Name: Opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer fluorescente labeling van kleine extracellulaire blaasjes voor neurobiologisch onderzoek in het ruggenmerg. Deze methode visualiseert opname door astrocyten en neuronen om therapeutische strategieën te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van NIH NINDS R01NS102836 en het Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) toegekend aan Seena K. Ajit. We bedanken Dr. Bradley Nash voor het kritisch lezen van het manuscript.

OPMERKING: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Institutional Animal Care & Use Committee van Drexel University College of Medicine. Getimed zwangere CD-1-muizen werden gebruikt voor astrocytische cultuur en alle dammen werden 15 dagen na impregnatie ontvangen. Tien-twaalf weken oude C57BL/6 muizen werden gebruikt voor in vivo opname-experimenten.
1. Isolatie van sEV's van RAW 264.7 macrofaagcellen
<ol><li>Kweek RAW 264,7 cellen in 75 cm2 kolven in DMEM exosoom-uitgeput medium met 10% exosoom-uitgeput foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen-strep) gedurende 24-48 uur.</li>
	<li>Verzamel 300 ml geconditioneerd medium en centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Vang het supernatant op en centrifugeer bij 2.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng het supernatant over in centrifugebuizen, centrifugeer gedurende 35 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel het supernatant en filter door een spuitfilter van 0,22 μm.</li>
	<li>Breng over op ultracentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 80 minuten bij 110.000 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Bewaar het supernatant (exosoom-uitgeput medium), resuspend de pellet in 2 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifugeer gedurende 1 uur bij 110.000 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 100 μL PBS voor verdere karakterisering met behulp van nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) of in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer voor western blotting.</li>
</ol>2. Karakterisering van sEV's
<ol><li>Nanodeeltjes tracking analyse (NTA) OPMERKING: De grootteverdeling en het deeltjesaantal/de deeltjesaantal/concentratie van de gezuiverde sEV's uit RAW 264,7-cellen werden gemeten met NTA.<ol>
<li>Verdun de sEV's in gefilterd PBS om 20-60 blaasjes per gezichtsveld te verkrijgen voor optimale tracking.</li>
		<li>Plaats het verdunde monster in een stroomcel met behulp van een spuitpomp met een constant debiet.</li>
		<li>Neem 3-5 video's van elk 30 s. Stel de sluitertijd en versterking in en stel de camera-instellingen handmatig scherp om het maximale aantal blaasjes zichtbaar te maken en te kunnen volgen en analyseren.</li>
		<li>Vervroeg de monsters tussen elke opname om replicatiemetingen uit te voeren. Optimaliseer de NTA-instellingen na acquisitie en houd de instellingen constant tussen de monsters.</li>
		<li>Analyseer elke video met behulp van de NTA-software om de gemiddelde grootte en concentratie van de blaasjes te verkrijgen.</li>
		<li>Voer alle NTA-metingen uit met identieke systeeminstellingen voor consistentie.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot<ol>
<li>Kwantificeer de totale eiwithoeveelheden in sEV's, cellysaten en exosoomarme media met behulp van een eiwittestkit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Kweek voor het cellysaatpreparaat de RAW 264,7 cellen in2 kolven van 75 cm tot 80-90% confluent. Maak de cellen los met 0,25% trypsine gedurende 10-15 minuten, neutraliseer de trypsine met kweekmedia en pellet de cellen door gedurende 5 minuten met 400 × g te draaien. Resuspend de cellen in vers groeimedium.</li>
		<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en breng 1 × 106 cellen over naar een andere buis. Was de cellen tweemaal met PBS met dezelfde centrifugatiecondities als hierboven en voeg 50 μL lysisbuffer (RIPA-buffer met proteaseremmercocktail toegevoegd) toe aan de celkorrel vanaf de laatste spin.</li>
		<li>Vortex de cellen en houd ze 20 minuten op ijs. Laat het mengsel centrifugeren bij 10.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C, verzamel het supernatant (d.w.z. het lysaat) in verse microcentrifugebuizen en houd het op −80 °C tot gebruik.</li>
		<li>Concentreer 2 ml exosoomarme media tot 100 μL met behulp van 3 kDa-cutoff centrifugaalfilters voordat u de hoeveelheid eiwit kwantificeert. Meng de sEV's met lysisbuffer in een verhouding van 1:1, vortex gedurende 30 s en incubeer gedurende 15 minuten op ijs om de hoeveelheid eiwit te kwantificeren.</li>
		<li>Meng gelijke hoeveelheden eiwit (2 μg) van de sEV's, RAW 264.7-cellysaat en exosoomarme media met een afnemende monsterbuffer.</li>
		<li>Denatureer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C, houd ze 5 minuten op ijs en draai gedurende 2 minuten bij 10.000 × g. Laad de monsters op een 12% Tris-glycine eiwitgel en loop de gel gedurende 45 minuten op 125 V.</li>
		<li>Breng het eiwit over op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij 25 V gedurende 2 uur.</li>
		<li>Na de overdracht blokkeert u de PVDF-membranen met blokkeerbuffer (zie de tabel met materialen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Incubeer de vlek met primaire antilichamen op een shaker gedurende een nacht bij 4 °C. OPMERKING: Primaire antilichamen die werden gebruikt waren anti-CD81 (1:1.000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-interagerend eiwit X (Alix) (1:1.000), anti-calnexine (1:1.000) en anti-glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) (1:1.000).</li>
		<li>Was de vlekken 3 x 15 min met 1x Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% Tween 20 (TBST) en incubeer bij kamertemperatuur met geiten-anti-muis IgG-mierikswortelperoxidase (HRP)- of ezel anti-konijn IgG-HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:10.000) gedurende 1 uur op de shaker.</li>
		<li>Was de vlekken 3 x 15 min met 1x TBST en detecteer de eiwitten met behulp van een HRP-substraat.</li>
		<li>Analyseer de vlekken door verbeterde chemiluminescentie met behulp van een western blot imager.</li>
	</ol></li>
	<li>Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)<ol>
<li>Fixeer sEV's door ze te resuspenderen in 2% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (PB); vortex voor 2 x 15 s.</li>
		<li>Plaats een druppel van 10 μL sEV-suspensie op schone parafilm. Drijf het met koolstof beklede formvar-raster op de druppel met hun gecoate kant naar de ophanging gericht. Laat de membranen 20 min intrekken in een droge omgeving.</li>
		<li>Plaats de roosters (membraan met de zijkant naar beneden) op een druppel PB om 3 x 2 minuten te wassen.</li>
		<li>Breng de roosters gedurende 5 min over in 50 μL 1% glutaaraldehyde.</li>
		<li>Was de roosters met 100 μL gedestilleerd water gedurende 8 x 2 min.</li>
		<li>Contrasteer het monster door de roosters gedurende 2 minuten op een druppel van 1% uranylacetaat te plaatsen.</li>
		<li>Sluit het monster met 50 μL 0,2% uranylacetaat met 2% methylcellulose-oplossing gedurende 10 minuten in op een met parafilm bedekte ijsschaal.</li>
		<li>Gebruik roestvrijstalen lussen om de roosters vast te houden en verwijder overtollig vocht met filterpapier.</li>
		<li>Droog het rooster gedurende 10 minuten aan de lucht terwijl het nog op de lus staat.</li>
		<li>Observeer onder een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Etikettering van sEV's
<ol><li>Verdun 20 μg sEV's in 1 ml verdunningsbuffer of hetzelfde volume PBS in 1 ml verdunningsbuffer voor kleurstofbestrijding.</li>
	<li>Verdun 3 μL PKH67 of PKH26 kleurstof in 1 ml verdunningsbuffer en meng door pipetteren.</li>
	<li>Voeg verdunde PKH-kleurstof toe aan de verdunde sEV's en meng door pipetteren. Incubeer gedurende 5 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Meng voor een kleurstofcontrole de verdunde kleurstof met verdund PBS uit stap 3.1.</li>
	<li>Voeg 2 ml 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS toe aan de buis met de kleurstof en het sEV-mengsel en aan de kleurstofcontrolebuis om overtollige kleurstof te absorberen.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 uur bij 110.000 × g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg, resuspend de pellet in 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 1 uur bij 110.000 × g bij 4 °C. Herhaal de was met PBS en suspend de gelabelde sEV's of de kleurstofcontrole opnieuw in een gelijk volume PBS.</li>
	<li>Kwantificeer de hoeveelheid totaal eiwit volgens de Bradford-methode.</li>
</ol>4. Opname van sEV's door Neuro-2a-cellen
<ol><li>Plaats 18 mm coverslips in een 12-well plaat en plaat 10 × 104 Neuro-2a cellen in elke put in een totaal van 1 ml compleet DMEM-medium met 10% FBS en 1% pen-strep.</li>
	<li>Verander het medium in DMEM exosoom-uitgeput medium wanneer de celconfluentie 80-90% is. Voeg 1, 5 of 10 μg gelabelde sEV's toe in elke put gedurende 1, 4 en 24 uur voor dosis- en tijdsafhankelijke opname, of voeg een gelijk volume kleurstofcontrole toe.</li>
</ol>5. Primaire astrocytische culturen
<ol><li>Verdoving 4 postnatale pups 4 dagen na de geboorte door onderkoeling op te wekken.</li>
	<li>Verzamel de hersenen in een petrischaaltje van 60 mm met ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aangevuld met 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES).</li>
	<li>Ontleed beide corticale kwabben en verwijder de hersenvliezen. Gehakt de weefsels met een gesteriliseerd mes.</li>
	<li>Breng de weefsels over in een conische buis van 15 ml met papaïne/desoxyribonuclease I-dissociatiebuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Wervel elke 5 min. OPMERKING: Voor 4 muiscorticos wordt 9 ml van 7,5 E/ml papaïne in HBSS geactiveerd bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten, gefilterd door een spuitfilter van 0,22 μm en gemengd met desoxyribonuclease I tot een eindconcentratie van 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Aspirateer het supernatant en voeg 5 ml volledige DMEM toe om de enzymactiviteit te inactiveren. Triturateer zorgvuldig om de weefsels te dissociëren met een glazen serologische pipet van 5 ml en een vlamgepolijste Pasteur-pipet.</li>
	<li>Leid de celsuspensie door een celzeef van 40 μm en centrifugeer de cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspirateer het medium en zaai de cellen in 10 ml complete DMEM in een kolf van 75 cm2. Vervang het supernatant medium 4 uur na het platen door 15 ml vers DMEM medium.</li>
	<li>Breng na 14 dagen in vitrode kolf over in een orbitale shaker om de microglia en oligodendrocyten bij 320 tpm gedurende 6 uur los te maken.</li>
	<li>Trypsiniseren van de resterende astrocyten met behulp van 5 ml van het celdissociatie-enzym (Tabel van materialen) gedurende 10 minuten bij 37 °C. Voeg 5 ml volledige DMEM toe om de enzymatische werking te inactiveren en pelleteer de cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Resuspend de cellen in volledige DMEM. Zaad 5 × 104 cellen op 12 mm #1.5 coverslips in een 24-well plaat.</li>
</ol>6. Opname van sEV's door astrocyten
<ol><li>Wanneer astrocyten 80-90% samenvloeiing bereiken, verander je het medium in DMEM exosoom-uitgeput medium.</li>
	<li>Voeg 1 μg ongelabelde, gelabelde sEV's, een gelijk volume kleurstofcontrole of PBS toe aan de cellen. Gebruik de cellen voor kleuring 1 uur en 24 uur na sEV-behandeling.</li>
</ol>7. Immunofluorescentie
<ol><li>Spoel de cellen met PBS 3x en bevestig ze met 4% PFA in PB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de vaste cellen 3 x 5 min met PB en permeabiliseer ze met 0,1% Triton X-100 in PB gedurende 10-15 min en was met PB 3 x 5 min.</li>
	<li>Blokkeer de cellen met 5% normaal geitenserum (NGS) in PB gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubateer de cellen met primaire antilichamen: microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2A, 1:500) voor Neuro-2a cellen of glia fibrillair zuur eiwit (GFAP, 1:500) voor primaire astrocyten in verse 5% NGS/PB 's nachts bij 4 °C met zacht schudden.</li>
	<li>Was 3 x 10 minuten met PB en voeg fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; of Goat Anti-Mouse IgG H& L, Alexa Fluor 488) toe in 5% NGS en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rocker.</li>
	<li>Was 3 x 10 min met PB en incubeer met 1 μg/ml kernvlek 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Was de cellen opnieuw 3x met PB.</li>
	<li>Monteer de coverslips op #1 dia's met behulp van een antifade montagemedium. Laat ze een nacht in het donker drogen en bewaar de voorbereide glasglaasjes bij 4 °C totdat ze op een confocale microscoop worden ingebeeld.</li>
</ol>8. In vivo opname van sEV's
<ol><li>Voer intrathecale injectie uit van 5 μg niet-gelabelde of gelabelde sEV's die zijn geresuspendeerd in 10 μL PBS, of gelijk volume (10 μL) kleurstofcontrole (zoals bereid in sectie 3) in C57BL/6-muizen.</li>
	<li>Na 6 en 18 uur na injectie van sEV's, verdoven muizen diep door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine.</li>
	<li>Voer intracardiale perfusie van muizen uit met 0,9% zoutoplossing om bloed weg te spoelen, gevolgd door vers gemaakte ijskoude 4% PFA / PB.</li>
	<li>Ontleed het ruggenmerg en fixeer in 4% PFA/PB bij 4 °C gedurende 24 uur. Cryoprotect de weefsels in 30% sucrose in PB bij 4 °C gedurende 24 uur of totdat de weefsels zinken. Bewaar de weefsels bij 4 °C tot immunohistochemie.</li>
</ol>9. Immunohistochemie
<ol><li>Embed L4-L5 ruggenmerg in O.C.T verbinding. Bevries op droogijs tot het volledig gestold is.</li>
	<li>Sectie van de weefsels op 30 μm (dwarsdoorsnede voor het ruggenmerg) met behulp van een cryostaat en verzamel de secties in een 24-putplaat met PB. Was de secties 3 x 5 min met 0,3% Triton in PB.</li>
	<li>Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 5% NGS in 0,3% Triton/PB gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdun primaire antilichamen: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 voor microglia (1:2.000) met 5% NGS in 0,3% Triton/PB, en incubeer de secties 's nachts bij 4 °C op een shaker.</li>
	<li>Was de secties 3 x 5 min met 0,3% Triton/PB en voeg secundaire antilichamen (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 of Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) toe in 5% NGS/PB gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was 3 x 5 min met PB en incubeer de secties in 1 μg/ml DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de secties 3 x 5 min met PB.</li>
	<li>Monteer de secties op een schone zelfklevende dia(Table of Materials)met een fijne verfkwast onder een lichtmicroscoop.</li>
	<li>Maak de afdekplaat nat met het bevestigingsmedium. Laat een nacht in het donker uitharden bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Beeld onder een confocale microscoop met de respectievelijke lasers.</li>
</ol>

<ol><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).</li>
<li>Betzer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+strategies+for+in+vivo+tracking+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594(2020).</li>
<li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li>
<li>González, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+labeled+fluorescent+exosomes+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications.</a> Biomedicines. 9 (1), 81(2021).</li>
<li>Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91(2018).</li>
<li>vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Heinrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+using+dialkylcarbocyanine+dyes+for+cell+tracing+in+hard+and+soft+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+model+of+acute+kidney+injury+monitored+by+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).</li>
<li>Wiklander, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+in+vivo+biodistribution+is+determined+by+cell+source%2C+route+of+administration+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316(2015).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6 (1), 7029(2015).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108(2011).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+in+the+brain%3A+Biomarker%2C+messenger+or+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator.</a> Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).</li>
<li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions%3A+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).</li>
<li>Matsumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+alpha-synuclein-containing+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+across+the+blood-brain+barrier+via+adsorptive+mediated+transcytosis%3A+another+mechanism+for+initiation+and+progression+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71(2017).</li>
<li>Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transport+mechanism+of+extracellular+vesicles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).</li>
<li>Shaimardanova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+diagnosis+and+treatment+of+central+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases.</a> Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Hoen, E. N. M. N. -t, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+in+vivo+imaging+of+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 169(2018).</li>
<li>Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tracking+of+lymphocytes+in+vivo%3A+the+migration+of+PKH-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes.</a> Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).</li>
<li>Kuffler, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+sprouting+in+culture+by+motoneurons+isolated+from+the+spinal+cord+of+adult+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs.</a> Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Pužar Dominkuš, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+labeling+of+extracellular+vesicles%3A+Characterization+and+cellular+internalization+of+contaminating+PKH26+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).</li>
<li>Shimomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+lipophilic+fluorescent+dyes+for+labeling+extracellular+vesicles%3A+characterization+and+monitoring+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+taken+up+by+neurons+hijack+the+endosomal+pathway+to+spread+to+interconnected+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10(2018).</li>
<li>Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+HEK293T+extracellular+vesicle+uptake+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry.</a> Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

In dit protocol toonden we de etikettering van sEV's met PKH-kleurstoffen en de visualisatie van hun opname in het ruggenmerg. PKH lipofiele fluorescerende kleurstoffen worden veel gebruikt voor het labelen van cellen door flowcytometrie en fluorescerende microscopie3,5,6,12,24,25. Vanwege hun relatief lange halfwaardetijd en...

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn nanosized, van membraan afgeleide blaasjes met een groottebereik van 50-150 nm. Ze zijn afkomstig van multi-vesiculaire lichamen (MVP's) en komen vrij uit cellen bij fusie van de MVP's met het plasmamembraan. sEV's bevatten miRNA's, mRNA's, eiwitten en bioactieve lipiden, en deze moleculen worden overgedragen tussen cellen in de vorm van cel-naar-cel communicatie. sEV's kunnen worden geïnternaliseerd door ontvangende cellen door een verscheidenheid aan endocytische routes, en deze vangst van sEV's door ontvangende cellen wordt gemedieerd door de herkenning van oppervlaktemoleculen op zowel EV's als de doelcellen1.
sEV's hebben belangstelling gekregen vanwege hun vermogen om moleculaire en fenotypische veranderingen in acceptorcellen te veroorzaken, hun nut als therapeutisch middel en hun potentieel als dragers voor vrachtmoleculen of farmacologische agentia. Vanwege hun kleine formaat kan het afbeelden en volgen van sEV's een uitdaging zijn, vooral voor in vivo studies en klinische omgevingen. Daarom zijn er veel methoden ontwikkeld om sEV's te labelen en inbeeld te brengen om hun biodistributie en tracking in vitro en in vivo te ondersteunen2.
De meest voorkomende techniek om sEV-biodistributie en doelcelinteracties te bestuderen, omvat het labelen ervan met fluorescerende kleurstofmoleculen3,4,5,6,7. EV's werden aanvankelijk gelabeld met celmembraankleurstoffen die vaak werden gebruikt om cellen in beeld te brengen. Deze fluorescerende kleurstoffen kleuren over het algemeen de lipide dubbellaag of eiwitten van belang op sEV's. Verschillende lipofiele kleurstoffen vertonen een sterk fluorescerend signaal wanneer ze in het cytosol worden opgenomen, waaronder DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaninejodide), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanineperchloraat) en DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine 4-chloorbenzenesulfonaatzout)8,9,10,11.
Andere lipofiele kleurstoffen, zoals PKH67 en PKH26, hebben een zeer fluorescerende polaire kopgroep en een lange alifatische koolwaterstofstaart die gemakkelijk intercaleert in elke lipidestructuur en leidt tot langdurige kleurstofretentie en stabiele fluorescentie12. PKH-kleurstoffen kunnen ook EV's labelen, waardoor ev-eigenschappen in vivo kunnen wordenbestudeerd13. Veel andere kleurstoffen zijn gebruikt om exosomen te observeren met behulp van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie, waaronder lipide-labelende kleurstoffen14 en celdoorlatende kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester (CFDA-SE)15,16 en calceïne acetoxymethyl (AM) ester17.
Studies van sEV-gemedieerde kruisverwijzing tussen verschillende cellen in het CZS hebben belangrijke inzichten opgeleverd over de pathogenese van neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten18. SEV's van neuronen kunnen bijvoorbeeld bèta-amyloïde peptiden en gefosforyleerde tau-eiwitten verspreiden en helpen bij de pathogenese van de ziekte van Alzheimer19. Bovendien bevatten EV's afgeleid van erytrocyten grote hoeveelheden alfa-synucleïne en kunnen ze de bloed-hersenbarrière passeren en bijdragen aan de pathologie van Parkinson20. Het vermogen van sEV's om fysiologische barrières21 te overschrijden en hun biomoleculen over te brengen naar doelcellen maakt ze handige hulpmiddelen om therapeutische geneesmiddelen aan het CZS te leveren22.
Het visualiseren van sEV-opname door talloze CZS-cellen in het ruggenmerg zal zowel mechanistische studies als de evaluatie van de therapeutische voordelen van exogene toegediende sEV's uit verschillende cellulaire bronnen mogelijk maken. Dit artikel beschrijft de methodologie om sEV's afgeleid van macrofagen te labelen en hun opname in vitro en in vivo in het lumbale ruggenmerg door neuronen, microglia en astrocyten in beeld te brengen om de sEV-levering door visualisatie kwalitatief te bevestigen.

```html
<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL centrifugale filters</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alix Antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin Antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD81 Antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Monoklonaal Antilichaam (14C10)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 voor IF; 1:1000 voor IHC</td></tr><tr><td>Anti-Iba1 Antilichaam</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anti-MAP2A Antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Rundvlees Serum Albumine (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 40 &mu;m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12.000 x g</td></tr><tr><td>Dekglas, 12-mm, #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas, 18-mm, #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Ezel Anti-Konijn IgG H&amp;L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Ezel Anti-Konijn IgG H&amp;L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Dubbel Voorgefreesde Microscoopglazen, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS zonder Calcium en Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Exosome-Gedepleteerde Foetale Rundserum</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Rundserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M beeldvormingssysteem</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Confocale Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geit Anti-Muis IgG H&amp;L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Geit Anti-Muis IgG H&amp;L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Geit Anti-Muis IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Substraat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Intercept blokkeerbuffer, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Sample Buffer</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dekglazen, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 systeem</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 software</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuro-2a Cellijn</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normaal Geitenserum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Transfer Membraan</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 Cellijn</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>adhesief glas</td></tr><tr><td>T-75 Flasks</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Digitale Transmissie-elektronenmicroscoop</td><td>FEI Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Eiwitgel, 12%</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>celdissociatie enzym</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,25%</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuizen</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110.000 x g</td></tr></tbody></table>
```

opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn 50-150 nm blaasjes die door alle cellen worden uitgescheiden en aanwezig zijn in lichaamsvloeistoffen. sEV's dragen biomoleculen zoals RNA, eiwitten en lipiden over van donor- naar acceptorcellen, waardoor ze belangrijke signaalmediatoren tussen cellen zijn. In het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen sEV's intercellulaire signalering bemiddelen, inclusief neuro-immuuninteracties. sEV-functies kunnen worden bestudeerd door de opname van gelabelde sEV's in ontvangende cellen zowel in vitro als in vivo tevolgen. Dit artikel beschrijft de etikettering van sEV's uit de geconditioneerde media van RAW 264.7 macrofaagcellen met behulp van een PKH-membraankleurstof. Het toont de opname van verschillende concentraties van gelabelde sEV's op meerdere tijdstippen door Neuro-2a-cellen en primaire astrocyten in vitro. Ook wordt de opname van sEV's getoond die intrathecaal worden afgeleverd in neuronen van het ruggenmerg van muizen, astrocyten en microglia gevisualiseerd door confocale microscopie. De representatieve resultaten tonen tijdsafhankelijke variatie in de opname van sEV's door verschillende cellen, wat kan helpen bij het bevestigen van succesvolle levering van sEV's in het ruggenmerg.

Na de isolatie van sEV's van RAW 264.7 geconditioneerde media via centrifugatie, werd NTA gebruikt om de concentratie en grootteverdeling van de gezuiverde sEV's te bepalen. De gemiddelde gemiddelde grootte van RAW 264,7-afgeleide sEV's was 140 nm en de piekdeeltjesgrootte was 121,8 nm, wat bevestigt dat de meeste detecteerbare deeltjes in de lichtverstrooiingsmeting binnen het groottebereik van exosomen of sEV's vielen bij 50-150 nm (Figuur 1A). Zoals gesuggereerd in de minimale informatie ...

We beschrijven een protocol om van macrofagen afgeleide kleine extracellulaire blaasjes te labelen met PKH-kleurstoffen en hun opname in vitro en in het ruggenmerg na intrathecale toediening te observeren.

Opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Het visualiseren van de opname van kleine extracellulaire blaasjes, ook bekend als sEV's, door verschillende cellen in het ruggenmerg, kan een succesvolle levering van sEV's bevestigen. Dit maakt zowel mechanistische als therapeutische studies van intrathecaal toegediende sEV's uit verschillende bronnen in rodenmodellen mogelijk. Dit protocol kan worden gebruikt om de opname van sEV's door cellen in een mild ruggenmerg te visualiseren en kan helpen bij het evalueren van de rol van sEV's en zijn ladingmoleculen bij spinale aandoeningen, pijn en ontsteking.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door mij, samen met en Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, de twee afgestudeerde studenten in het laboratorium van Dr. Seena Ajit. Begin met het plaatsen van 18 millimeter afdekslips in de 12-putplaat en vervolgens plaat neuro-2a-cellen in elke put met een totaal van 1 milliliter complete DMEM met 10% FBS en 1% pen strep. Wanneer de vloeiendheid van het celgetal 80 tot 90% heeft bereikt, verandert het medium in DMEM exosoom uitgeput medium in elke put één, 5 of 10 microgram gelabelde sEV's toe.Voor 1, 4 en 24 uur. Voor dosis- en tijdsafhankelijke opname naar de rest van de putten bij een gelijk volume van kleurstofcontrole. Verzamel de hersenen van postnatale pups in een petrischaaltje van 60 millimeter met ijskoude Hanks uitgebalanceerde zoutoplossing aangevuld met 10 millimolar hepes, ontleed beide corticale kwabben en verwijder de hersenvliezen.Gehakt vervolgens de weefsels met een gesteriliseerd mes. Breng de weefsels over in een conische buis van 15 milliliter met Pepane of deoxyribonucleus één dissociatiebuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius, draai de buis elke 5 minuten, zuig het supernatant op en voeg 5 milliliter volledige DMEM toe aan de buis. Om de enzymactiviteit te inactiveren, probeert u zorgvuldig te beoordelen om de weefsels te dissociëren met een glazen serologische pipet van 5 milliliter en een vlam gepolijste weidepipet.Laat de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer gaan en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius op 250 maal G, zuig het medium op en zie de cellen in 10 milliliter complete DMEM in een kolf van 75 vierkante centimeter. Vervang na 4 uur beplating de supernate en medium door 15 milliliter vers DMEM-medium. Na 14 dagen in vitro om de microglia en oligodendrocyten los te maken, brengt u de kolf gedurende 6 uur over naar een orbitale shaker bij 320 RPM.Gebruik 5 milliliter van het celdissociatie-enzym gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Om te tripsinize, de resterende astrocyten, om de enzymatische actie te inactiveren, voeg een 5 milliliter volledige DMEM toe en pelleteer vervolgens de cellen op 250 keer G gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Resuspend de cellen in volledige DMEM en zie de cellen op de 12 millimeter nummer 1.5 cover slips in een 24 putplaat.Spoel de cellen met PBS 3 keer en fixeer ze vervolgens met 4% power formaldehyde of PFA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen 3 keer gedurende 5 minuten met PBS en permeabiliseer ze met 0,1% Triton X 100 in PBS gedurende 10 tot 15 minuten. Herhaal vervolgens de wasbeurten met PBS.Gebruik 5% normaal geitenserum of NGS in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de cellen te blokkeren, incubateer de neuro-2a-cellen met kaart tweewegantistoffen en de primaire astrocyten met GFAP-antilichamen in een verhouding van 1 tot 500 in verse 5% NGS of PBS 's nachts bij 4 graden Celsius met zacht schudden. Na het wassen van de cellen 3 keer in PBS, voeg de fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen toe in 5% NGS. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht op een rocker.Herhaal het wassen met PBS en incubeer de cel met 1 microgram per milliliter DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen nogmaals 3 keer met PBS. Gebruik een anti-fade montagemedium, monteer de afdekplaatjes op nummer 1-dia's, laat ze een nacht drogen in het donker en bewaar de voorbereide glasdia's bij 4 graden Celsius totdat ze op een confocale microscoop worden gefotopoliseerd.Ontleed het ruggenmerg en fixeer het in 4% PFA in PBS bij 4 graden Celsius gedurende 24 uur. Bescherm de weefsels vooraf in 30% sucrose in PBS bij 4 graden Celsius gedurende 24 uur of totdat de weefsels zinken en bewaar de weefsels vervolgens bij 4 graden Celsius tot immunohistochemie, inbedding van het L4 L5-ruggenmerg in OCT-verbinding en vries het vervolgens in op droogijs totdat het volledig is gestold. Gebruik een cryostaat om de weefsels op 30 micrometer te delen en verzamel de secties in een 24 putplaat met PBS.Was de secties 3 keer gedurende 5 minuten elk met 0,3% Triton in PBS, Blokkeer de niet-specifieke bindingsplaatsen met 5% MGS in 0,3% Triton PBS gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Incubeer de secties 's nachts bij 4 graden Celsius op een shaker. Was de secties 3 keer gedurende 5 minuten met 0,3% Triton in Pbs.Voeg vervolgens de juiste concentratie van de secundaire antilichamen toe. Volgens het tekstmanuscript, incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur, was de secties met alleen PBS en incubeer ze in 1 microgram per milliliter DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal vervolgens de PBS-wasbeurten onder een lichtmicroscoop, monteer de secties op een doorzichtige zelfklevende dia met een fijne verfkwast.Maak de afdekslip nat met het montagemedium en laat 's nachts in het donker bij kamertemperatuur uitharden, verkrijg beelden onder een confocale microscoop met de respectieve lasers, De gemiddelde gemiddelde grootte van RA 2 6 4 0,7 afgeleide sEV's was 140 nanometer en de piekdeeltjesgrootte was 121,8 nanometer. Met de meest detecteerbare deeltjes die binnen het groottebereik van exosomen of sEVS vallen. Bij 50 tot 150 nanometer toonde western blotting van sEV's, Cell Lysate en exodepleted Media aan dat sEV-afgeleide eiwitmonsters de sEV-markereiwitten Alix CD81 en GAPDH bevatten.Het cellysaat was verrijkt met endoplasmatisch reticulum, resident eiwit Calnexin dus Calnexin diende als een negatieve marker voor cellulaire besmetting omdat het afwezig was in de sEV's. Er werd waargenomen dat de opname van sEV's plaatsvond na 1 uur en voor de 1, 5 en 10 microgram sEV's kon post-incubatiefluorescentie worden gedetecteerd na 4 uur, voor 4, 5 en 10 microgram sEV's. De opname van PKH 26 gelabelde sEV's door primaire astrocyten werd onderzocht en maximale fluorescentie van sEVS-opname in primaire corticale astrocyten vond plaats na 24 uur PKH26-gelabelde sEV's werden opgenomen en maximale fluorescentie werd waargenomen na 6 uur, na injectie in neuronen astrocyten en microgliale cellen.De opname van bedieningselementen, ongelabelde sEV's en kleurstofcontrole creëert code voor een wind vals positieve recente signalen als gevolg van nu specifieke labeling Opry-dans van Unbound dye patch coasts. De opname van seVs kan worden bevestigd door de overdracht van biomoleculaire lading naar recept en cellen en weefsels te onderzoeken en de veranderingen in expressieniveaus van biomoleculen of doelgenen te bepalen. Gedragsstudies kunnen ook worden uitgevoerd om de functionele impact van sEV-levering te onderzoeken.

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Wij beschrijven een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen hoge concentratie van fluorescerende en calcium-gevoelige kleurstoffen in neuronen of neuronale kanaal met een polyethyleen zuig pipet.

Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen

In this video, we demonstrate an assay to visualize and quantify the cellular uptake of extracellular vesicles or EVs. This assay utilizes 3D fluorescent imaging using a confocal microscope and allows for distinguishing internalized EVs from ones adhered to the cell surface.

Extracellular Vesicle Uptake Assay: A Method to Visualize and Quantify Cellular Uptake of Extracellular Vesicles Using 3D Fluorescence Imaging Technique

This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles' movement.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

In dit werk beschrijven we protocollen voor het onderzoek naar de rol van extracellulaire blaasjes (EVs) uitgebracht door Plasmodium falciparum geïnfecteerd erytrocyten. In het bijzonder richten we ons op de interacties van EVW met endotheliale cellen.

Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Hier presenteren we een protocol om van bloedplaatjes lysaat afgeleide extracellulaire blaasjes te labelen om hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten te volgen die worden gebruikt als een model voor artrose.

Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Extracellulaire blaasjes (EV's) dragen bij aan cellulaire biologie en intercellulaire communicatie. Er is behoefte aan praktische testen om de opname van EV's door de cellen te visualiseren en te kwantificeren. Het huidige protocol stelt de EV-opnametest voor door gebruik te maken van driedimensionale fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie, na EV-isolatie door een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat.

Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse

Deze video toont een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Gedissocieerd commissural neuronen zijn nuttig om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon groei en begeleiding te bestuderen.

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Leer fluorescente labeling van kleine extracellulaire blaasjes voor neurobiologisch onderzoek in het ruggenmerg. Deze methode visualiseert opname door astrocyten en neuronen om therapeutische strategieën te evalueren.

Opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg

Meer video's verkennen