Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen
May 13th, 2021
Dit protocol beschrijft modificaties van de Langendorff-methode, waaronder de diepte van aorta-cannulatie voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen.
Dit protocol zou kunnen helpen om de atriale opbrengst van een doordrenkt muizenhart te verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de atriale en ventriculaire myocyt gelijktijdig kunnen worden geïsoleerd onder dezelfde verteringsconditie. Deze methode zou inzicht kunnen geven in de mechanismen van hartziekten op cellulair en subcellulair niveau.
Na het euthanaseren van een acht tot 10 weken oude mannelijke C57 zwarte zes muis, gebruik weefseltang om de huid van de xiphoid op te tillen. Maak vervolgens met behulp van een weefselschaar een kleine laterale incisie door de huid. Voer een stompe dissectie uit tussen de huid en fascia.
Breid de huidincisie uit naar de oksel in een V-vorm aan beide zijden en zet de incisie voort door de ribbenkast. Gebruik vervolgens een weefseltang, klem het borstbeen vast en buig de ribbenkast naar boven om het hart en de longen volledig bloot te leggen. Pel met behulp van een gebogen tang het hartzakje af.
Als de thymusklier de grote bloedvaten bedekt, gebruik dan twee gebogen tangen om de thymusklier naar beide zijden te scheuren en trek vervolgens voorzichtig de basis van het hart naar de staart totdat de aorta en zijn takslagaders zichtbaar zijn als een Y-vormig bloedvat. Transect de aorta aan de linker gemeenschappelijke halsslagader en snijd vervolgens de brachiocephalische slagader door. Snijd het hart weg en dompel het onmiddellijk onder in een petrischaaltje met Tyrode's oplossing om het resterende bloed te wassen en weg te pompen.
Breng vervolgens het hart over naar een andere petrischaal met oplossing één. Onder een stereomicroscoop, met behulp van een fijne Iris-schaar, knip je overtollig weefsel. Verwijder luchtbellen uit de spuit.
Voer vervolgens met behulp van twee rechte bindtangen retrograde aorta-cannulatie uit en zorg ervoor dat het hele cannulatieproces onder het vloeistofoppervlak wordt uitgevoerd. Pas de cannulatiediepte zodanig aan dat de canulepunt zich in de oplopende aorta bevindt en zorg ervoor dat u de aortakleppen niet binnendringt. Maak vervolgens met een voorknoop 3-O hechting de aorta los op de canule-inkeping.
Injecteer voorzichtig oplossing één uit de spuit om het resterende bloed weg te spoelen. Verbind vervolgens het gecannuleerde hart met het Langendorff-apparaat en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het hart worden geïntroduceerd. Nadat u het gecannuleerde hart op het Langendorff-apparaat hebt aangesloten, perfundeert u het hart gedurende ongeveer twee minuten met oplossing één.
Gebruik een steriele polyethyleenpipet voor eenmalig gebruik, zuig ongeveer 2,5 milliliter oplossing drie op en verwarm deze voor in het waterbad voor later gebruik. Om vervolgens de weefsels te verteren, perfundeer het hart met de resterende oplossing drie gedurende ongeveer 11 tot 12 minuten. Na de eerste twee minuten van de perfusie met oplossing drie, recycleert u de geperfuseerde oplossing naar de perfusaatreservoirs door de peristaltische pomp voor hergebruik totdat de spijsvertering is voltooid.
Wanneer het hart gezwollen raakt, enigszins bleek en slap wordt, met behulp van een getande tang, knijp je zachtjes in het myocardium. Als een afdruk zichtbaar is, beëindig dan de spijsvertering en maak het hart los van het apparaat. Om de arteriële en ventriculaire myocyten te isoleren, gebruikt u een tang om ventrikels en de boezems te verwijderen en in verschillende petrischalen te plaatsen.
Voeg vervolgens de voorverwarmde oplossing drie toe aan beide gerechten. Gebruik een stompe tang, triturate de weefsels in een troebele textuur en pipetteer het weefsel vervolgens voorzichtig voor een gelijkmatige spijsvertering zonder luchtbellen te introduceren. Om de resterende enzymactiviteit te stoppen, brengt u met behulp van een pipet het troebel verteerde weefsel over in oplossing vier en centrifugeert u vervolgens gedurende 20 seconden op 192 maal G.Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeert u het celsediment in oplossing vijf.
Om calciumparadox en calciumoverbelasting te voorkomen, herintroduceer het calcium stapsgewijs door geleidelijk in totaal 50 microliter van 100 millimolair per liter calciumchloride aan de celsuspensie toe te voegen. Zodra al het calciumchloride is toegevoegd, slaat u de cellen op in de oplossing van Tyrode voor het patchklemonderzoek. Cannulatiediepte wordt geassocieerd met de perfusie van de boezems en zijn aanhangsels.
Wanneer de canulepunt zich bij de opgaande aorta bevindt, worden beide atriale aanhangsels opgeblazen, wat wijst op voldoende atria-perfusie. Wanneer de canulepunt zich echter bij de aortawortel bevindt, worden beide atriale aanhangsels gewisteneerd, wat wijst op onvoldoende perfusie. Atriale myocyten geïsoleerd door cannulatie bij de opgaande aorta hadden hogere overlevingskansen dan die geïsoleerd door cannulatie bij de aortawortel, zowel voor als na de herintroductie van calcium.
Daarentegen was er geen verschil in de overlevingskansen van ventriculaire myocyten geïsoleerd door cannulatie bij de opgaande aorta of de aortawortel, zowel voor als na de herintroductie van calcium. De hele-cel patchklemregistratie van de natriumstroom in de geïsoleerde atriale en ventriculaire myocyten, evenals de huidige dichtheden bevestigen dat de kwaliteit van de geïsoleerde cellen voldoet aan de vereisten voor elektrofysiologische experimenten. Zorg er bij het transecteren van de aorta voor dat u voldoende klier behoudt voor ligatie.
Anders kan de canule na ligatie de aortaklep binnendringen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft aanpassingen van de Langendorff-methode voor de gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten uit volwassen muizen. De methode verhoogt de opbrengst van atriale myocyten terwijl de kwaliteit van geïsoleerde cellen voor elektrofysiologische studies behouden blijft.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculaire fysiologie
- Cellulaire biologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- De Langendorff-methode is een veelgebruikte techniek voor hartperfusie.
- Het isoleren van zowel atriale als ventriculaire myocyten gelijktijdig kan betere inzichten geven in de hartfunctie.
- Het begrijpen van myocytgedrag is cruciaal voor het bestuderen van hartziekten.
- Het verbeteren van de opbrengst van atriale myocyten is essentieel voor nauwkeurige experimentele resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om de opbrengst van atriale myocyten uit muizenharten te verbeteren.
- Om de gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten mogelijk te maken.
- Om cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hartziekten te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Volwassen mannelijke C57BL/6 muizen werden geëuthanaseerd voor hartextractie.
- Retrograde aortacanulering werd uitgevoerd voor perfusie.
- Harten werden geperfundeerd met specifieke oplossingen voor vertering.
- Myocyten werden geïsoleerd en bereid voor elektrofysiologische studies.
Belangrijkste resultaten
- Atriale myocyten geïsoleerd met de aangepaste methode vertoonden hogere overlevingspercentages.
- Gelijketijdige isolatie had geen invloed op de kwaliteit van ventriculaire myocyten.
- Elektrofysiologische opnames bevestigden de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen.
- Optimale canuleringsdiepte was cruciaal voor effectieve atriale perfusie.
Conclusies
- De aangepaste Langendorff-methode verbetert de opbrengst van atriale myocyten.
- Gelijketijdige isolatie verbetert onderzoekscapaciteiten in hartfysiologie.
- Dit protocol kan een beter begrip van hartziektemechanismen faciliteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
