Opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg

Het visualiseren van de opname van kleine extracellulaire blaasjes, ook bekend als sEV's, door verschillende cellen in het ruggenmerg, kan een succesvolle levering van sEV's bevestigen. Dit maakt zowel mechanistische als therapeutische studies van intrathecaal toegediende sEV's uit verschillende bronnen in rodenmodellen mogelijk. Dit protocol kan worden gebruikt om de opname van sEV's door cellen in een mild ruggenmerg te visualiseren en kan helpen bij het evalueren van de rol van sEV's en zijn ladingmoleculen bij spinale aandoeningen, pijn en ontsteking.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door mij, samen met en Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, de twee afgestudeerde studenten in het laboratorium van Dr. Seena Ajit. Begin met het plaatsen van 18 millimeter afdekslips in de 12-putplaat en vervolgens plaat neuro-2a-cellen in elke put met een totaal van 1 milliliter complete DMEM met 10% FBS en 1% pen strep. Wanneer de vloeiendheid van het celgetal 80 tot 90% heeft bereikt, verandert het medium in DMEM exosoom uitgeput medium in elke put één, 5 of 10 microgram gelabelde sEV's toe.

Voor 1, 4 en 24 uur. Voor dosis- en tijdsafhankelijke opname naar de rest van de putten bij een gelijk volume van kleurstofcontrole. Verzamel de hersenen van postnatale pups in een petrischaaltje van 60 millimeter met ijskoude Hanks uitgebalanceerde zoutoplossing aangevuld met 10 millimolar hepes, ontleed beide corticale kwabben en verwijder de hersenvliezen.

Gehakt vervolgens de weefsels met een gesteriliseerd mes. Breng de weefsels over in een conische buis van 15 milliliter met Pepane of deoxyribonucleus één dissociatiebuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius, draai de buis elke 5 minuten, zuig het supernatant op en voeg 5 milliliter volledige DMEM toe aan de buis. Om de enzymactiviteit te inactiveren, probeert u zorgvuldig te beoordelen om de weefsels te dissociëren met een glazen serologische pipet van 5 milliliter en een vlam gepolijste weidepipet.

Laat de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer gaan en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius op 250 maal G, zuig het medium op en zie de cellen in 10 milliliter complete DMEM in een kolf van 75 vierkante centimeter. Vervang na 4 uur beplating de supernate en medium door 15 milliliter vers DMEM-medium. Na 14 dagen in vitro om de microglia en oligodendrocyten los te maken, brengt u de kolf gedurende 6 uur over naar een orbitale shaker bij 320 RPM.

Gebruik 5 milliliter van het celdissociatie-enzym gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Om te tripsinize, de resterende astrocyten, om de enzymatische actie te inactiveren, voeg een 5 milliliter volledige DMEM toe en pelleteer vervolgens de cellen op 250 keer G gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Resuspend de cellen in volledige DMEM en zie de cellen op de 12 millimeter nummer 1.5 cover slips in een 24 putplaat.

Spoel de cellen met PBS 3 keer en fixeer ze vervolgens met 4% power formaldehyde of PFA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen 3 keer gedurende 5 minuten met PBS en permeabiliseer ze met 0,1% Triton X 100 in PBS gedurende 10 tot 15 minuten. Herhaal vervolgens de wasbeurten met PBS.

Gebruik 5% normaal geitenserum of NGS in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de cellen te blokkeren, incubateer de neuro-2a-cellen met kaart tweewegantistoffen en de primaire astrocyten met GFAP-antilichamen in een verhouding van 1 tot 500 in verse 5% NGS of PBS 's nachts bij 4 graden Celsius met zacht schudden. Na het wassen van de cellen 3 keer in PBS, voeg de fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen toe in 5% NGS. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht op een rocker.

Herhaal het wassen met PBS en incubeer de cel met 1 microgram per milliliter DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen nogmaals 3 keer met PBS. Gebruik een anti-fade montagemedium, monteer de afdekplaatjes op nummer 1-dia's, laat ze een nacht drogen in het donker en bewaar de voorbereide glasdia's bij 4 graden Celsius totdat ze op een confocale microscoop worden gefotopoliseerd.

Ontleed het ruggenmerg en fixeer het in 4% PFA in PBS bij 4 graden Celsius gedurende 24 uur. Bescherm de weefsels vooraf in 30% sucrose in PBS bij 4 graden Celsius gedurende 24 uur of totdat de weefsels zinken en bewaar de weefsels vervolgens bij 4 graden Celsius tot immunohistochemie, inbedding van het L4 L5-ruggenmerg in OCT-verbinding en vries het vervolgens in op droogijs totdat het volledig is gestold. Gebruik een cryostaat om de weefsels op 30 micrometer te delen en verzamel de secties in een 24 putplaat met PBS.

Was de secties 3 keer gedurende 5 minuten elk met 0,3% Triton in PBS, Blokkeer de niet-specifieke bindingsplaatsen met 5% MGS in 0,3% Triton PBS gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Incubeer de secties 's nachts bij 4 graden Celsius op een shaker. Was de secties 3 keer gedurende 5 minuten met 0,3% Triton in Pbs.

Voeg vervolgens de juiste concentratie van de secundaire antilichamen toe. Volgens het tekstmanuscript, incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur, was de secties met alleen PBS en incubeer ze in 1 microgram per milliliter DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal vervolgens de PBS-wasbeurten onder een lichtmicroscoop, monteer de secties op een doorzichtige zelfklevende dia met een fijne verfkwast.

Maak de afdekslip nat met het montagemedium en laat 's nachts in het donker bij kamertemperatuur uitharden, verkrijg beelden onder een confocale microscoop met de respectieve lasers, De gemiddelde gemiddelde grootte van RA 2 6 4 0,7 afgeleide sEV's was 140 nanometer en de piekdeeltjesgrootte was 121,8 nanometer. Met de meest detecteerbare deeltjes die binnen het groottebereik van exosomen of sEVS vallen. Bij 50 tot 150 nanometer toonde western blotting van sEV's, Cell Lysate en exodepleted Media aan dat sEV-afgeleide eiwitmonsters de sEV-markereiwitten Alix CD81 en GAPDH bevatten.

Het cellysaat was verrijkt met endoplasmatisch reticulum, resident eiwit Calnexin dus Calnexin diende als een negatieve marker voor cellulaire besmetting omdat het afwezig was in de sEV's. Er werd waargenomen dat de opname van sEV's plaatsvond na 1 uur en voor de 1, 5 en 10 microgram sEV's kon post-incubatiefluorescentie worden gedetecteerd na 4 uur, voor 4, 5 en 10 microgram sEV's. De opname van PKH 26 gelabelde sEV's door primaire astrocyten werd onderzocht en maximale fluorescentie van sEVS-opname in primaire corticale astrocyten vond plaats na 24 uur PKH26-gelabelde sEV's werden opgenomen en maximale fluorescentie werd waargenomen na 6 uur, na injectie in neuronen astrocyten en microgliale cellen.

De opname van bedieningselementen, ongelabelde sEV's en kleurstofcontrole creëert code voor een wind vals positieve recente signalen als gevolg van nu specifieke labeling Opry-dans van Unbound dye patch coasts. De opname van seVs kan worden bevestigd door de overdracht van biomoleculaire lading naar recept en cellen en weefsels te onderzoeken en de veranderingen in expressieniveaus van biomoleculen of doelgenen te bepalen. Gedragsstudies kunnen ook worden uitgevoerd om de functionele impact van sEV-levering te onderzoeken.