Name: Kleuring van de Cytoplasmatische Ca2+ met Fluo-4/AM in Appelpulp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer hoe u cytosolische Ca²⁺ in appelprotoplasten kunt detecteren met Fluo-4/AM. Deze methode maakt snelle, niet-invasieve calciumbeeldvorming mogelijk voor onderzoek naar fruitontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Agricultural Variety Improvement Project van de provincie Shandong (2019LZGC007) en het fruitboominnovatieteam van het moderne landbouwindustrietechnologiesysteem van Shandong (SDAIT-06-05).

1. Protoplast extractie
<ol><li>Bereid de basisoplossing: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur en 0,4 M D-sorbitol. OPMERKING: De pH van de basisoplossing werd aangepast naar 5,8 met 0,1 M Tris-buffer, gefilterd door 0,22 μm in water oplosbare filters en bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid de enzymatische oplossing voor: Meng 0,3% (w / v) MacerozymE R-10 en 0,5% (w / v) cellulase R-10 met de basisoplossing.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml enzymatische oplossing toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml. Kies een gezonde en rijpe appel. Snijd vervolgens de pulp in 10 x 5 x 1 mm3 formaat (Figuur 1A-1C).</li>
	<li>Plaats de stukjes appelvruchtpulp in een centrifugebuis van 1,5 ml met enzymatische oplossing en sluit vervolgens de buis(figuur 1D).</li>
	<li>Incubeer de buis bij 28 °C gedurende 1 uur en schud bij 70 rpm/min in een shaker in het donker.</li>
	<li>Was de pulpstukjes. Aspirateer alle enzymatische oplossing en voeg vervolgens 0,5 ml van de basisoplossing toe.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Om een protoplast suspensie te verkrijgen, zuigt u de oplossing op vanaf de bodem van de centrifugebuis (figuur 1E).</li>
</ol>2. Calciumionfluorescentiekleuring met kleine moleculen
<ol><li>Bereid de Fluo-4/AM-laadoplossing voor met 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 en 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS:80 mM Na2HPO4,1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4en 26 mM KCI) in een verhouding van 1:1:2.</li>
	<li>Voeg 1 μL Fluo-4/AM-laadoplossing toe aan 99 μL van de protoplastsuspensie in de centrifugebuizen van 1,5 ml. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van de fluorescerende kleurstof 5 μM is. Meng de oplossing en sluit vervolgens de buis.</li>
	<li>La3+ behandeling: Bereid 100 μM La3+ oplossing met 98 μL van de protoplast suspensie, 1 μL van 10 mM La3+en 1 μL Fluo-4/AM laadoplossing. Meng de oplossing en sluit de buis.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker.</li>
	<li>Was de protoplasten door centrifugeren op 300 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer 70 μL van de oplossing en voeg 70 μL van de basisoplossing toe.</li>
	<li>Incubeer de protoplast suspensie bij 37 °C gedurende 30 minuten om volledig te de-estereren.</li>
	<li>Aspirateer 15 μL van de protoplast suspensie en druppel op een dia.</li>
	<li>Observeer onder een fluorescentiemicroscoop (aanvullende figuur S1). OPMERKING: Gebruik een kleurencamera met een hoge gevoeligheid, d.w.z. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-sensor met een pixelresolutie van 3,45 μm.</li>
	<li>Selecteer het GFP-kanaal voor beeldvorming (20x). Stel de helderheid in op 0,5. OPMERKING: Verlichting is led-lichtkubussen met instelbare intensiteit met een geïntegreerde filterset met harde coating. De excitatiegolflengte van Fluo-4/AM is 490 nm.</li>
</ol>3. Protoplast levensvatbaarheidstest
<ol><li>Bereid de fluoresceïnediacetaat (FDA) stamoplossing voor: Los FDA op in aceton totdat de eindconcentratie 1 mg / ml is.</li>
	<li>Bereid de FDA-werkoplossing voor met 1 μL van de stamoplossing en 99 μL aceton.</li>
	<li>Voeg 1 μL FDA-werkoplossing toe aan 99 μL protoplastsuspensie. Meng de oplossing door op en neer te pipetteren en sluit vervolgens de buis. OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de FDA is 100 μg / L.</li>
	<li>Vlek bij kamertemperatuur gedurende 5 min in het donker.</li>
	<li>Bereid de dia's voor en observeer onder een fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Selecteer het GFP-kanaal voor beeldvorming(figuur 1F).</li>
</ol>4. Beeldanalyse
<ol><li>Analyseer de verkregen afbeeldingen met behulp van beeldanalyse- en spreadsheetsoftware (bijv. Image-Pro Plus en Excel 2010).</li>
	<li>Selecteer twee verticale diameters uit de protoplasten om de fluorescentie-intensiteit te berekenen(aanvullende figuur S2). De fluorescentie-intensiteit van alle protoplasten onder verschillende behandelingen werd gemeten. Gebruik voor de uiteindelijke verwerking fotobewerkingssoftware.</li>
</ol>5. Statistische analyse
<ol><li>Statistische analyse uitvoeren met behulp van statistische software(aanvullende figuur S3). De gegevens worden gepresenteerd in Gemiddelde ± SD. De t-toetsvan de student werd gebruikt om de verschillen tussen de experimentele groepen te analyseren.</li>
</ol>

<ol><li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+calcium%3A+Transport+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).</li>
<li>Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Sciences+in+China%22%5BJournal%5D)">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li>
<li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li>
<li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color%2C+flavor%2C+texture%2C+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables%3A+desirable+levels%2C+instrumental+and+sensory+measurement%2C+and+the+effects+of+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li>
<li>Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+apple+fruit+firmness--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal-+American+Pomological+Society%22%5BJournal%5D)">Factors affecting apple fruit firmness--a review.</a> Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).</li>
<li>Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+softening+of+apple+%28Malus+domestica%29+fruit%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Experimental+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review.</a> New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).</li>
<li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+across+plant+membranes%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li>
<li>Miqueloto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+fruit+calcium+content+and+susceptibility+to+bitter+pit+in+cultivars+of+apple%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+horticulturae%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple.</a> Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).</li>
<li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+%27Huangguan%27+pears+during+cold+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li>
<li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Horticulture+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li>
<li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Agricultural+Research+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).</li>
<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+practical+red+fluorescent+probe+for+cytoplasmic+calcium+ions+with+greatly+improved+cell-membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability.</a> Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca%282%29%28%2B%29+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics.</a> Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca%282%29%28%2B%29+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators.</a> Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2%2B-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+inexpensive+method+of+loading+fluorescent+dye+into+pollen+tubes+and+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs.</a> PLoS One. 11, 0152320(2016).</li>
<li>Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calreticulin+is+required+for+calcium+homeostasis+and+proper+pollen+tube+tip+growth+in+Petunia%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia.</a> Planta. 245 (5), 909-926 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADK2+positively+modulates+abscisic+acid-induced+stomatal+closure+by+affecting+accumulation+of+H2O2%2C+Ca2%2B+and+nitric+oxide+in+Arabidopsis+guard+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells.</a> Plant Science. 262, 81-90 (2017).</li>
<li>Niu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+availability+regulates+the+development+of+root+hairs+in+Arabidopsis+thaliana+%28L.%29+Heynh%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.</a> Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).</li>
<li>Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading+calcium+fluorescent+probes+into+protoplasts+to+detect+calcium+in+the+flesh+tissue+cells+of+Malus+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica.</a> Horticulture Research. 7, 91(2020).</li>
<li>Boyer, J., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+phytochemicals+and+their+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Journal%22%5BJournal%5D)">Apple phytochemicals and their health benefits.</a> Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li>
<li>Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hyperpolarization-activated+calcium+channels+in+apical+pollen+tubes+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia.</a> New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx6+regulates+left%2Fright+patterning+in+mouse+embryos+through+effects+on+nodal+cilia+and+perinodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling.</a> PLoS One. 3 (6), 2511(2008).</li>
<li>DeSimone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+taste+receptor+cell+%5BCa2%2B%5Di+modulate+chorda+tympani+responses+to+salty+and+sour+taste+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).</li>
<li>Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluo-3+to+measure+cytosolic+Ca2%2B+in+platelets+and+neutrophils.+Loading+cells+with+the+dye%2C+calibration+of+traces%2C+measurements+in+the+presence+of+plasma%2C+and+buffering+of+cytosolic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2.</a> Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+Ca+content+and+distribution+in+two+Gesneriaceae+species+reveals+distinctive+mechanisms+to+cope+with+high+rhizospheric+soluble+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).</li>
<li>Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+Ca2%2B+in+cells+of+intact+wheat+roots%3A+loading+of+acetoxymethyl+ester+of+Fluo-3+under+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature.</a> Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).</li>
<li>Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+loading+ester+fluorescent+Ca2%2B+and+pH+indicators+into+pollen+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia.</a> Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+actin+filaments+induces+mitochondrial+Ca2%2B+release+to+the+cytoplasm+and+%5BCa2%2B%5Dc+changes+in+Arabidopsis.+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs.</a> BMC Plant Biology. 10, 53(2010).</li>
<li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben met de inhoud van dit artikel.

In deze studie werden levensvatbare protoplasten verkregen door enzymatische hydrolyse. Merk op dat deze methode verse appels vereist. Het huidige protocol maakt de snelle isolatie van een groot aantal protoplasten uit vruchtenpulp mogelijk voor gebruik in onderzoeksstudies. De toepasbaarheid van deze methode is niet beperkt tot 'Fuji'; de protoplasten van de appelpulp van 'Dounan' en 'Honey Crisp' kunnen ook via hetzelfde protocol worden geëxtraheerd (aanvullende figuur S4). De protoplastoplossing na en...

Ca2+ speelt een belangrijke rol bij de transductie en stofwisseling vanplantensignalen 1,2. Verder reguleert het de eigenschappen van de fruitkwaliteit3,4,waaronder hardheid, suikergehalte en gevoeligheid voor fysiologische stoornissen tijdens opslag5,6. Cytoplasmatisch Ca2+ speelt een belangrijke rol bij signaaltransductie en reguleert de groei en ontwikkeling van planten7. Verstoring van cellulaire calciumhomeostase kan bittere pit in appelsveroorzaken 8,bruine vlekkenziekte in peren9en navelstrengrot in tomaten10,waardoor de fruitkwaliteit wordt aangetast en ernstige economische verliezen worden veroorzaakt3,11. Calciumbeeldvorming heeft voldoende ruimtelijke en temporele resolutie en is een belangrijke methode voor het observeren van Ca2+ dynamiek in levende cellen12,13.
Op dit moment zijn er twee hoofdmethoden voor intracellulaire calciumbeeldvorming in levende cellen: de ene maakt gebruik van chemische kleinmoleculaire fluorescerende sondes14en de andere is de gencoderingssensor (GECI)15,16. Gezien de moeilijkheid om een stabiel transgeen systeem in fruitbomen en een langere vruchtontwikkeling tot stand te brengen, is GECIS ongeschikt voor beeldvorming van fruit Ca2+ fluorescentie.
Fluorescentiesondes met kleine moleculen zoals Fluo-4 / AM hebben een bijzonder voordeel: hun AM-estervorm (celdoorlatend acetoxymethylesterderivaat) kan gemakkelijk in bulk in levende cellen worden geladen zonder de noodzaak van transfectie, waardoor het flexibel, snel en niet-cytotoxischis 17. Fluo-4/AM kon met succes worden geladen in de stuifmeelbuis van Pyrus pyrifolia18 en Petunia,19, evenals in wachtcellen20 en wortelhaar van Arabidopsis21.
Op dit moment zijn er weinig rapporten over de calciumfluorescentiekleuring van pulpcellen22. Als belangrijk mineraal element speelt calcium een sleutelrol bij de groei en kwaliteitscontrole van boomvruchten zoals appels. Appelbomen worden wereldwijd erkend als een belangrijke economische soort en appels worden beschouwd als een gezond voedsel23. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten uit appelvruchtpulp door middel van enzymatische hydrolyse en laadden vervolgens fluorescerende reagentia met kleine moleculen in het cytoplasma om Ca2 +te detecteren.

<table><tbody><tr><td>10× phosphate-buffered saline</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS (fosfaat gebufferde oplossing) is een fosfaatbufferoplossing, die een relatief stabiele ionische omgeving en pH-buffercapaciteit kan bieden. Het is een bufferzoutoplossing die vaak wordt gebruikt in de biologie voor moleculaire klonen en celcultuur. De pH is 7,4. </td></tr><tr><td>2-(N-morfolino)etaansulfonzuur</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>Biologische buffer</td></tr><tr><td>CaCl2·2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>Calciumchloride dihydraat is een witte of grijze chemische stof, meestal in korrelige vorm.</td></tr><tr><td>Cellulase R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7352</td><td>Degraderen plantencellenwanden.</td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Solarbio</td><td>S8090</td><td>Het heeft goede vochtinbrengende eigenschappen, voorkomt uitdrogen en voorkomt dat suiker, zout, enz. kristalliseren.</td></tr><tr><td>F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6867</td><td>Pluronic F-127 is een niet-ionische, oppervlakteactieve polyol (molecuulgewicht van ongeveer 12500 Dalton), waarvan is vastgesteld dat het gunstig is voor het bevorderen van de oplossing van wateronoplosbare kleurstoffen en andere materialen in fysiologische media. </td></tr><tr><td>FDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td>FDA is een celdoordringbare esterase substraat die kan dienen als een levensvatbaarheidssonde die zowel de enzymatische activiteit meet, die vereist is om de fluorescentie te activeren, als de integriteit van het celmembraan, die vereist is voor intracellulaire retentie van hun fluorescente product. </td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>De groen fluorescente calciumindicator Fluo-4/AM is een verbeterde versie van de calciumindicator Fluo-3/AM. De Fluo-4/AM laadt sneller en is helderder bij dezelfde concentratie. Het kan goed worden aangeslagen met een 488 nm argon ionenlaser.</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>Bekijk het fluorescentiebeeld.</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7351</td><td>Degraderen plantenweefsel om afzonderlijke cellen te scheiden.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td>Het wordt veel gebruikt bij de bereiding van buffers in biochemische en moleculaire biologie experimenten.</td></tr></tbody></table>

kleuring van de cytoplasmatische ca2+ met fluo-4/am in appelpulp

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Cytosolic Ca2+ speelt een sleutelrol in de ontwikkeling van planten. Calciumbeeldvorming is de meest veelzijdige methode om dynamische veranderingen in Ca2+ in het cytoplasma te detecteren. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten van pulpcellen door enzymatische hydrolyse. Geïsoleerde protoplasten werden geïncubeerd met het fluorescerende reagens met kleine moleculen (Fluo-4/AM) gedurende 30 minuten bij 37 °C. De fluorescerende sondes vlekten met succes cytosolische Ca2+ maar hoopten zich niet op in vacuolen. La3+,een Ca2+ kanaalblokker, verminderde de cytoplasmatische fluorescentie-intensiteit. Deze resultaten suggereren dat Fluo-4/AM kan worden gebruikt om veranderingen in cytosolische Ca2+ in het vruchtvlees te detecteren. Samenvattend presenteren we een methode om protoplasten effectief te isoleren uit vleescellen van de vrucht en Ca2+ te detecteren door een klein molecuul calcium fluorescerend reagens in het cytoplasma van pulpcellen te laden.

Volgens het hierboven beschreven protocol gebruikten we de enzymatische methode om levensvatbare protoplasten uit de pulp te verkrijgen(figuur 1). Sommige protoplasten hadden vacuolen, terwijl anderen dat niet deden. Terwijl de protoplasten geen fluorescentie vertoonden wanneer de Ca2+ fluorescerende indicator er niet in werd geladen. Toen Fluo-4/AM in de protoplasten werd geladen, werd het cytoplasma, maar niet de vacuole, fluorescerend (figuur 2). D...

Geïsoleerde protoplasten van appelpulpcellen werden geladen met een calciumconsprecerend reagens om cytoplasmatische Ca2+ concentratie te detecteren.

Kleuring van de Cytoplasmatische Ca2+ met Fluo-4/AM in Appelpulp

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

Als een belangrijk mineraal element speelt calcium een sleutelrol in de groei en de kwaliteitscontrole van boomvruchten zoals appel, het kan de hardheid, het suikergehalte, de opslagperiode en de fysiologische aandoening tijdens opslag reguleren. Calciumbeeldvorming is de meest westerse methode om dynamische veranderingen in calciumionen in het cytoplasma te detecteren. Fluorescentie-indicatoren met kleine moleculen, zoals fluo-4 /AM, hebben calciumionspecifieke selectiviteit en kunnen niet-invasief worden geladen door veresteringsincubatie, die flexibel, snel en niet-cytotoxisch is.Dit protocol introduceert een methode voor het laden van klein molecuul chemisch fluorescerend reagens fluo-4/AM in plantaardige protoplasten. Protoplast extractie Voeg 0,5 milliliter enzymoplossing toe aan een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Kies een gezonde en rijpe appel en snijd de pulp in 10 keer 5 keer 1 kubieke milliliter grootte.Plaats de pulpstukken in een enzymatische oplossing en sluit vervolgens de buis. Incubeer buis op 28 graden gedurende een uur. Gehackt bij 70 toeren in het donker.Was daarna de pulpstukken, aspiraleer alle enzymatische oplossing en voeg vervolgens 0,5 milliliter basisoplossing toe. Centrifugeer met een snelheid van 300 g gedurende 2 minuten. Protoplasten suspensie kan worden verkregen door de bodemoplossing aan te zuigen.Chemische fluorescentiereagenskleuring met kleine moleculen. Bereid de fluo-4/AM-laadoplossing met een 2 millimolaire fluo-4/AM, 20%ethyl127 en de 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing in een verhouding van één op één tot twee. Voeg 1 microliter laadoplossing van fluo-4/AM toe aan 99 microliter protoplast suspensie.De uiteindelijke concentratie fluorescerende kleurstoffen is 5 micromolair. Meng de oplossing en sluit de buis. Tegelijkertijd ijzert lanthaan het calcium of de uniciteit van het kleine moleculaire chemische fluorescerende middel.Voeg één microliter of 10 microliter meer lanthaanijzer en vervolgens één microliter laadoplossing van fluo-4/AM toe aan 98 microliter protoplasten suspensie. De uiteindelijke concentratie lanthaanijzer is 100 micromolair. Meng de oplossing en sluit de buis.Incubeer bij 37 graden gedurende 30 minuten in het donker. Centrifugeer daarna gedurende twee minuten met een snelheid van 300 G. Adem naar 17 microliter oplossing en voeg een 17 microliter basisoplossing toe.Incubeer de protoplast suspensie bij 37 graden gedurende 30 minuten tot volledig Daarna 50 microliter protoplasten suspensie opzuigen en op een dia druppelen. Observeer onder fluorescentiemicroscoop. Selecteer de 20x de vergroting en het GFP-kanaal dat u wilt observeren.Stel de helderheid gelijkmatig in op 0,5. Een cruciale stap in deze voorgestelde methode is om de vlek in de protoplasten te wassen en gedurende 30 minuten te incuberen. Onvoldoende wassen veroorzaakt overmatige terugslag op de fluorescentie tijdens observatie en incubatie zorgt voor een betere belasting van de sonde in het cytoplasma.Protoplasten Levensvatbaarheidstest Neem 99 microliter protoplasten suspensie na het broeden op 37 graden gedurende 30 minuten. Voeg 1 ml aan de FD-oplossing toe aan protoplasten suspensie. Meng de oplossing door meerdere keren op en neer te pipetteren en sluit vervolgens de buis.Blijf in het donker vijf minuten op kamertemperatuur. Bereid de dia's voor en observeer ze op de fluorescentiemicroscoop met GFP-kanaal. We presenteren u de resultaten Na figuur één.We gebruiken de enzymatische methode om protoplasten uit de pulp te verkrijgen. Sommige protoplasten hadden een vacuole, terwijl anderen dat niet deden. De protoplasten werden gedurende vijf minuten gekleurd met FD en tonen de florescent in cytoplasma wat aangeeft dat hoge temperatuur, 37 graden de levensvatbaarheid of protoplasten niet beïnvloedt Figuur twee.De protoplasten vertoonden geen fluorescentie in een van de calciumijzers fluorescentie-indicator of het is er niet in geladen. Toen in fluo-4/AM in de protoplast werd geladen, werd de cytoplast, maar geen vacuole werd fluorescerend. Lanthaanijzers die calciumkanalen effectief blokkeren, zijn het celmembraan dat werd toegevoegd aan de Protoplast fluo-4 / AM-belasting.Bij de uiteindelijke concentratie van 100 micromolair lanthaan verminderen ijzers de calciumfluorescentie-intensiteit aanzienlijk. Deze resultaten toonden verder aan dat fluo-4/AM effectief in de calciumijzers in de cytoplast blijft en dynamische veranderingen in het calciumijzergehalte vertoont. Figuur drie De fluo-4/AM-resultaten werden geanalyseerd met behulp van IMH-goedgekeurd plus 6.0 software fluo-4/AM-kleuring met toevoeging van lanthaanijzers verminderde de bloeiwaarde van cytoplasmatische calciumijzers aanzienlijk.In deze video werden alle protoplasten verkregen door enzymatische hydrolyse. We hebben de fluorescerende sondes met succes in een protoplast op 37 graden geladen. Bovendien had de methode geen invloed op de levensvatbaarheid van protoplasten.Samengevat wordt de hier beschreven methode in natura gedetailleerd beschreven. De dynamische veranderingen in cytoplasmatische calciumionen in appelpulpcellen bieden daardoor 10 gelijke ondersteuningen voor het verdere doel van calciumgerelateerde studies.

staining-the-cytoplasmic-ca2-with-fluo-4am-in-apple-pulp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Spontane activiteit van de ontwikkeling van neuronale netwerken kan worden gemeten met behulp van AM-ester vormen van calcium-gevoelige indicator kleurstoffen. Veranderingen in de intracellulaire calcium, met vermelding van neuronale activatie, worden gedetecteerd als voorbijgaande veranderingen in de indicator fluorescentie met een-of twee-foton beeldvorming. Dit protocol kan worden aangepast voor een bereik van hun ontwikkeling afhankelijk van neuronale...

Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks

In this video, we describe a staining procedure to visualize cellulose deposition within cell walls of Arabidopsis thaliana, a dicot plant, using calcofluor white, which specifically binds to β-linked glucans, exhibiting fluorescence under UV light.

Calcofluor White Staining: A Simple Method for UV-Induced Fluorescence Visualization of Cellulose Deposits in Cell Walls of Dicot Plant Stem Sections

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

De samenstelling van de plantencelwand varieert tussen weefselsoorten en kan lignine, cellulose, hemicellulosen en pectine omvatten. Er zijn verschillende kleuringstechnieken ontwikkeld om verschillen op celtypeniveau te visualiseren. Dit artikel is een samenstelling van veelgebruikte celwandkleuringstechnieken.

Histochemische kleuring van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Secundaire celwand Elements

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Hier wordt een methode beschreven om plantenweefsels transparant te maken met behoud van de stabiliteit van fluorescerende eiwitten. Deze techniek vergemakkelijkt diepe beeldvorming van geklaarde plantenweefsels zonder fysieke doorsnede.

Optische clearing van plantenweefsels voor fluorescentiebeeldvorming

Leer hoe u cytosolische Ca²⁺ in appelprotoplasten kunt detecteren met Fluo-4/AM. Deze methode maakt snelle, niet-invasieve calciumbeeldvorming mogelijk voor onderzoek naar fruitontwikkeling.

Kleuring van de Cytoplasmatische Ca²⁺ met Fluo-4/AM in Appelpulp

Meer video's verkennen