Kleuring van de Cytoplasmatische Ca²⁺ met Fluo-4/AM in Appelpulp

Als een belangrijk mineraal element speelt calcium een sleutelrol in de groei en de kwaliteitscontrole van boomvruchten zoals appel, het kan de hardheid, het suikergehalte, de opslagperiode en de fysiologische aandoening tijdens opslag reguleren. Calciumbeeldvorming is de meest westerse methode om dynamische veranderingen in calciumionen in het cytoplasma te detecteren. Fluorescentie-indicatoren met kleine moleculen, zoals fluo-4 /AM, hebben calciumionspecifieke selectiviteit en kunnen niet-invasief worden geladen door veresteringsincubatie, die flexibel, snel en niet-cytotoxisch is.

Dit protocol introduceert een methode voor het laden van klein molecuul chemisch fluorescerend reagens fluo-4/AM in plantaardige protoplasten. Protoplast extractie Voeg 0,5 milliliter enzymoplossing toe aan een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Kies een gezonde en rijpe appel en snijd de pulp in 10 keer 5 keer 1 kubieke milliliter grootte.

Plaats de pulpstukken in een enzymatische oplossing en sluit vervolgens de buis. Incubeer buis op 28 graden gedurende een uur. Gehackt bij 70 toeren in het donker.

Was daarna de pulpstukken, aspiraleer alle enzymatische oplossing en voeg vervolgens 0,5 milliliter basisoplossing toe. Centrifugeer met een snelheid van 300 g gedurende 2 minuten. Protoplasten suspensie kan worden verkregen door de bodemoplossing aan te zuigen.

Chemische fluorescentiereagenskleuring met kleine moleculen. Bereid de fluo-4/AM-laadoplossing met een 2 millimolaire fluo-4/AM, 20%ethyl127 en de 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing in een verhouding van één op één tot twee. Voeg 1 microliter laadoplossing van fluo-4/AM toe aan 99 microliter protoplast suspensie.

De uiteindelijke concentratie fluorescerende kleurstoffen is 5 micromolair. Meng de oplossing en sluit de buis. Tegelijkertijd ijzert lanthaan het calcium of de uniciteit van het kleine moleculaire chemische fluorescerende middel.

Voeg één microliter of 10 microliter meer lanthaanijzer en vervolgens één microliter laadoplossing van fluo-4/AM toe aan 98 microliter protoplasten suspensie. De uiteindelijke concentratie lanthaanijzer is 100 micromolair. Meng de oplossing en sluit de buis.

Incubeer bij 37 graden gedurende 30 minuten in het donker. Centrifugeer daarna gedurende twee minuten met een snelheid van 300 G. Adem naar 17 microliter oplossing en voeg een 17 microliter basisoplossing toe.

Incubeer de protoplast suspensie bij 37 graden gedurende 30 minuten tot volledig Daarna 50 microliter protoplasten suspensie opzuigen en op een dia druppelen. Observeer onder fluorescentiemicroscoop. Selecteer de 20x de vergroting en het GFP-kanaal dat u wilt observeren.

Stel de helderheid gelijkmatig in op 0,5. Een cruciale stap in deze voorgestelde methode is om de vlek in de protoplasten te wassen en gedurende 30 minuten te incuberen. Onvoldoende wassen veroorzaakt overmatige terugslag op de fluorescentie tijdens observatie en incubatie zorgt voor een betere belasting van de sonde in het cytoplasma.

Protoplasten Levensvatbaarheidstest Neem 99 microliter protoplasten suspensie na het broeden op 37 graden gedurende 30 minuten. Voeg 1 ml aan de FD-oplossing toe aan protoplasten suspensie. Meng de oplossing door meerdere keren op en neer te pipetteren en sluit vervolgens de buis.

Blijf in het donker vijf minuten op kamertemperatuur. Bereid de dia's voor en observeer ze op de fluorescentiemicroscoop met GFP-kanaal. We presenteren u de resultaten Na figuur één.

We gebruiken de enzymatische methode om protoplasten uit de pulp te verkrijgen. Sommige protoplasten hadden een vacuole, terwijl anderen dat niet deden. De protoplasten werden gedurende vijf minuten gekleurd met FD en tonen de florescent in cytoplasma wat aangeeft dat hoge temperatuur, 37 graden de levensvatbaarheid of protoplasten niet beïnvloedt Figuur twee.

De protoplasten vertoonden geen fluorescentie in een van de calciumijzers fluorescentie-indicator of het is er niet in geladen. Toen in fluo-4/AM in de protoplast werd geladen, werd de cytoplast, maar geen vacuole werd fluorescerend. Lanthaanijzers die calciumkanalen effectief blokkeren, zijn het celmembraan dat werd toegevoegd aan de Protoplast fluo-4 / AM-belasting.

Bij de uiteindelijke concentratie van 100 micromolair lanthaan verminderen ijzers de calciumfluorescentie-intensiteit aanzienlijk. Deze resultaten toonden verder aan dat fluo-4/AM effectief in de calciumijzers in de cytoplast blijft en dynamische veranderingen in het calciumijzergehalte vertoont. Figuur drie De fluo-4/AM-resultaten werden geanalyseerd met behulp van IMH-goedgekeurd plus 6.0 software fluo-4/AM-kleuring met toevoeging van lanthaanijzers verminderde de bloeiwaarde van cytoplasmatische calciumijzers aanzienlijk.

In deze video werden alle protoplasten verkregen door enzymatische hydrolyse. We hebben de fluorescerende sondes met succes in een protoplast op 37 graden geladen. Bovendien had de methode geen invloed op de levensvatbaarheid van protoplasten.

Samengevat wordt de hier beschreven methode in natura gedetailleerd beschreven. De dynamische veranderingen in cytoplasmatische calciumionen in appelpulpcellen bieden daardoor 10 gelijke ondersteuningen voor het verdere doel van calciumgerelateerde studies.