Name: Modelleerslag bij muizen: focale corticale laesies door fototrombose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Leer een gestandaardiseerd fototrombotisch muismodel voor focale corticale beroerte met Rose Bengal en 561 nm laser. Deze methode biedt hoge reproduceerbaarheid en lage mortaliteit voor onderzoek naar post-stroke mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken al onze samenwerkingspartners van de Immunostroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) voor suggesties en discussies. Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse excellentiestrategie in het kader van het München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) en in het kader van de subsidies LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 en LL-112/1-1.

De experimenten die in deze video worden gerapporteerd, werden uitgevoerd volgens de nationale richtlijnen voor het gebruik van proefdieren en de protocollen werden goedgekeurd door de Duitse regeringscommissies (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland). De muizen die in deze studie werden gebruikt, waren mannelijke C57Bl/6J muizen, 10-12 weken oud, en verzonden door Charles River Germany. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde temperaturen (22 °C ± 2 °C), met een licht-donkere cyclusperiode van 12 uur en toegang tot geplet voedsel en water ad libitum.
1. Voorbereiding van het materiaal en de instrumenten
<ol><li>Los Rose Bengal op in 0,9% zoutoplossing om een uiteindelijke concentratie van 10 mg/ml te bereiken. Sluit de warmtedeken aan om het operatiegebied warm te houden en de lichaamstemperatuur van de muis tijdens anesthesie op 37 °C te houden.</li>
	<li>Bereid scharen, tangen, stukjes katoen, dexpanthenol oogzalf en hechtmateriaal voor. Bereid een spuit met zoutoplossing (zonder naald) om het operatiegebied gehydrateerd te houden. Bereid het anesthesiegas voor (100% O2 + isofluraan).</li>
</ol>2. Bereiding van het dier
<ol><li>Injecteer analgesie 30 min voor de operatie (4 mg/kg Carprofen en 0,1 mg/kg Buprenorfine).</li>
	<li>Noteer het lichaamsgewicht van de muis om de dosis roos bengalen aan te passen die moet worden geïnjecteerd (10 μL/g, d.w.z. 100 μg/g).</li>
	<li>Plaats de muis in de inductiekamer met een isofluraandebiet van 4% om hem te verdoven totdat de spontane beweging van het lichaam en vibrissae stopt.</li>
	<li>Breng de muis over in het stereotactische frame en plaats deze in een gevoelige positie met zijn neus in het anesthesiemasker. Bevestig het dier en handhaaf de isofluraanconcentratie gedurende 1 min op 4%. Verminder en handhaaf vervolgens de isofluraanconcentratie op 2%.</li>
	<li>Plaats de rectale sonde voorzichtig om de temperatuur tijdens de chirurgische ingrepen te controleren. Stel het bijbehorende feedbackgestuurde verwarmingskussen in om de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C te houden.</li>
	<li>Breng dexpanthenol oogzalf aan op beide ogen en reinig de huid en de omliggende vacht met een ontsmettingsmiddel.</li>
</ol>3. Fototrombosemodel
<ol><li>Maak een longitudinale incisie van 2,0-2,5 cm en trek je terug om de schedel bloot te leggen. Voer de schedelblootstelling uit met een enkele snede om wondcomplicaties te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder het periosteum voorzichtig met katoen en identificeer de coronale hechtingen.</li>
	<li>Zet de veiligheidsbril op, schakel de 561 nm laser in en markeer de bregma +3 mm links.</li>
	<li>Schakel de laser uit, bevestig een sticker met een gat met een diameter van 4 mm geplaatst op de hierboven genoemde gemarkeerde coördinaten.</li>
	<li>Injecteer de muis met Bengaalse roos (10 μL/g), intraperitonaal. Plaats de laserstraal op 4-5 cm van de schedel, schakel de 561 nm laser in en verlicht de schedel gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Breng twee druppels van 0,9% zoutoplossing aan op de schedel om te rehydrateren, hecht de wond en plaats het dier in een herstelkamer op 37 °C om te herstellen van anesthesie. Breng de muizen na 1 uur terug naar hun kooien in een temperatuurgecontroleerde kamer.</li>
	<li>Injecteer analgesie om de 12 uur gedurende 3 dagen na de operatie (4 mg/kg Carprofen en 0,1 mg/kg Buprenorfine).</li>
</ol>4. Schijnoperatie
<ol><li>Voer twee verschillende procedures uit voor schijnoperaties zoals beschreven in de stappen 4.1.1 en 4.1.2.<ol>
<li>Voer alle procedures identiek uit als de hierboven beschreven bewerking. Injecteer Rose Bengal zonder de laser in te schakelen. Laat de dieren na 20 minuten onder narcose 1 uur in de herstelkamer blijven om te herstellen, voordat ze worden teruggebracht naar hun kooien.</li>
		<li>Voer alle procedures identiek uit als de hierboven beschreven bewerking en schakel de laser in. Injecteer Rose Bengal niet. Na 20 minuten laserverlichting, laat de dieren 1 uur in de herstelkamer blijven om te herstellen van anesthesie, voordat ze worden teruggebracht naar hun kooien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Laser spikkel
<ol><li>Sluit de verwarmde deken aan om het operatiegebied warm te houden en de lichaamstemperatuur van de muis tijdens anesthesie op 37 °C te houden.</li>
	<li>Plaats de muis in de inductiekamer met een isofluraandebiet van 4% om deze te verdoven totdat de spontane beweging van het lichaam en vibrissae stopt en breng de muis vervolgens over in het stereotactische frame.</li>
	<li>Plaats de muis in een gevoelige positie met zijn neus in het anesthesiemasker. Fixeer het dier en handhaaf de isofluraanconcentratie op 4% gedurende 1 min. T kip verminderen en handhaven op 2%.</li>
	<li>Plaats de rectale sonde voorzichtig om de temperatuur tijdens de chirurgische ingrepen te controleren. Stel het bijbehorende feedbackgestuurde verwarmingskussen in om de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C te houden en breng dexpanthenol oogzalf aan op beide ogen. Reinig de huid en de omliggende vacht met een ontsmettingsmiddel.</li>
	<li>Maak een longitudinale incisie van 2,0-2,5 cm en trek je terug om de schedel bloot te leggen. Voer de schedelblootstelling uit met een enkele snede om wondcomplicaties te voorkomen.</li>
	<li>Plaats het sterotactische frame onder de laservlek en pas de hoogte aan om een scherp beeld te krijgen. Richt de LSI-camera (Laser Speckle Perfusion Imaging) op het schedelvenster. Configureer het LSI-camerasysteem (High Resolution Laser Speckle Imaging) zoals eerder beschreven15.</li>
	<li>Verkrijg gegevens uit een gezichtsveld van 1 cm x 1 cm met behulp van een golflengte van 785 nm en lasers van 80 mW met een framesnelheid van 21 beelden/s op een werkafstand van 1 cm gedurende 1 min.</li>
	<li>Breng na beeldvorming twee druppels van 0,9% zoutoplossing aan op de schedel om te rehydrateren, hecht de wond en plaats het dier in een herstelkamer bij 37 °C om gedurende 1 uur te herstellen van anesthesie. Breng de muizen na 1 uur terug naar hun kooien in een temperatuurgecontroleerde kamer.</li>
</ol>6. Neuroscore
OPMERKING: Voor de neurologische tekortanalyse wordt een gewijzigde neurologische schaal gebruikt die in 1997 door Eckenstein et al. is gepubliceerd15.
<ol><li>Score van de dieren voor algemene (tabel 1) en focale tekorten (tabel 2). Deze samengestelde schaal varieert van 0 (geen tekorten) tot 46 (ernstige bijzondere waardeverminderingen).</li>
	<li>Voer de neuroscore elke dag op hetzelfde tijdstip uit en gebruik chirurgische kleding om een neutrale geur te behouden.</li>
	<li>Bewoon de muizen gedurende 30 minuten in de kamer met een open kooi voorafgaand aan de test en laat ze elk item gedurende 30 s observeren.</li>
</ol>7. Perfusie
<ol><li>Bereid een spuit van 20 ml met PBS-heparine (2 U/ml) voor en plaats deze 1 m boven de bank om de door de zwaartekracht aangedreven perfusie te vergemakkelijken/garanderen.</li>
	<li>Injecteer intraperitoneaal 100 μL ketamine en xylazine (respectievelijk 120/16 mg/kg lichaamsgewicht). Wacht 5 minuten en bevestig het stoppen van spontane lichaamsbeweging en vibrissae.</li>
	<li>Bevestig het dier in een liggende positie en desinfecteer het buiklichaam met 100% ethanol. Maak een 3 cm lange incisie in de buik; snijd het middenrif en de ribben door om het hart volledig te visualiseren.</li>
	<li>Maak een kleine incisie in het rechter atrium en steek de perfusie canule in de linkerventrikel en perfuseer met 20 ml PBS-heparine.</li>
	<li>Na perfusie onthoofdt u het dier en verwijdert u de hersenen, vriest u het in met droog ijs en bewaart u het bij -80 °C tot verder gebruik.</li>
</ol>8. Infarct volumetry
<ol><li>Cryosectioning: Snijd de hersenen serieel op een cryostaat tot 20 μm dikke secties om de 120 μm en monteer op dia's. Bewaar de dia's bij -80 °C tot verdere verwerking.</li>
	<li>Cresyl violet (CV) kleuring<ol>
<li>Om de kleuroplossing te bereiden, mengt u 0,5 g CV-acetaat in 500 ml H2O. Roer en verwarm (60 °C) totdat de kristallen zijn opgelost. Laat de oplossing afkoelen en bewaar deze in een donkere fles. Verwarm voor elk gebruik opnieuw op 60 °C en filter (papierfilter).</li>
		<li>Droog de dia's 30 minuten op kamertemperatuur. Plaats ze 15 minuten in 95% ethanol, gevolgd door 70% ethanol gedurende 1 min en daarna in 50% ethanol gedurende 1 min.</li>
		<li>Plaats de dia's 2 minuten in gedestilleerd water, ververs het gedestilleerde water en plaats de glijbanen 1 minuut in water. Plaats vervolgens de dia's in de voorverwarmde kleuroplossing gedurende 10 minuten bij 60 °C. Was de dia's twee keer in gedestilleerd water gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Plaats de dia's 2 min in 95% ethanol. Plaats ze vervolgens 5 minuten in 100% ethanol, ververs de 100% ethanol en plaats de dia's weer 2 minuten in 100% ethanol. Bedek daarna de dia's met een montagemedium.</li>
		<li>Analyse: Scan de dia's en analyseer het indirecte infarctvolume met de Swanson-methode16 om te corrigeren voor oedeem: Ischemisch gebied = (ischemisch gebied)-((ipsilaterale hemisfeer) - (contralaterale hemisfeer)).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Tunel kleuring(in situ apoptosis detectie kit)
<ol><li>Droog de dia's, nafix in 4% paraformaldehyde in PBS (ph 7.4) gedurende 10-20 min bij RT. Wassen in PBS, na-fix in voorgekoelde ethanol: azijnzuur 2:1 gedurende 5 min bij -20 °C.</li>
	<li>Wassen in PBS en equilibratiebuffer aanbrengen (10 s tot maximaal 60 min bij RT) en werksterkte TdT-enzym aanbrengen (1 uur bij 37 °C in bevochtigde kamer)</li>
	<li>Werksterkte stop/was enzym aanbrengen (10 min bij RT), wassen in PBS en verwarmde (RT) werksterkte anti-digoxigenine conjugaat aanbrengen (30 min bij RT in het donker)</li>
	<li>Was in PBS, incubeer 5 minuten met DAPI bij RT en monteer de dia's met fluoromount media.</li>
</ol>

<ol><li>GBD 2016 Causes of Death Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+age-sex+specific+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+Neuro+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).</li>
<li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation%3A+effect+of+aspirin+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li>
<li>Bergeron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+photochemical+cortical+lesions+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inducing photochemical cortical lesions in rat brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+ischemia+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model.</a> Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).</li>
<li>Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+infarction.+I.+Early+microvascular+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations.</a> Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).</li>
<li>Labat-gest, V., Tomasi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombotic+ischemia%3A+a+minimally+invasive+and+reproducible+photochemical+cortical+lesion+model+for+mouse+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370(2013).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journals+unite+for+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Journals unite for reproducibility.</a> Science. 346 (6210), 679(2014).</li>
<li>Llovera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+preclinical+randomized+controlled+multicenter+trial+%28pRCT%29%3A+Anti-CD49d+treatment+for+acute+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulating+multicentre+clinical+stroke+trials%3A+a+new+paradigm+for+studying+novel+interventions+in+experimental+models+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%3A+Official+Journal+of+the+INternational+Stroke+Society%22%5BJournal%5D)">Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke.</a> International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+The+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+%26+Pharmacotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).</li>
<li>Llovera, G., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+step+in+translational+research%3A+lessons+learned+from+the+first+preclinical+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial.</a> Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).</li>
<li>Gnyawali, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retooling+laser+speckle+contrast+analysis+algorithm+to+enhance+non-invasive+high+resolution+laser+speckle+functional+imaging+of+cutaneous+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation.</a> Scientific Reports. 7, 41048(2017).</li>
<li>Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+differences+in+the+early+detection+of+breast+cancer+in+metropolitan+Detroit%2C+1978+to+1987%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987.</a> Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423(2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).</li>
<li>Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).</li>
<li>Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice%3A+permanent+coagulation+of+the+distal+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729(2014).</li>
<li>Cramer, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+widefield+calcium+imaging+of+the+mouse+cortex+for+analysis+of+network+connectivity+in+health+and+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease.</a> Neuroimage. 199, 570-584 (2019).</li>
<li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+morphological+analysis+of+microglia+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Automated morphological analysis of microglia after stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).</li>
<li>Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo-A+targeted+therapy+promotes+vascular+repair+and+functional+recovery+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).</li>
<li>Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).</li>
<li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+%28Mus+musculus%29+after+a+focal+motor+cortex+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).</li>
<li>Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonocclusion+and+spontaneous+recanalization+rates+in+acute+ischemic+stroke%3A+a+review+of+cerebral+angiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies.</a> Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).</li>
<li>Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardware+and+methodology+for+targeting+single+brain+arterioles+for+photothrombotic+stroke+on+an+upright+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope.</a> Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende belangen om bekend te maken.

Het gepresenteerde protocol beschrijft het experimentele beroertemodel van fototrombose door de intacte schedel te verlichten met een 561 nm laser, met een eerdere intraperitoneale injectie van Rose Bengal. Tot voor kort was het gebruik van dit model laag, maar neemt het gestaag toe.
Mortaliteit tijdens beroerte-inductie in dit model is afwezig. De totale mortaliteit van minder dan 5% ontstaat tijdens de operatie als gevolg van anesthesiologische complicaties of opoffering na het voldoen aan d...

Ischemische beroerte blijft een belangrijkste doodsoorzaak en verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen in de 21e eeuw goed voor ongeveer 2,7 miljoen sterfgevallen in 2017 wereldwijd1. Zelfs met de enorme inspanningen van de wetenschappelijke gemeenschap zijn er weinig behandelingen beschikbaar. Bovendien zijn deze reeds beperkte opties met zulke hoge uitsluitingscriteria niet toegankelijk voor veel patiënten, wat resulteert in een dringende behoefte aan nieuwe behandelingen om het functionele herstel na een beroerte te verbeteren.
Gezien de onbekwaamheid van in vitro modellen om de complexe interacties van de hersenen te repliceren, zijn diermodellen essentieel voor preklinisch beroerteonderzoek. Muizen zijn het meest gebruikte diermodel op het gebied van beroerteonderzoek. De meeste van deze muismodellen zijn gericht op het induceren van infarcten door het blokkeren van de bloedstroom in de middelste cerebrale slagader (MCA), omdat de meerderheid van de menselijke beroerte laesies zich in het MCA-gebiedbevinden 2. Hoewel deze modellen de laesies van menselijke beroertes beter samenvatten, omvatten ze geconvuleerde operaties met een hoge variabiliteit van het infarctvolume.
Sinds Rosenblum en El-Sabban's voorstel van het fototrombotische model in 19773, en later de toepassing van dit model op ratten Watson et al.4, is het op grote schaal gebruikt in ischemisch beroerteonderzoek5,6. Het fototrombotische beroertemodel induceert een lokaal en gedefinieerd corticale infarct als gevolg van de fotoactivatie van een lichtgevoelige kleurstof die eerder in de bloedstroom werd geïnjecteerd. Dit veroorzaakt lokale trombose van de vaten in de gebieden die aan licht worden blootgesteld. Kortom, bij blootstelling aan licht van de geïnjecteerde lichtgevoelige kleurstof wordt gelokaliseerd oxidatief letsel van het endotheelcelmembraan geïnduceerd, wat leidt tot trombocytenaggregatie en trombusvorming, gevolgd door lokale verstoring van de cerebrale bloedstroom7.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in de eenvoud van uitvoering en de mogelijkheid om de laesie naar het gewenste gebied te leiden. In tegenstelling tot andere experimentele beroertemodellen is kleine chirurgische expertise nodig om het fototrombotische beroertemodel uit te voeren, omdat de laesie wordt geïnduceerd door verlichting van de intacte schedel. Bovendien kunnen de goed afgebakende grenzen ( figuur 2A en figuur 5B) en de flexibiliteit om de laesie naar een specifiek hersengebied te induceren, de studie van cellulaire reacties binnen het ischemische of intacte corticale gebiedvergemakkelijken 8. Om deze redenen is deze aanpak geschikt voor de studie van cellulaire en moleculaire mechanismen van corticale plasticiteit.
In de afgelopen decennia is de groeiende bezorgdheid over het gebrek aan reproduceerbaarheid tussen onderzoeksgroepen bedacht als de zogenaamde replicatiecrisis9. Na de coördinatie van de eerste preklinische gerandomiseerde gecontroleerde multicenter studie in 201510, een voorgesteld instrument om preklinisch onderzoek11,12,13te verbeteren , werd bevestigd dat een van de oorzaken van falende reproduceerbaarheid tussen preklinische studies van onafhankelijke laboratoria het ontbreken van voldoende standaardisatie van experimentele beroertemodellen en uitkomstparameters14was . Toen het ImmunoStroke-consortium werd opgericht (https://immunostroke.de/), een samenwerking die tot doel heeft hersen-immuuninteracties te begrijpen die ten grondslag liggen aan de mechanistische principes van beroerteherstel, was de standaardisatie van alle experimentele beroertemodellen tussen elke onderzoeksgroep essentieel.
Hier wordt de gestandaardiseerde procedure beschreven voor de inductie van het fototrombotische model zoals gebruikt in het bovengenoemde onderzoeksconsortium. Kortom, een dier onderging verdoving, kreeg intraperitonaal een Rose Bengal injectie (10 μL/g) en de intacte schedel, 3 mm links van bregma, werd onmiddellijk verlicht door een 561 nm laser gedurende 20 min (Figuur 1). Bovendien wordt een gerelateerde histologische en gedragsmatige methode gerapporteerd om het resultaat van de beroerte in dit model te analyseren. Alle methoden zijn gebaseerd op standaard operationele procedures die in het laboratorium zijn ontwikkeld en gebruikt.

<table><tbody><tr><td>561 nm wavelenght laser</td><td>Solna</td><td>Cobolt HS-03</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesiesysteem voor isofluraangebruik</td><td>Draeger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen-zalf</td><td>Bayer</td><td>1578681</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J-muizen</td><td>Charles River</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Collimeter</td><td>Thorlabs</td><td>F240APC-A</td><td></td></tr><tr><td>Cotons</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedarf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedarf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedarf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Macherey-Nagel</td><td>432018</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsdeken</td><td>FHC DC temperatuurregelaar</td><td>&nbsp;40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Isopentaan</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Speckle</td><td>Perimed</td><td>PeriCam PSI HR</td><td></td></tr><tr><td>Grote schaar</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing PH: 7,4</td><td>Apotheke Innenstadt Uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Beschermende bril</td><td>Laser 2000</td><td>NIR-ZS2-38</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>198250-5G</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit montagemedium</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Zoutoplossing</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactische frame</td><td>Stoelting</td><td>51500U</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelleerslag bij muizen: focale corticale laesies door fototrombose

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Beroerte is een belangrijke doodsoorzaak en verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen. Ondanks uitgebreid onderzoek naar nieuwe therapeutische strategieën, blijven er beperkte therapeutische opties voor beroertepatiënten. Daarom is meer onderzoek nodig voor pathofysiologische trajecten zoals post-beroerte ontsteking, angiogenese, neuronale plasticiteit en regeneratie. Gezien het onvermogen van in vitro modellen om de complexiteit van de hersenen te reproduceren, zijn experimentele beroertemodellen essentieel voor de analyse en daaropvolgende evaluatie van nieuwe medicijndoelen voor deze mechanismen. Bovendien zijn gedetailleerde gestandaardiseerde modellen voor alle procedures dringend nodig om de zogenaamde replicatiecrisis te overwinnen. Als een inspanning binnen het immunostroke onderzoeksconsortium wordt een gestandaardiseerd fototrombotisch muismodel beschreven met behulp van een intraperitoneale injectie van Rose Bengal en de verlichting van de intacte schedel met een 561 nm-laser. Dit model maakt de prestaties van beroerte bij muizen mogelijk met toewijzing aan elk corticale gebied van de hersenen zonder invasieve chirurgie; dus, waardoor de studie van beroerte in verschillende gebieden van de hersenen mogelijk is. In deze video worden de chirurgische methoden van beroerte-inductie in het fototrombotische model samen met histologische analyse gedemonstreerd.

Het hier beschreven model is een fototrombotisch beroertemodel van Rose Bengalen injectie en intacte schedelverlichting gedurende 20 minuten, bij een constante golflengte van 561 nm en een uitgangsvermogen van 25 mW bij de vezel. Hoewel de volledige fototrombotische operatie 30 minuten duurt, wordt het dier onder lage anesthesie gehouden en is de hersenbeschadiging matig. Ongeveer 10 minuten na overdracht naar hun kooien waren alle dieren wakker, vrij bewegend in de kooi en interactie met nestgenoten.
<p class="jove_...

Hier beschreven is het fototrombotische beroertemodel, waarbij een beroerte wordt geproduceerd door de intacte schedel door permanente microvasculaire occlusie op te wekken met behulp van laserverlichting na toediening van een lichtgevoelige kleurstof.

Modelleerslag bij muizen: focale corticale laesies door fototrombose

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

De fototrombose beroerte model benadering kan door geschikt voor cellulaire en moleculaire studies van corticale plasticiteit vanwege de beperkte grenzen en flexibiliteit om letsel te induceren in verschillende gebieden van de cortex. Drie belangrijkste voordelen onderscheiden het fototrombosemodel van andere beroertemodellen, de mogelijkheid om de laesie naar het gewenste gebied te leiden, het is hoge reproduceerbaarheid en lage mortaliteit. Een goede rose bengalen dosering is van cruciaal belang voor het succes en voor de stabiliteit van het model.Resultaten zijn afhankelijk van technische specificaties zoals laservermogen, timing van kruistoepassingen en optische shilling van de niet-aangetaste cortex. Begin met het oplossen van rozenbengalen in 0,9% zoutoplossing voor een uiteindelijke concentratie van 10 milligram per milliliter. Steriliseer alle instrumenten zorgvuldig met behulp van een hot lead sterilisator en desinfecteer alle oppervlakken voor en na de operatie met een microbiële desinfecterende spray.Bereid een spuit gevuld met zoutoplossing voor om het operatiegebied gehydrateerd te houden en bereid het anesthesiegas voor. Meet het lichaamsgewicht van de muis om de dosi

modeling-stroke-in-mice-focal-cortical-lesions-by-photothrombosis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the procedure to generate photothrombotic stroke in a mouse model by laser illumination of an intact skull following administration of photosensitive dye.

Modeling Photothrombotic Stroke in Mouse Model: A Laser Illumination Technique Through Mouse Skull Following Photosensitive Dye Administration to Induce Photothrombosis

Photothrombosis is een snelle, minimaal-invasieve techniek voor het induceren van kleine en goed afgebakende infarct in gebieden die van belang zijn in zeer reproduceerbare wijze. Het is bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.

Fototrombotisch Ischemie: Een minimaal invasieve en Reproduceerbaar Fotochemisch corticale laesie Model voor Mouse Stroke Studies

Verschillende muismodellen van midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) worden veel gebruikt in experimenteel onderzoek hersenen. Hier tonen we het model van transcraniële permanente distale MCAO die consistent zijn corticale infarct van een omvang die overeenkomt met die door de meerderheid van de menselijke ischemische beroertes schade veroorzaakt.

Modellering Stroke in Muizen: Permanente Coagulatie van de distale midden cerebrale slagader

Hier beschrijven we een semi-invasieve optische microscopiebenadering voor het induceren van een Rose Bengal fototrombotrotisch stolsel in de somatosensorische cortex van een muis in vivo. De technische aspecten van de beeldvormingsprocedure worden beschreven, van de inductie van een fototrombotrotisch evenement tot de toepassing en gegevensverzameling.

Rose Bengal Photothrombosis door confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Single Vessel Stroke

Fototrombose is een minimaal invasieve en zeer reproduceerbare procedure om focale ischemie in het ruggenmerg te induceren en dient als een model voor ruggenmergletsel bij muizen.

Photothrombosis-geïnduceerde focale ischemie als een model van Spinal Cord Injury in Muizen

Dit manuscript beschrijft een modellering techniek van kapselvorming infarct. Hier hebben we gebruik gemaakt van een gemodificeerde fototrombotisch techniek met een lage intensiteit van het licht na de pre-operatie doel mapping. Met behulp van deze techniek, hebben we een omgeschreven kapselvorming infarct model met aanhoudende motorische handicap.

Omgeschreven Capsular Infarct Modeling Met behulp van een fototrombotisch Techniek

Traditionele modellen met fototrombotische beroerte (PTS) induceren voornamelijk dichte bloedplaatjesaggregaten met een hoge weerstand tegen weefselplasminogeenactivator (tPA)-lytische behandeling. Hier wordt een gemodificeerd muizen PTS-model geïntroduceerd door trombine en lichtgevoelige kleurstof samen te injecteren voor fotoactivering. Het trombine-versterkte PTS-model produceert gemengde bloedplaatjes:fibrinestolsels en is zeer gevoelig voor tPA-trombolyse.

Een fibrine-verrijkt en tPA-gevoelig fototrombotisch beroertemodel

Verschillende modellen van middelste cerebrale arterie occlusie (MCAo) worden gebruikt in experimenteel beroerteonderzoek. Hier wordt een experimenteel beroertemodel van voorbijgaande MCAo via de externe halsslagader (ECA) beschreven, dat tot doel heeft een menselijke beroerte na te bootsen, waarbij de cerebrovasculaire trombus wordt verwijderd als gevolg van spontane stolsellysis of therapie.

Modellering beroerte bij muizen: transiënte middelste cerebrale arterie occlusie via de externe halsslagader

Met behulp van een volledig optische benadering wordt een ischemische beroerte geïnduceerd terwijl tegelijkertijd neuronaleCa 2+ -activiteit wordt geregistreerd met behulp van een fluorescerende biosensor in de opkomende beroertekern van een wakkere, zich gedragende muis.

Gelijktijdige fototrombose en vezelfotometrie om ischemische beroerte te induceren en te bewaken bij zich gedragende muizen

Dit protocol biedt een geïntegreerde methode die virale aflevering, implantatie van optroden, fototrombotische inductie, gelijktijdige registratie van astrocyten- en neuronale activiteit, en optogenetische stimulatie van astrocyten omvat. Deze geïntegreerde methode heeft als doel gelijktijdig onderzoek te bieden naar de relatie tussen astrocyten en neuronen over de acute tot chronische stadia van ischemische beroerte.

Een geïntegreerde methode voor fototrombotische beroertemodellering en in vivo optroderegistratie van neuronale en astrocytische activiteit bij zich gedragende muizen

Leer een gestandaardiseerd fototrombotisch muismodel voor focale corticale beroerte met Rose Bengal en 561 nm laser. Deze methode biedt hoge reproduceerbaarheid en lage mortaliteit voor onderzoek naar post-stroke mechanismen.

Modelleerslag bij muizen: focale corticale laesies door fototrombose

Meer video's verkennen