beschreven, beschrijft de basisworkflow voor het gebruik van de enzymgekoppelde malachietgroene test om de interactie van kleine moleculen met het dNTPase SAMHD1 te onderzoeken en kan op een aantal manieren worden aangepast om verschillende biochemische vragen te ondervragen. In de representatieve resultaten die in de onderstaande paragrafen worden besproken, illustreren we voorbeelden van het gebruik van deze test om de remmende eigenschappen van kleine moleculen in de richting van SAMHD1 te bepalen en om te testen of verschillende nucleotide-analogen substraten en/of activatoren van dit enzym zijn.
De resultaten in figuur 2 illustreren een aantal kernprincipes van deze test. Het malachietgroene reagens maakt de colorimetrische detectie van anorganisch fosfaat mogelijk door de vorming van een fosfomolybdaatmalachietgroen complex, en dienovereenkomstig kan deze benadering worden toegepast op de studie van enzymatische reacties waarvan het product fosfaat is. Om de gevoeligheid van deze methode voor de detectie van vrij anorganisch fosfaat aan te tonen, worden in figuur 2A de extinctiewaarden weergegeven die worden verkregen bij toenemende concentraties van Na3PO4 na een incubatie van 20 minuten met het malachietgroene reagens. Terwijl het signaal een verzadiging bereikt bij 0,25 mM Na3PO4, is het lineaire detectiebereik van fosfaat zichtbaar van 0,004 tot 0,03 mM (Figuur 2A, rechterpaneel), in overeenstemming met andere studies die een lineair fosfaatbereik tot 10-20 μM rapporteerden met behulp van de malachietgroene test38.
SAMHD1 is een dNTPase dat anorganisch trifosfaat afgeeft bij het hydrolyseren van een dNTP-molecuul, en dus is een koppelingsenzym nodig om vrij anorganisch fosfaat te genereren voor detectie door malachietgroen. Anorganische pyrofosfatase (PPase) uit E. coli is hiervoor nuttig gebleken, zowel met betrekking tot SAMHD1 7,20, maar ook met betrekking tot andere nucleotidemetaboliserende enzymen 30,33,35. Bovendien is SAMHD1 een actief dNTPase als homotetrameer, en dit vereist allosterische activering door (d)NTP's, met name een guaninetrifosfaat (GTP of dGTP) bij AS1 en elk dNTP bij AS2. Vervolgens wordt de katalytische plaats toegankelijk voor substraatbinding en vindt de enzymatische reactie plaats. Aangezien dGTP voldoet aan de vereisten voor binding aan AS1 en AS2 en een substraat is, vereenvoudigt het gebruik van dit nucleotide in de remmingstest de workflow aanzienlijk. Figuur 2B illustreert de eis van de verschillende testcomponenten om meetbare SAMHD1-activiteit te bereiken, aangegeven door een toename van de absorptie bij 630 nm. Noch SAMHD1, noch PPase alleen zijn in staat om anorganisch fosfaat te genereren in aanwezigheid van dGTP, in overeenstemming met de gedocumenteerde activiteiten van deze enzymen. In de toestand waarin alle testcomponenten aanwezig zijn (SAMHD1, PPase en de dGTP-activator/substraat) zien we echter een toename van het signaal. De Z-factor37 van het hier getoonde voorbeeld (waarbij geen enzymen + dGTP als negatieve controle en SAMHD1/PPase + dGTP als positieve controle worden genomen) was 0,74, wat wijst op een robuuste test.
Een van de mogelijke toepassingen van de enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest is de identificatie van remmers door middel van high-throughput screening (HTS). Daarom valideren we in dit rapport de detectie van SAMHD1-remming in deze test met behulp van een diverse reeks verbindingen die al in de literatuur zijn beschreven. Seamon et al. evalueerden de dosisafhankelijke remming van canonieke nucleosiden tegen SAMHD1 met behulp van een vergelijkbare test als hier getoond, en ontdekten dat deoxyguanosine (dGuo) het enige canonieke nucleoside was dat SAMHD1 significant kon remmen, met een IC50-waarde van 488 μM20. Een HTS van door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen uitgevoerd met de directe b4NPP-test onthulde verschillende treffers die de SAMHD1-activiteit remden bij micromolaire concentraties, waarvan lomofungine het molecuul was dat de SAMHD1 dNTPase-activiteit in vitro het krachtigst remde, met een IC50 van 20,1 μM wanneer bepaald in aanwezigheid van dGTP als substraat21. Bovendien zijn de vier α,β-imido-dNTP-analogen ook geïdentificeerd als competitieve remmers van SAMHD1 met behulp van de MDCC-PBP-sensor en SAMHD1 gekoppeld aan Ppx-activiteit, wat aantoonde dat de remmende constanten van de dNMPNPP-analogen zich in het lage micromolaire / hoge nanomolaire bereik 6,22 bevonden. Om aan te tonen dat de enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest kan worden gebruikt om SAMHD1-remmers te identificeren, werden dGuo, lomofungine en 2'-deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]trifosfaat (dTMPNPP) gebruikt om de techniek te valideren. Figuur 3A illustreert de dosis-responscurves die voor deze verbindingen zijn verkregen, en laat zien dat toenemende concentraties de SAMHD1-activiteit effectief remmen. De gemiddelde IC50-waarden verkregen voor deze moleculen uit drie onafhankelijke experimenten (± standaarddeviatie) waren als volgt: dGuo = 361,9 ± 72,8 μM, lomofungine 6,78 ± 3,9 μM en dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 μM. Als voorbeeld van een negatief resultaat werd ook de impact van hydroxyurea (HU) op de SAMHD1-activiteit bepaald. HU is een remmer van ribonucleotidereductase, en hoewel het de activiteit van SAMHD1 ara-CTPase in verschillende AML-modellen beperkt, bleken de effecten van HU op SAMHD1 indirect te zijn en afhankelijk te zijn van het verstoren van de allosterische regulatie van SAMHD118. De dosis-responscurve van HU wordt weergegeven in figuur 3B en er werden geen veranderingen in SAMHD1-activiteit waargenomen bij toenemende HU-doses, wat aantoont dat HU de SAMHD1-activiteit in vitro niet remt.
Een ander gebruik van de enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest is om te onderzoeken of nucleotiden en hun analogen substraten en/of allosterische activatoren van dit enzym zijn, wat wordt geïllustreerd in figuur 4. In dit experiment werden canonieke nucleotiden, evenals de actieve metabolieten van verschillende nucleoside-analogen tegen kanker, zoals cytarabine (ara-CTP), clofarabine (Cl-F-ara-ATP) en gemcitabine (dF-dCTP), getest als SAMHD1-substraten en activatoren. Vanwege de complexe allosterische regulatie van SAMHD1 wordt de reactie uitgevoerd in aanwezigheid van GTP als AS1-activator of het niet-hydrolyseerbare dGTP-analoog 2'-deoxyguanosine-5'-(α-thio)-trifosfaat (dGTPαS), dat AS1 en AS2 kan bezetten. SAMHD1-activiteit in aanwezigheid van het geteste nucleotide-analoog en GTP geeft aan dat het nucleotide in staat is om te binden aan de secundaire allosterische plaats en katalytische plaats (d.w.z. AS2-activator en substraat), terwijl SAMHD1-activiteit met de nucleotide-analoog en dGTPαS aangeeft dat het nucleotide alleen de katalytische plaats kan bezetten (d.w.z. alleen een substraat). Als het nucleotide in staat is om te binden aan zowel de allosterische AS1- als de AS2-site en aan de katalytische site, zal SAMHD1 actief zijn in aanwezigheid van het nucleotide alleen, zoals aangetoond in het geval van dGTP. De resultaten laten zien dat alle canonieke dNTP's in staat zijn om te binden aan de AS2-site en aan de katalytische site. In het geval van nucleotide-analogen is clofarabinetrifosfaat een AS2-activator en een substraat, terwijl cytarabinetrifosfaat alleen de katalytische plaats kan bezetten. Aan de andere kant werd er geen activiteit waargenomen met gemcitabinetrifosfaat, wat suggereert dat gemcitabinetrifosfaat onder de geteste omstandigheden niet in staat is om als allosterische effector of substraat te werken. Hoewel dit resultaat consistent is met eerdere voorspellingen9, toonden latere kristallisatie- en kinetische studies10 aan dat gemcitabinetrifosfaat in staat is om de SAMHD1-katalytische pocket te binden en dat het inderdaad een substraat van het enzym is. In de laatste studie10 laten de auteurs echter zien dat de hydrolysesnelheid aanzienlijk lager is in vergelijking met andere gerapporteerde substraten, zoals cytarabinetrifosfaat, wat verklaart waarom we dit niet konden waarnemen met deze screeningsopstelling.
Al met al valideren deze representatieve resultaten het gebruik van de enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest als een robuuste techniek voor de identificatie en karakterisering van SAMHD1-remmers, allosterische regulatoren en substraten. Echter, net als bij alle experimentele benaderingen, heeft deze methode zijn kanttekeningen, en daarom moeten orthogonale assays (bijvoorbeeld met behulp van een andere assay-technologie) worden gebruikt om bevindingen verder te valideren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig02.jpg"> Figuur 2: Enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest. (A) Na3PO4 standaardcurve in de malachietgroene test. Na3PO4 seriële verdunning (2-voudig) werd bereid van 1 mM tot 0,004 mM in drievoud en gedurende 20 minuten geïncubeerd met malachietgroen reagens. Ruwe extinctiewaarden over het volledige bereik van geteste concentraties worden weergegeven in het linkerpaneel en het lineaire bereik in het rechterpaneel. Representatief voor twee onafhankelijke experimenten getoond. (B) Validatie van de enzymgekoppelde activiteitstest. SAMHD1 (0,35 μM) en/of PPase (12,5 E/ml) in de aan- of afwezigheid van activator/substraat dGTP (25 μM) werden gedurende 20 minuten geïncubeerd in de enzymgekoppelde activiteitstest. Vierlingen van een vertegenwoordiger van twee onafhankelijke experimenten met ruwe absorptiewaarden uitgezet, balken en foutbalken geven het gemiddelde en SD aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig03.jpg"> Figuur 3: Evaluatie van verbindingen voor SAMHD1-remming in de enzymgekoppelde activiteitstest. Dosisrespons van lomofungine (0,78-100 μM), 2'-deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]trifosfaat (dTMPNPP, 0,01-100 μM) en deoxyguanosine (dGuo, 10-1.500 μM) (A) of hydroxyureum (HU) (0,78-100 μM) (B) in de enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest met dGTP (25 μM) als activator/substraat. Procentuele activiteit ten opzichte van reactiecontroles van individuele replicaten uitgezet (DMSO + SAMHD1/PPase + dGTP = 100% activiteit, DMSO + dGTP = 0% activiteit) met een vertegenwoordiger van drie getoonde experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62503/62503fig04.jpg"> Figuur 4: Evaluatie van nucleotide-analogen als SAMHD1-allosterische activatoren en substraten in de enzymgekoppelde activiteitstest. Canonieke nucleotiden en geselecteerde trifosfaatmetabolieten van antikankergeneesmiddelen cytarabine (ara-CTP), clofarabine (Cl-F-ara-ATP) en gemcitabine (dF-dCTP) werden getest bij 200 μM in de enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest in de aan- of afwezigheid van GTP of niet-hydrolyseerbare dGTP-analoog dGTPαS (12,5 μM). Genormaliseerde absorptiewaarden van individuele experimentele replicaten uitgezet, gemiddelde en SD worden aangegeven. Representatief voor twee onafhankelijke experimenten getoond, aangepast van onze vorige studie7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62503/62503fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Stap</td>
			<td>Reagens</td>
			<td>Gedoseerd volume (μL)</td>
			<td>Volume eindreactie (μL)</td>
			<td>Concentratie afgegeven</td>
			<td>Vouwverdunning in reactie</td>
			<td>Eindconcentratie in reactie</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>5</td>
			<td rowspan="3">20</td>
			<td>0,4 mM</td>
			<td>4</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>SAMHD1+PPase mix</td>
			<td>5</td>
			<td>1,4 μM SAMHD1, 50 E/ml PPase</td>
			<td>4</td>
			<td>0,35 μM SAMHD1, 12,5 E/ml Ppase</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>dGTP</td>
			<td>10</td>
			<td>50 μM</td>
			<td>2</td>
			<td>25 μM</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td colspan="6">Incubatie gedurende 20 minuten</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>EDTA-oplossing</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>7,9 mM</td>
			<td>2</td>
			<td>3,95 mM</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>MG-reagens</td>
			<td>10</td>
			<td>50</td>
			<td>2,5 mM Malachietgroen, 64,4 mM Ammoniummolybdaat, 0,18% Tween-20</td>
			<td>5</td>
			<td>0,5 mM Malachietgroen, 12,9 mM Ammoniummolybdaat, 0,036% Tween-20</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td colspan="6">Incubatie gedurende 20 minuten</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td colspan="6">Lezen @ 630 nm</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Samenvatting van de eindvoorwaarden in de enzymgekoppelde test voor de screening van remmers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Stap</td>
			<td>Reagens</td>
			<td>Gedoseerd volume (μL)</td>
			<td>Volume eindreactie (μL)</td>
			<td>Concentratie afgegeven</td>
			<td>Vouwverdunning in reactie</td>
			<td>Eindconcentratie in reactie</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Allosterische regelaar</td>
			<td>5</td>
			<td rowspan="3">20</td>
			<td>800 μM</td>
			<td>4</td>
			<td>200 μM</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>GTP of dGTPαS</td>
			<td>5</td>
			<td>50 μM</td>
			<td>4</td>
			<td>12,5 μM</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>SAMHD1 en/of PPase</td>
			<td>10</td>
			<td>0,7 μM SAMHD1, 25 E/ml PPase</td>
			<td>2</td>
			<td>0,35 μM SAMHD1, 12,5 E/ml PPase</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td colspan="6">Incubatie gedurende 20 minuten</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>EDTA-oplossing</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>7,9 mM</td>
			<td>2</td>
			<td>3,95 mM</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>MG-reagens</td>
			<td>10</td>
			<td>50</td>
			<td>2,5 mM Malachietgroen, 64,4 mM Ammoniummolybdaat, 0,18% Tween-20</td>
			<td>5</td>
			<td>0,5 mM Malachietgroen, 12,9 mM Ammoniummolybdaat, 0,036% Tween-20</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td colspan="6">Incubatie gedurende 20 minuten</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td colspan="6">Lezen @ 630 nm</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Samenvatting van de eindvoorwaarden in de enzymgekoppelde test voor screening op allosterische regulatoren

SAMHD1 is een deoxynucleosidetrifosfaattrifosfohydrolase met een cruciale rol in de gezondheid en ziekte van de mens. Hier presenteren we een veelzijdige enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest, ingezet in een microplaatformaat met 384 putjes, die de evaluatie van kleine moleculen en nucleotide-analogen als SAMHD1-substraten, activatoren en remmers mogelijk maakt.

Een high-throughput enzymgekoppelde activiteitstest om de interactie van kleine moleculen met het dNTPase SAMHD1 te onderzoeken

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Deze methode stelt ons in staat om te karakteriseren welke chemotherapiegeneesmiddelen worden gehydrolyseerd door SAMHD1 en kan worden gebruikt als een screeningstest om kleine molecuulremmers van dit enzym te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en goedkoop is en een enorme hoeveelheid informatie oplevert over hoe verschillende kleine moleculen interageren met dit enzym. De procedure wordt gedemonstreerd door Miriam, een postdoc uit de groep.Bereid om te beginnen een volledige SAMHD1-reactiebuffer voor door Tween-20 en TCEP toe te voegen aan de eindconcentraties van respectievelijk 0,005% en 0,3 millimolaar. Bereid EDTA-stopoplossing voor door EDTA toe te voegen aan een eindconcentratie van 7,9 millimolair in de volledige SAMHD1-reactiebuffer. Bereid malachietgroene of MG-werkoplossing voor door 10 delen MG-voorraadoplossing te mengen met 2,5 delen 7%ammoniummolybdaat en 0,2 delen 11%Tween-20.Verdun de testverbindingen met behulp van een meerkanaalspipet serieel in het desbetreffende oplosmiddel tot 100 keer de uiteindelijke concentratie in een doorzichtige polypropyleen plaat met 96 putjes met ronde bodem. verdun deze verbindingen verder tot 25 keer de uiteindelijke concentratie met volledige SAMHD1-reactiebuffer om de uiteindelijke concentratie van het oplosmiddel onder de 1% te houdenBreng vijf microliter verdunde component over naar de juiste putjes van een doorzichtige testplaat met platte bodem van 384 putjes en herhaal de procedure met controlemonsters met alleen oplosmiddelen. Verdun voor de bereiding van het enzymmastermengsel het recombinante humane SAMHD1-eiwit en de recombinante pyrofosfatase in een volledige SAMHD1-reactiebuffer tot vier keer de gewenste eindconcentratie.Bereid activator of substraat dGTP voor door de oplossing te verdunnen in een volledige SAMHD1-reactiebuffer om een concentratie van 50 micromolaire te bereiken. Aan de putjes met samengestelde verdunningen en alleen oplosmiddelcontrole, doseer vijf microliter SAMHD1 pyrofosfatase-mastermix en voeg aan de geen enzymcontroleputjes vijf microliter volledige SAMHD1-reactiebuffer toe. Doseer vervolgens 10 microliter dGDP-oplossing in alle putjes om de reactie te starten en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Om de reactie te stoppen, voegt u 20 microliter EDTA-stopoplossing toe. Nadat u 10 microliter MG-werkoplossing aan alle putjes hebt toegevoegd, mengt u de inhoud met behulp van een orbitale microtiterplaatschudder en centrifugeert u de plaat gedurende één minuut bij 1000 x g. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en lees de absorptie af op 630 nanometer in een microtiterplaatlezer.Bereken de standaarddeviatie van de positieve controleputjes en bereken vervolgens het gemiddelde. Bereken op dezelfde manier voor de negatieve controleputten de standaarddeviatie en bereken vervolgens het gemiddelde. Bereken de Z-factor is een indicator van de kwaliteit van de test.Normaliseer elke extinctiewaarde naar de gemiddelde waarden van positieve en negatieve controles. De positieve controle instellen als 100%SAMHD1 activiteit en de negatieve controle als 0%SAMHD1 activiteit. De SAMHD1-activiteit van de grafiek is een functie van de concentratie van de verbinding en past in een dosisresponscurve met vier parameters voor variabele helling, waardoor de halve maximale remmende concentratie van de verbinding kan worden bepaald.Verdun nucleotide-analoge voorraden en vul de SAMHD1-reactiebuffer aan tot vier keer de uiteindelijke concentratie en breng vijf microliter over naar de juiste putjes van een assayplaat met 384 putjes. Om enzym SAMHD1 of pyrofosfatase-mastermix te bereiden, verdunt u recombinant humaan SAMHD1-eiwit en Escherichia coli-pyrofosfatase in een volledige SAMHD1-reactiebuffer tot tweemaal de gewenste eindconcentratie. Bereid alleen pyrofosfatase-oplossing door recombinant Escherichia coli-pyrofosfatase te verdunnen tot tweemaal de gewenste eindconcentratie in volledige SAMHD1-reactiebuffer.Bereid op dezelfde manier activatoren GTP en dGTP alpha S voor door de voorraad in volledige SAMHD1-reactiebuffer te verdunnen tot vier keer de uiteindelijke concentratie. Doseer vijf microliter van de activator, ofwel GDP of dGTP alfa S of volledige SAMHD1-reactiebuffer in de juiste putjes van een 384-wells assayplaat die de nucleotide-analogen bevat. Start de reactie door 10 microliter SAMHD1 pyrofosfatase-mastermix, pyrofosfatase alleen of volledige SAMHD1-reactiebuffer in de juiste putjes te doseren en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.Voeg na het stoppen van de reactie met behulp van EDTA-stopoplossing 10 microliter MG-werkoplossing toe aan alle putjes. Zodra de inhoud is gemengd, centrifugeert u de plaat gedurende één minuut op 1000 x g en incubeert u gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Meet vervolgens de extinctie op 630 nanometer.Bereken de gemiddelde extinctiewaarden voor de reactieputjes met alleen pyrofosfatase, die de achtergrondwaarde zullen zijn. Trek vervolgens de achtergrondwaarde af van de corresponderende putjes in de SAMHD1- of pyrofosfatasereacties. Zet ten slotte de gecorrigeerde absorptiewaarden voor elk nucleotide-analoog uit met buffer GTP- en dGTP-alfa-S-omstandigheden.In de huidige studie nam het absorptiemiddel toe met toenemende natriumfosfaatconcentratie na incubatie met malachietgroen reagens en bereikte het een verzadiging bij een concentratie van 0,25 millimolair. Het lineaire detectiebereik van fosfaat is zichtbaar van 0,004 tot 0,03 millimolair. De vereiste van testcomponenten om meetbare SAMHD1-activiteit te bereiken, wordt geïllustreerd.Noch SAMHD1, noch pyrofosfatase alleen zou een organisch fosfaat kunnen genereren in aanwezigheid van dGTP. Wanneer echter alle testcomponenten aanwezig waren, werd een toename van het signaal waargenomen. De dosis-responscurves verkregen voor SAMHD1-remmerverbindingen toonden aan dat toenemende concentraties de SAMHD1-activiteit effectief remmen.Hydroxyurea remt de SAMHD1-activiteit in vitro niet, wat werd aangegeven door onaangetaste SAMHD1-activiteit bij toenemende hydroxyureadoses. dGTP-binding aan beide allosterische plaatsen activeert SAMHD1, waardoor daaropvolgende hydrolyse van dit nucleotide mogelijk is, terwijl de andere drie canonieke dNTP's eerst GTP-activering van de eerste allosterische plaats vereisen voordat ze de tweede allosterische plaats kunnen binden en vervolgens op de katalytische plaats kunnen worden gehydrolyseerd. Voor nucleotide-analogen is clofarabinetrifosfaat een allosterische plaats twee-activator en een substraat als activiteit wordt waargenomen in aanwezigheid van GTP.Terwijl cytarabinetrifosfaat alleen in staat is om de katalytische plaats in te nemen, omdat dGTP-alfa S nodig is om activiteit waar te nemen. Er werd geen activiteit waargenomen met gemcitabinetrifosfaat. Na de identificatie van kleine moleculen die SAMHD1 in deze test remmen door middel van fysieke benaderingen, zoals thermische verschuivingstests, kan worden gebruikt om de betrokkenheid van het doelwit te ondervragen.De hier getoonde methode heeft ons geholpen te begrijpen welke van de kankermedicijnen kunnen worden gehydrolyseerd door SAMHD1 en dit enzym vast te stellen als een potentieel therapeutisch doelwit om resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen.

a-high-throughput-enzyme-coupled-activity-assay-to-probe-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Een zeer parallelle methode voor het meten van het site-specifieke decolleté van DNA op het niveau van één molecuul wordt beschreven. Dit protocol toont de techniek met behulp van de beperking endonuclease NdeI. De methode kan eenvoudig worden aangepast om elk proces dat resulteert in site-specifieke DNA-decolleté te bestuderen.

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

Hier beschreven is een gevestigde methode om de mate van HIV-1 beperking te bepalen door het cellulaire remmende eiwit SAMHD1. Menselijke myeloïde afstamming U937-cellen worden getransduceerd met een SAMHD1-expressievector die YFP co-expressie geeft, gedifferentieerd en vervolgens uitgedaagd met HIV-RFP. Het niveau van beperking wordt bepaald door flowcytometrie-analyse.

Analyse van SAMHD1-beperking door flowcytometrie in humane myeloïde U937-cellen

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Snelle en nauwkeurige chemische tests om te screenen op specifieke remmers zijn een belangrijk hulpmiddel in het arsenaal aan geneesmiddelenontwikkeling. Hier presenteren we een schaalbare acetyl-klikchemietest om de remming van HAT1-acetyleringsactiviteit te meten.

Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

Leer een high-throughput enzymgekoppelde malachietgroen-assay om de activiteit en inhibitie van SAMHD1 te karakteriseren. Deze methode meet indirect de enzymactiviteit door anorganisch fosfaat te kwantificeren.

Een high-throughput enzymgekoppelde activiteitstest om de interactie van kleine moleculen met het dNTPase SAMHD1 te onderzoeken

Meer video's verkennen