Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus Expression Vector System

Het algemene doel van dit protocol is expressie screening van meervoudige constructie van eiwit arginine methyltransferases in grootschalige productie om de milligram hoeveelheid van het eiwit te verkrijgen voor biochemische, biofysische en structurele studies in het medium ondersteunde, kostenefficiënte modus in de dekking van expressieplatform S, baculovirus expressie vector systeem. Dr.Alma Seitova zal de volgende stappen presenteren. Verdun de exponentieel groeiende SF9-cellen tot de uiteindelijke celdichtheid van 0,4 miljoen per mil in de serumvrije insectenmedia en giet in het steriele reagensreservoir.

Gebruik een programmeerbare meerkanaals pipet om 0,5 mils van de verdunde SF9-cellen naar elke put van de 24-putplaat te zaaien. Dit volume is voldoende om een gelijkmatige dekking van het werkoppervlak van de put te garanderen. Tegelijkertijd verdunt het de transfectiemix niet te veel, wat transfectie-efficiëntie mogelijk maakt.

Label één put van de plaat alleen als cel en gebruik deze als een controle voor de vergelijking van de getransfecteerde en niet-getransfecteerde cel om te beoordelen op mogelijke tekenen van infectie. Incubeer de platen op 27 graden tot het nodig is, ongeveer een uur, om de cellen zich aan de celkweekplaten te laten hechten. Verdun goed gemengd transfectiereagens in het niet-aangevulde insectenmedium en een steriel reagensreservoir en meng voorzichtig gedurende 10 seconden.

Breng met behulp van een 12-kanaals pipet 102 microliters van het verdunde transactiereagens over in een steriele 96 MicroWell-plaat. Breng 10 microliter van 0,2 microgram per microliter recombinant bacmide-DNA over in de overeenkomstige put van de 96-well MicroWell-plaat en meng door zachtjes te schudden en de plaat van de zijkanten te tikken. Incubeer de transfectiemix gedurende 15 tot 20 minuten voor een complexe formatie.

Met behulp van een verstelbare zeskanaals pipet die is ontworpen voor de overdracht tussen een 96- en 24-putplaat, bedekt u de transfectiemix op de cellen in overeenkomstige putten van de transfectieplaten en incubeert u gedurende vier uur bij 27 graden. Om een gelijkmatige verdeling van de transfectiemix over de monolaag van de cellen te garanderen, schommelt u de platen tijdens de incubatietijd voorzichtig meerdere keren heen en weer. Voeg vier tot vijf uur na transfectietijd 1,5 mils serumvrije insectenmedia toe.

Vul het aan met 10% finale van warmte-inactief foetale runderserum en 1% antibioticum en antimycoticum. Incubeer cellen in een incubator van 27 graden gedurende 72 tot 96 uur. Schommel indien mogelijk één keer per dag voorzichtig met de transfectieplaten.

Zoek naar tekenen van infectie die zichtbaar zijn in getransfecteerde cellen op 72 tot 96 uur na transfectietijd. Vier tot vijf dagen na transfectie moeten tekenen van infectie zichtbaar zijn in de getransfecteerde cellen in vergelijking met de controlecellen onder een omgekeerde microscoop, en de eerste recombinante baculovirussen die in het celkweekmedium worden uitgescheiden, moeten klaar zijn om te verzamelen. Gebruik een programmeerbaar elektronisch meerkanaals om tegelijkertijd de verzameling van P1-virussen mogelijk te maken, de infectie van vers gezaaide SF9-cellen in de infectie van suspensiecellen in hun 24 putblokken met 150 microliters van de P1-virussen.

Draai de rest van de collectieve P1 virale voorraden gedurende 15 minuten, bedek de 24 putblokken met suspensiecultuur van de geïnfecteerde SF9-cellen met een AirPore-vel. Incubeer de 24 putblok op 27 graden met schudden bij 245 RPMs gedurende 72 tot 96 uur. Vier dagen voor de geplande productietijd splitste exponentieel groeiende SF9-cellen, met een uiteindelijke celdichtheid van 2 miljoen per mil in Erlenmeyer glasshake floss met baffles in serumvrije insectenmedia met 1% definitief antibioticum en antimycoticum.

Deze stap genereert suspensiecultuur van geïnfecteerde insectencellen en P2-virussen in het supernatant voor de infectie van nieuwe cellen in de productiebatch. Voeg de overeenkomstige P2-virussen toe en incubeer geïnfecteerde cellen bij de lagere temperatuur van 25 graden om de celgroei te vertragen, schuddend bij 165 RPMs op een orbitale shaker met een slag van één inch. Vier dagen voor de geplande productietijd zaait Seed twee liter exponentieel groeiende SF9-cellen in insectenserumvrije media tot de celdichtheid van 1 miljoen per mil, in de 2,8 liter Fernbach-shakekolf.

Schud de kolf op 27 graden met schudden bij 150 RPMs. Onderzoekswetenschapper Ashley Hutchinson zal het volgende protocol demonstreren. Splits vier liter exponentieel groeiende SF9-cellen en insectenserumvrije media tot de uiteindelijke celdichtheid van 4 miljoen per mil in de grote reagensflessen van vijf liter.

Voeg 10 tot 12 mils van de suspensiecultuur van de met baculovirus geïnfecteerde insectencellen toe. Incubeer de geïnfecteerde cultuur van de SF9-cellen in een shaker die 145 RPM schudt bij een lagere temperatuur van 25 graden Celsius gedurende 72 tot 96 uur. Milligramhoeveelheden van verschillende recombinante eiwitten uit de PRMT-familie drukken zich uit in de onmiddellijke productie van het baculovirus in SF9-cellen en worden gebruikt voor biochemische biofysische instructiestudies, zoals te zien is in figuur vijf.

Bij sgc, werden de kristalstructuren opgelost in gedeponeerd in de eiwitdatabank voor de volledige lengte of afgeknotte vormen van de proteïnen PRMT4, 6, 7, en 9 met diverse chemische sonde en inhibitoren. Expressieplasmiden voor deze PRMT's werden gedeponeerd om genverzameling door SGC toe te voegen en zijn beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap. In deze video hebben we de nadruk gelegd op belangrijke elementen voor een succesvolle expeditiescreening van hun meervoudige constructie van de eiwit arginine methyltransferases in de grootschalige productie in het baculovirus expressiesysteem.

Het gebruik van de reguliere verstelbare en programmeerbare meerkanaals pipetten maakte hun hele proces sneller dan efficiënt. Gebruik van hoogwaardige en minder celtoxische cellen voor de cellen, transfectiereagens voor de generatie van recombinante virussen leidde tot kostenefficiënter en dit transfectieprotocol voor celbehandeling. Infectie van de grootschalige partij voor eiwitproductie met suspensiecultuur van baculovirus geïnfecteerd in zes cellen verminderde de arbeid aanzienlijk in tijdrovende stap in vitale starterversterking.

Is bijvoorbeeld het centrifugaal maken van dit met speciale cultuur van geïnfecteerde cellen. Dat is natuurlijk in uitgesloten de extra behandeling van de geïnfecteerde cellen in voorkomen in hun strakkere in virusafbraak. Het onderhoud van de ophangcultuurkweekcel in deze schaalvergrotingsproductie in het kweekschip was een hoog veldvolume dat ons hielp om de beperking van het productievolume te overwinnen en een grootschalig platform te adopteren.

Dit is zeer nuttig voor de laboratoria zonder toegang tot de bioreactoren of beperkte ruimte in de productiepijplijn. Hoewel ons protocol is beschreven voor de eiwitten van de eiwit arginine methyltransferases familie, dezelfde aanpak kan worden toegepast op elke andere eiwitfamilie die expressieplatform nodig heeft om een voldoende hoeveelheid van hun eiwit te verkrijgen voor biochemische biofysische instructiestudies.