Analyse van het lymfekliervolume door ultra-hoogfrequente echografie in het Braf / Pten genetisch gemanipuleerde muismodel van melanoom

Onze methode maakt het mogelijk om de toename van gemetastaseerde betrokkenheid van inguinale lymfeklieren te monitoren door de toename van hun volume te meten. Deze niet-invasieve methode wordt zeer goed verdragen, daarom kunnen meerdere beeldvormingssessies in de loop van twee weken op hetzelfde proefdier worden gepland. Deze methode is ideaal voor het beoordelen van de impact van farmacologische behandeling op gemetastaseerde ziekte.

We hebben deze methode toegepast op het Braf/Pten melanoommodel, maar in principe kan het worden aangepast om de werkzaamheid van verschillende geneesmiddelen te beoordelen in verschillende preklinische muismodellen van gemetastaseerde kanker. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Marianna Vitiello, een postdoc uit mijn laboratorium, en Dr. Claudia Kusmic, collega-onderzoeker bij IFC-CNR. Breng voor melanoominductie drie microliter vijf millimolair 4-hydroxytamoxifen aan op ongeveer één vierkante centimeter geschoren huid van de bovenrug gedurende drie dagen op rij.

Gebruik zes weken na het schilderen van de huid remklauwen om het volume van de primaire tumor en uiteindelijk van subcutane metastasen te meten. Gebruik vervolgens echografie om het volume van de inguinale lymfeklieren te meten. Na het analyseren van de primaire tumor en lymfeklieren door visuele inspectie, snijdt u ze weg voor histologische studies.

Na bevestiging van de anesthesie, breng het dier over naar een verwarmde plank van het ultra-hoogfrequente echografiestation en houdt het dier in rugligging. Pas de boardtemperatuur aan met behulp van een rectale sonde gesmeerd met vaseline om de lichaamstemperatuur van de muis in het fysiologische bereik te houden. Bekleed de voor- en achterpoten met geleidende pasta en plak ze op de ECG-plaatelektroden die in het bord zijn ingebed.

Controleer of de fysiologische parameters correct zijn verkregen en weergegeven. Verwijder het haar van beide inguinale gebieden door een ontharingsmiddel aan te brengen en bedek ze met een akoestisch koppelingsmedium. Klem vervolgens de ultra-hoogfrequente ultrasone lineaire sonde in een gespecialiseerde 3D-motor die is ingebed in het beeldvormingsstation, waardoor geautomatiseerde en stapsgewijze beweging van de sonde mogelijk is.

Oriënteer en pas de positie van de ultrasone sonde goed aan om kort toegankelijke beelden van de inguinale lymfeklier te verkrijgen en plaats het interessegebied de focuszone. Stel de scanafstand in tussen twee en vijf millimeter, stapgrootte op 44 micrometer met een resultaat van 46 tot 114 scanstappen per lymfeklierschijf en een acquisitietijd van één tot drie minuten per dier. Scan het volledige volume van de inguinale lymfeklier als een reeks 2D B-modusbeelden en verkrijg beelden op meerdere niveaus door lineaire beweging van de transducer met stapgroottes op micrometerschaal om 3D-gegevens te genereren in termen van ademhaling en cardiale cinelussen.

Sla na beeldvorming de verkregen beelden digitaal op in raw-formaat voor verdere offline analyses. Voor nabewerking van echografiebeelden opent u de dataset van de 3D-inguinale lymfeklierafbeeldingen, selecteert u de multi-slice-methode en drukt u op de startknop om zowel de huidige frames als de miniaturen van alle frames te visualiseren die overeenkomen met elk beeld dat tijdens de 3D-acquisitie is vastgelegd. Selecteer de miniatuur van het eerste frame waar de lymfeklier zichtbaar is om deze in de contourweergave te laden.

Klik in de contourweergave met de linkermuisknop om punten langs de rand van de lymfeklier te laten vallen. Zodra het gewenste aantal punten is ingesteld, lik je naar rechts om de contour te voltooien. Nadat de eerste contour is voltooid, gebruikt u de miniatuurweergave om de volgende afbeelding voor contouren te selecteren.

Sla indien nodig meerdere afbeeldingen over tussen contouren om het aantal handmatige sporen dat nodig is voor elk 3D-volume te verminderen. Herhaal dit proces totdat het volledige volume is geschetst en klik vervolgens op Voltooien. Klik in de werkruimte van het 3D-modusvenster op het pictogram voor volumemeting onder het afbeeldingsweergavegebied om de numerieke waarde van het lymfekliervolume te visualiseren en activeer de oppervlakteweergave met de 3D-weergave van het lymfekliervolume.

Het behandelen van muizen met 4-hydroxytamoxifen induceert CreER-enzymactiviteit, waardoor op genomisch niveau een omschakeling plaatsvindt van wild-type Braf naar gemuteerde Braf V600E, terwijl Pten verloren gaat. Vier weken na 4-hydroxytamoxifenbehandeling bereiken primaire tumoren een volume van 50 tot 100 kubieke millimeter en hun groei kan nog eens twee weken door remklauwen worden gemeten, waardoor een geleidelijke toename van pigmentatie wordt waargenomen in de inguinale lymfeklieren. De melanineafzettingen zijn steevast te wijten aan de aanwezigheid van uitgezaaide melanoomcellen, zoals bevestigd door immunohistochemische kleuring van het melanoomantigeen MelanA en Braf V600E.

Aan het einde van de segmentatiefase vertoonden alle secties de overlay van de externe contour van de lymfeklier. De 3D-weergaven van een rechter inguinale lymfeklier, geanalyseerd op vier, vijf en zes weken na 4-HT-behandeling, worden hier getoond. De toename in volume van de linker en rechter inguinale lymfeklieren van hetzelfde dier in de loop van de tijd werd ook gekwantificeerd.

Het wordt aanbevolen om echografie te koppelen aan geschikte immunohistochemische kleuring, zodat de aanwezigheid van kankercellen op moleculair niveau wordt bevestigd. Naast lymfeklieren kan ook het volume van subcutane metastase in de loop van de tijd worden gecontroleerd met behulp van echografie. Als het tijdsbestek van twee weken te kort is om de effecten van het onderzochte geneesmiddel te waarderen, selecteert u een meer perifere inductieplaats of een minder tumorgevoelig genotype.