Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak

Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak. Het doel van deze procedure is om een geoptimaliseerd protocol te introduceren voor snelle en eenvoudige ultra high-performance capillaire kolomverpakking voor LC-MS proteomics-analyse. Moderne proteomics is gebaseerd op massaspectrometrie in combinatie met ultra-high performance capillaire vloeistofchromatografie.

Peptidescheiding gebeurt meestal in capillaire kolommen met een inwendige diameter van 75 micrometer. Net als bij commerciële producten is het mogelijk om capillaire kolommen in eigen huis te bereiden. Op maat gemaakte kolommen vertonen scheidingskwaliteiten die vergelijkbaar zijn met commerciële analogieën, terwijl ze veel geld besparen en aanpassing van sorptiemiddel en kolomgrootte mogelijk maken.

Hier demonstreren we een geoptimaliseerd verpakkingsproces voor de interne productie van capillaire kolommen, die we FlashPack noemen. Het idee achter de optimalisatie is om te verpakken vanuit een zeer hoge sorbent slurryconcentratie, terwijl nog steeds dezelfde gemeenschappelijke 100 bar drukbomverpakkingsopstelling wordt gebruikt. Dit vereist het continu opbreken van sorptieclusters, die zich bij hoge sorptiemiddelconcentratie rond de kolomingang vormen en voorkomen dat nieuw absorberend materiaal het capillair binnendringt.

Technisch gezien bereiken we dat door een magneetbalk als hamer te gebruiken, constant te verwarmen en rond het capillair in de sorptiedraad te bewegen. Correct toegepaste FlashPack verhoogt de paksnelheid tot 10 keer. Dat maakt het geschikt voor het verpakken van ultra high performance sorptiemiddelen van zachtere micro metricbeat grootte en voor het vervaardigen van zeer lange kolommen tot een meter lengte in redelijke tijden.

De kolomvoorbereidingsprocedure bestaat uit vijf stappen. Drie voorbereidende stappen, waaronder de assemblage van pakstations en capillaire en absorberende slurrybereiding. Vervolgens wordt het capillair eerst verpakt in de drukbom bij 60 tot 100 bar druk.

Het wordt gevolgd door aansluiting van het verpakte capillair op het HPLC-systeem, waarbij het sorptiemiddel onder hoge druk wordt verpakt en de kolom op maat wordt gesneden. De FlashPack-procedure vereist dat wijzigingen worden aangebracht in de stappen drie en vier van het gemeenschappelijke protocol. Allereerst bereiden we een pakstation voor.

Het bestaat uit een stikstofgastank met een uitlaatdruk van ten minste 50 bar. De tank is verbonden met de ontluchtingsklep van de drukbom, die in de magneetroerder wordt geplaatst. De uitlaat van de ontluchtingsklep wordt in een waterfles geplaatst via een smal ID PEEK-capillair, wat een fijne controle op de drukregeling mogelijk maakt.

Vervolgens bereiden we een capillair voor. Verpakken kan worden gedaan in een gefrituurd capillair met een geïntegreerde glazen frit gevormd uit Kasil en formamide. Een andere optie is om te verpakken in een getrokken capillair bereid door sutter laser puller.

Het capillair moet 10 tot 15 centimeter langer worden gemaakt dan de beoogde kolomlengte. De volgende video is voorbereid op het voorbeeld van een getrokken emitter capillaire verpakking. Bescherm een getrokken emitteruiteinde met een gesneden pipetpunt met gelbelasting.

Zie de tekstversie van het manuscript voor meer informatie. De volgende fase is sorbent slurry-voorbereiding. Doe eerst ongeveer 50 milligram droog sorptiemiddel in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Dat wordt een voorraadsorberend flesje. Deze video is gemaakt met behulp van Reprosil Pur C18 AQ 1.9 micrometrisch sorptiemiddel van Dr.Maisch. Voeg één milliliter methanol toe aan de injectieflacon met het absorberende voorraad.

Vortex gedurende 10 seconden. En soniceer nog eens 10 seconden in een ultrasoonapparaatbad. Laat het sorptiemiddel 20 tot 30 minuten grondig weken, draai dan vortex en soniceer het nogmaals.

Bereid een werkende injectieflacon met sorptiemiddel voor. Het moet een conische bodemflacon zijn die in de bom past. Het kan een andere centrifugebuis van 1,5 milliliter of een andere injectieflacon zijn, afhankelijk van het specifieke drukbomontwerp.

We gebruiken een omzoomde conische onderste schroefdopbuis die tot de hoogte van de drukbom is gesneden. Suspensie het sorptiemiddel opnieuw in de voorraad sorbentflacon en breng 500 microliter over in de werkende sorptieflacon samen met een magneetbalk van twee bij drie millimeter groot. Top naar de werkflacon tot één milliliter met methanol.

Laat de werkflacon 10 minuten op tafel staan om het sorptiemiddel door de zwaartekracht te laten bezinken. Het resultaat van deze stap moet een conische bodemflacon zijn met de onderste laag los sorptiemiddel van ongeveer vier millimeter hoog. Als de laag te laag is, en wat meer sorptiemiddel uit de voorraadflacon.

De aldus voorbereide werkflacon is bedoeld voor de voorbereiding van meerdere kolommen gedurende maanden. Als de werkende injectieflacon met sorptiemiddel langer dan twee uur zonder te roeren blijft, moet deze vóór het verpakken worden gevortexed, gesoniseerd en door de zwaartekracht opnieuw worden bezinkt. Wanneer alles is voorbereid, ga je verder met fase vier, waarbij je de drukbom inpakt.

Draag altijd een beschermende bril bij het werken met gesmolten silicacapillairen en de drukbom. Tegelijkertijd worden beschermende handschoenen niet aanbevolen. Ze verminderen de tastzin die nodig is voor een goede behandeling van haarvaten met een kleine diameter ernstig en leiden tot fouten.

Plaats de injectieflacon met het sorptiemiddel in de drukbom en bevestig alle knopen stevig. Start de rotatie met 60 tot 100 ronden per minuut, steek het gefrituurde of getrokken emitter capillair in de bom. Duw het naar de bodem van de injectieflacon, til het vervolgens twee tot drie millimeter op en bevestig de knoop.

Pas de minimaal vereiste kracht toe om het capillair te fixeren. Controleer of het capillair goed is gefixeerd. Het moet onmogelijk zijn om het capillair te bewegen door het er met de hand uit te trekken.

Open heel langzaam het drukbomventiel terwijl je het open uiteinde van het capillair weg van je gezicht houdt. Bekijk de eerste stappen van het verpakkingsproces. Onmiddellijk na druk vult het sorptiemiddel het capillair en wordt het over de hele lengte ondoorzichtig.

Zodra het sorptiemiddel zich in het distale uiteinde begint te verpakken, neemt de tegendruk toe, vertraagt de stroom en verandert de gelijkmatige sorptiemest in het capillair in verschillende sorptiepakketten, gescheiden door sorptievrije openingen. Reeds verpakt sorptiemiddel is zichtbaar als een dichtgekleurd continu groeiend gebied. Houd de met sorptiemiddel gevulde gebieden gedurende de gehele duur van het verpakkingsproces op ten minste 70% van de capillaire lengte met kleine sorptievrije openingen.

Er zijn verschillende veelvoorkomende problemen om in de gaten te houden tijdens het verpakkingsproces. Ze vereisen aanpassing van de opstelling tijdens de vlucht om een efficiënte sorptiemiddelafgifte in het capillair te houden. Het meest voorkomende probleem is wanneer nieuw sorptiemiddel stopt met het binnendringen van het capillair terwijl het sorptiemiddel dat al binnen is, blijft bewegen.

In de meeste gevallen wordt de capillaire ingang geblokkeerd door zelfaggregaterende absorberende clusters. Pas deze stappen één voor één toe totdat de sorptiestroom is hersteld en sla vervolgens de rest van de probleemgerelateerde stappen over. Verhoog de rotatiesnelheid tot 500 ronden per minuut en verlaag deze onmiddellijk terug tot 60 RPM.

Meestal herstelt het de sorptiestroom. Controleer of de rotatiesnelheid ten minste 60 RPM is voor de rest van het verpakkingsproces. Als het niet helpt, ontlucht dan kort de verpakkingsbom en druk deze onmiddellijk terug.

Als het niet helpt, of als de blokkering opnieuw gebeurt, verplaats dan het capillair in de absorberende laag. De afwezigheid van het sorptiemiddel kan te wijten zijn aan het feit dat het capillaire open uiteinde te hoog boven de magneetbalk is, zodat het kolomuiteinde het niet raakt. Of het capillair is te laag geplaatst en steekt in de bodem van de injectieflacon.

Ontlucht eerst de bom volledig, maak vervolgens de moer los, duw het capillair naar de bodem en trek het vervolgens twee millimeter naar achteren. Bevestig de moer. Open de klep om de bom onder druk te zetten en ga verder met inpakken.

Meer informatie over de verpakkingsproblemen wordt beschreven in de tekstversie van de methode. Blijf de kolom inpakken totdat de doelkolomlengte plus vijf tot zeven centimeter is bereikt. Stop de rotatie en maak de bom heel langzaam onder druk.

Open de bomklep een beetje en wacht tot de bubbel in de waterfles is gezakt. Open vervolgens de klep iets breder en wacht opnieuw tot de bel barst om te vertragen. Laat dus in incrementele stappen de druk los totdat er geen gas uit de klep komt.

Open de klep niet helemaal in één keer. Het zal leiden tot borrelen in het capillair en het sorptiemiddel gaat terug in de injectieflacon. Als dat gebeurt, zet je de bom onder druk en wacht je tot de kolom weer vol zit.

Wanneer het gas niet meer uit de ontluchtingsklep komt, haalt u het verpakte capillair uit de drukbom. Laat de kolom niet uitdrogen. Als het niet onmiddellijk op het HPLC-systeem is aangesloten voor verdere verpakking, bergt u het verpakte capillair op door het in zijn geheel onder te dompelen in een 10% ethanoloplossing.

Losgekoppelde HPLC-kolommen worden op dezelfde manier opgeslagen. Als er voor vandaag geen verpakking meer gepland staat, haal dan de injectieflacon met sorptie uit de bom en sluit deze goed af. Bewaar het voor verdere verpakking van de kolom.

Fase vijf, HPLC inpakken. Sluit het verpakte capillair aan op het HPLC-systeem via een HPLC-verbinding. Start de stroom van hoog organisch oplosmiddel.

Pas de stroom aan op basis van de verpakte lengte en richt u op ongeveer 300 bar. Gebruik voor 40 centimeter verpakt capillair het debiet van 200-300 normale liter per minuut. Let op losse sorptiemiddel in het capillair dat wordt verpakt, wat bijdraagt aan de totale verpakte lengte.

Zonder de stroom te stoppen, dompelt u het kolomlichaam twee keer in het ultrasoonapparaatbad. Het is belangrijk om slechts een deel van het kolomlichaam onder te dompelen. Dompel kolomuiteinden en capillaire verbindingen niet onder.

Wanneer het absorberende bed stopt met krimpen, dompelt u het kolomlichaam twee keer meer in het ultrasoonapparaatbad zonder de stroom te stoppen. Voer de kolom nog eens 10 minuten uit bij 300 balken. Stop de stroom, wacht tot de druk daalt tot onder de drie bar en koppel de kolom los.

Inspecteer de kolom visueel op het ontbreken van openingen en verkleuringen. Als er een wordt gevonden, kan ultrasoonapparaat onder de stroom worden herhaald. Voor kritische experimenten kunt u overwegen een nieuwe kolom te maken.

Knip de kolom op de gewenste lengte. Goed uitgevoerd snijden is een voorwaarde voor kolomefficiëntie. Maak een inkeping in polyamide coating met de scribent.

Scheur het capillair gedeeltelijk en trek twee stukken uit elkaar. Polijst de voorkant van de kolom op een keramische wafer of met lappende film. Sluit de kolom opnieuw aan op het LC-systeem met behulp van een ultrahogedrukverbinding.

Start het werkdebiet op 2%B. Het werkdebiet wordt aangepast aan de kolomparameters. Zo draaien 100 micrometer ID-kolommen met 500 nanoliter per minuut.

Wacht tot de druk in evenwicht is en controleer de tegendruk van de kolom. Een goed voorbereide kolom geeft tegendruk die evenredig is met de lengte en sorptie-eigenschappen. Bijvoorbeeld, 30 centimeter capillaire kolom verpakt met twee micrometer sorptiemiddel heeft een tegendruk van 450 tot 500 bar bij 2% oplosmiddel B.Als de geproduceerde kolom een tegendruk geeft binnen het verwachte bereik, is deze klaar voor gebruik.

Als de tegendruk ver buiten het verwachte bereik ligt, is er iets mis met de kolom of met het LC-systeem. Verpakken met FlashPack produceert een capillair verpakt voor 50 centimeter met 1,9 micrometer sorptiemiddel in minder dan een uur bij 100 bar verpakkingsdruk. Als voorbeeld produceren we 30 centimeter 100 micrometer ID ultrahogedrukkolom verpakt in een getrokken emitter capillair met 1,9 micrometer ReprosilPur C18 AQ sorptiemiddel.

Het verpakken gebeurde bij 60 repen in 50 centimeter lang getrokken emitter capillair. Het capillair werd in 40 minuten tot 40 centimeter verpakt met wat meer sorptiemiddel in het capillair dat niet was verpakt. Het verpakte capillair was aangesloten op het HPLC-systeem en liep met 300 nanoliter per minuut met oplosmiddel B, dat in ons geval 80% acetonitril, 0,1% mierenzuur was.

De uiteindelijke ingepakte lengte was 43 centimeter. De kolom werd 30 centimeter gesneden. Bij 500 nanoliter per minuut werkstroom met 99% oplosmiddel B gaf de kolom de tegendruk van 275 bar, wat dicht bij de verwachte waarde ligt.

Om de kolom te testen, scheidden we 50 fmol van een tryptische digest van cytochroom C-eiwit in een gradiënt van 15 minuten van 2-50% B. Chromatografische pieken waren zeer symmetrisch met minimale tailing. De gemiddelde FWHM lag rond de drie seconden.

Het beschreven protocol is in staat om UHPLC-kolommen te produceren in een gemeenschappelijke 100 bar verpakking die binnen een redelijke tijd is ingesteld. Korte HPLC- of UPLC-kolommen kunnen in minuten tijd worden verpakt, terwijl lange kolommen van 30-50 centimeter in minder dan een uur worden verpakt. De methode is efficiënt voor het verpakken van sorptiemiddelen met RP en andere chemie in kolom-ID's.

Geproduceerde kolommen zijn reproduceerbaar even effectief als elke andere commerciële kolom van vergelijkbare grootte en sorptieparameters.