Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform
15 juni 2021
Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.
Hart- en vaatziekten blijven wereldwijd doodsoorzaak nummer één. Traditionele in vitro modellen zijn afhankelijk van monolaagcultuur. Het hart, met name de hartspier of het myocardium, is echter complex in zijn 3D-anisotropie en cellulaire samenstelling.
Daarom is het van cruciaal belang om de complexiteit van de weefselsamenstelling binnen in vitro modellen te verbeteren om zowel de cellulaire bestanddelen als de structuur van het myocardium beter na te bootsen. Hier in dit werk demonstreren we een protocol voor de ontwikkeling van een 3D volwassen stamcel-afgeleid menselijk hartweefsel in een nieuw microfluïdisch apparaat. Dit apparaat bevat een 3D-hoofdweefselkanaal met aangeboren elliptische microposten die hoge uitlijningsgraden van de omliggende hydrogel ingekapselde hartcellen induceren.
Het hoofdkanaal wordt geflankeerd door mediakanalen met injectiepoorten die een nutriëntendiffusie door het weefsel mogelijk maken. Vanwege de zorg die nodig is bij het hanteren van de microfluïdische apparaten, is visuele weergave van dit protocol nuttig om 3D-hartweefsel correct vast te stellen in een microfluïdisch apparaat met ingebedde microposten voor verbeterde weefseluitlijning. Om de menselijke hartfibrose te scheiden, haalt u eerst de kolf uit de incubator.
Plaats deze in de bioveiligheidskast en begin de verbruikte media uit de kolf te halen. Neem vervolgens drie ML PBS 1X om de kolf te wassen. Sluit de dop en wervel de kolf zodat de bodem goed is bedekt met PBS.
Aspireer de PBS. Neem drie ML's van 37 graden trypsine en voeg toe aan de kolf. Kantel vervolgens de kolf en wervel zodat de bodem volledig is bedekt.
Zet vervolgens vier tot zes minuten in de couveuse. Neutraliseer de trypsine met VGV3 door drie ML's te nemen en die aan de kolf toe te voegen. Pipetteer de oplossing op en neer om alle cellen die achterblijven op de kolf los te maken.
Verzamel de celsuspensie in een Falcon-buis van 15 ML. Neem 10 microliters van de celsuspensie en doseer in een hemocytometer om de cellen met een microscoop te tellen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vier minuten op 250 G.
Na centrifugeren moet u het supernatant aspireren en voorzichtig zijn om de celkorrel niet te verstoren. Resuspend de cel pellet met verse VGV3 om een gewenste 75 miljoen cellen per ML suspensie te maken. Resuspend de cellen, dan zet de buis neer met een loszittende dop.
Om de cardiomyocyten te dissociaten, haalt u de plaat uit de incubator en aspireert u de media. Neem zes ML PBS en was de putten zodat er één ML PBS in elke put zit. Aspireer de PBS en zorg ervoor dat u de cellen die aan de plaat zijn bevestigd niet verstoort.
Voeg zes ML's verwarmde trypLE Express toe, zodat er één ML in elke put van een plaat met zes putten zit. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten met de trypLE. Neutraliseer de trypLE na 10 minuten met zes ML RPMI plus B27 plus insuline, zodat u één ML RMPI aan elke put toevoegt.
Gebruik een ML pipet om de oplossing te verzamelen en blaas deze tegen de achterkant van de putten om ervoor te zorgen dat alle cellen worden opgetild. Verzamel de celsuspensie in een Falcon-buis van 15 ML. Centrifugeer de buis gedurende drie minuten op 300 G.
Na centrifugeren, aspireren de media en de trypLE. Deze stap is belangrijk om de gevoelige cardiomyocyten te wassen. Deze stap zorgt ervoor dat alle trypLE weg is in 3D hartweefselvorming.
Resuspendeer de celkorrel in vijf ML RPMI plus B27 plus insuline. Gebruik een pipet van één ML om de oplossing op en neer te pipetten om een homogene celsuspensie te garanderen. Neem 10 microliters van de celsuspensie om te tellen met de hemocytometer.
Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten op 300 G. Aspireer de media na centrifugeren voor de tweede keer. Voeg de juiste hoeveelheid RPMI plus B27 plus insuline toe om een suspensie van 75 miljoen cellen per ML te bereiken en resuspend.
Om de collageenoplossing voor inkapseling voor te bereiden, moet u alle reagentia op een ijskast in de kap hebben. Neem vervolgens 75 microliter van het collageen. Het collageen is erg stroperig, dus neem langzaam op met de pipet en doseer het vervolgens in een microcentrifugebuis op ijs.
Neem 13,85 microliter RPMI en voeg toe aan het collageen in de Falcon tube. Neem vervolgens 10 microliters fenolrood en voeg toe aan het mengsel op ijs en resuspend. Neem ten slotte 1,15 microliter van één normale NaOH en voeg toe aan de suspensie om te neutraliseren.
Neem vervolgens een pipetpunt van 200 microliter en resuspend de ophanging. De volgende stap is inkapseling van de cellen in de collageen metrogel. Neem vervolgens een aliquot van acht microliter CMs en voeg toe aan een verse Falcon tube op ijs.
Neem vervolgens twee microliters CS en voeg toe aan dat celmengsel. Resuspend de cel suspensie en pak 5,6 microliter van de cel suspensie en zet in een verse Falcon buis. Pak dan het collageen dat je net hebt bereid, neem vier microliters van het collageen en neem vervolgens 2,4 microliter metrogel.
Pipetteer het mengsel op en neer om een homogene verdeling van de celhydrogelsuspensie te garanderen. Zodra de gelinjectie is voorbereid, kunt u in apparaten invoegen. Neem een nieuwe tip en geef je over.
Neem de Petrischaal van apparaten, steek de punt in de injectiepoort en injecteer langzaam en gestaag. Je zult zien hoe het apparaatkanaal zich vult met de celhydrogelsuspensie. Zodra de andere poort is gevuld, stopt u de injectie en verwijdert u de punt.
Draai na injectie de apparaten met een pincet om en plaats ze negen minuten in de grotere Petrischaal met water in de incubator. Haal na negen minuten de apparaten uit de incubator en draai rechtop en plaats ze vervolgens nog negen minuten terug in de incubator om hydrogelpolymerisatie te voltooien. Nu is het tijd om de media toe te voegen.
Neem dus RMPI plus B27 en steek de tip in de mediapoort en begin langzaam te duwen. Doe dit dan op de tegenoverliggende mediapoort. Het kan zijn dat de media niet injecteren, dus u kunt een druppel media op de poort plaatsen en vervolgens de pipet nemen en negatieve druk gebruiken om de media van de andere kant naar binnen te trekken.
Dus je zult zien hoe de media door het kanaal worden getrokken. Zodra media aan alle mediakanalen zijn toegevoegd, worden de apparaten op 37 graden teruggezet in de incubator. Het microfluïdische apparaat wordt linksboven weergegeven.
Dag één, zeven en 14 van cultuur worden getoond dit beeld. Na 14 dagen kweek moeten de cellen condenseren in sterk uitgelijnde structuren die zich rond de microposten vormen. Sporen van dag 14 worden hier getoond in C van spontane samentrekking, evenals immunofluorescente beelden van actine bevlekte en cardiale marker bevlekte weefsels.
Wat moet worden gezien, zijn sterk uitgelijnde actinevezels die zich na 14 dagen in cultuur vormen, evenals parallelle geriste volwassen sarcomen en gelokaliseerde spleetverbindingen. Tijdens deze procedure is het van cruciaal belang om alle materialen bij lage temperaturen op ijs te houden tijdens celhydrogelinjectie om voortijdige polymerisatie te voorkomen. De microfluïdische apparaten moeten met zorg worden behandeld, zowel tijdens de fabricage, injectie en uitgebreide weefselkweek.
De celinjecties moeten een stabiel proces zijn om ervoor te zorgen dat het hele kanaal is gevuld terwijl het snel wordt uitgevoerd om voortijdige polymerisatie of hydrogel uitdroging vóór mediatoevoeging te voorkomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het engineeren van een volwassen 3D menselijk hartweefsel met behulp van uit stamcellen afgeleide cardiomyocyten (CM's) binnen een microfluïdisch apparaat. De methode legt de nadruk op de creatie van een anisotroop cardiac tissue-on-a-chip model dat de structurele en cellulaire complexiteit van het native myocard nauwkeurig nabootst, waarmee belangrijke uitdagingen in de modellering van hartweefsel voor onderzoek en farmaceutische tests worden aangepakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiac tissue engineering
- Stamcelbiologie
- Microfluidica
- In vitro ziektemodellering
Achtergrond
- Cardiovasculaire aandoeningen zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak.
- Traditionele in vitro hartmodellen missen de 3D-anisotropie en cellulaire complexiteit van het myocardium.
- Het verkrijgen van adulte menselijke cardiomyocyten wordt beperkt door ethische en praktische belemmeringen.
- Uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) worden in toenemende mate gebruikt voor het modelleren van hartweefsel.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het genereren van matuur menselijk cardiaal 3D-weefsel uit hiPSC-CM's binnen een microfluïdisch apparaat.
- Het in vitro repliceren van de anisotrope architectuur en cellulaire samenstelling van het natuurlijke myocardium.
- Het bieden van een platform dat geschikt is voor fundamentele biologische studies, ziektemodellering en drugscreening.
Gebruikte methoden
- Isolatie en dissociatie van humane cardiale fibroblasten en hiPSC-afgeleide cardiomyocyten.
- Zuivering en telling van cellen met behulp van hemocytometrie en centrifugatie.
- Bereiding van een collageen-gebaseerde hydrogel voor celencapsulatie.
- Co-cultuur van CMs en cardiale fibroblasten in gedefinieerde ratio's binnen de hydrogel.
- Injectie van de celhoudende hydrogel in een microfluïdisch apparaat met elliptische microposten om weefseluitlijning te induceren.
- Cultuur en onderhoud van het engineered weefsel tot maximaal 14 dagen, met periodieke beeldvorming en analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle vorming van sterk uitgelijnde 3D-hartweefselstructuren rond micropalen na 14 dagen in cultuur.
- Waarneming van spontane contracties in de gekweekte weefsels op dag 14.
- Immunofluorescentiekleuring onthulde uitgelijnde actinevezels, mature sarcomeren en gelokaliseerde gap junctions.
- Het protocol maakt de reproduceerbare generatie van anisotropisch hartweefsel mogelijk dat het natuurlijke myocardium nabootst.
Conclusies
- Het beschreven protocol maakt de creatie mogelijk van matuur menselijk 3D-hartweefsel met structurele en functionele eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van natuurlijk hartspierweefsel.
- Dit tissue-on-a-chip-model is waardevol voor fundamenteel onderzoek, ziektemodellering en farmaceutische tests.
- Een zorgvuldige hantering van de microfluïdische apparaten en temperatuurbeheersing tijdens de injectie van de hydrogel zijn cruciaal voor het succes.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het engineeren van 3D-georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform vult het kritieke tekort aan fysiologisch relevante in vitro hartmodellen voor geneesmiddelenontwikkeling en ziekteonderzoek. Deze benadering maakt een voorspellende evaluatie van de hartfunctie en weefselarchitectuur mogelijk, wat de translationele continuïteit ondersteunt van vroege ontdekking tot preklinische beoordeling. De reproduceerbaarheid van het platform en de afstemming op de architectuur van het natuurlijke myocard vergroten het vertrouwen in mechanistische en veiligheidsstudies binnen de biofarmaceutische pipeline.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om hartspecifieke signaalpaden te onderzoeken in een structureel relevante context van menselijk weefsel.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het modelleren van de anisotropie en cellulaire complexiteit van het natuurlijke myocardium.
- Faciliteert functionele target-validatie door observatie van weefselrijping en contractiliteit.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd 3D-hartweefselsysteem voor reproduceerbare screening van verbindingen.
- Levert kwantitatieve resultaten zoals weefseluitlijning, contractie en markerexpressie.
- Maakt schaalbaarheid en hergebruik van het platform mogelijk voor high-content screening-applicaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante menselijke cardiale biologie voor translationele biomarkerstudies.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het modelleren van menselijke weefselresponsen.
- Vermindert het risico op uitval in een laat stadium door het leveren van voorspellende menselijke cardiale gegevens.
Pipeline- & workflowintegratie
Dit microfluïdisch 3D-hartweefselmodel is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinische fase, waardoor hypothesetoetsing, assay-ontwikkeling en translationeel onderzoek binnen één enkel platform mogelijk worden.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische studies en de verduidelijking van signaalpaden in een menselijk relevant systeem.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve read-outs voor de evaluatie van verbindingen en veiligheidsprofielering.
- Analytics: Levert meetbare resultaten zoals weefseluitlijning, contractiliteit en markerlokalisatie voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen door de architectuur van inheems hartweefsel na te bootsen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor voortdurende studies naar hartbiologie en farmacologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in cardiologisch onderzoek.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor weefseltechnologie en assays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door vroeg in de ontwikkeling robuuste humane cardiale data te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van cardiaal gerichte activa mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stamcelbiologie, tissue engineering en microfluidica.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde microfluidische apparaten en beeldvormingsinfrastructuur.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare weefselvorming en -analyse.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende cardiale celbronnen of ziekteverschijningsmodellen.
- Zorgvuldige temperatuur- en hanteringsprotocollen zijn cruciaal om voortijdige hydrogelpolymerisatie te voorkomen en de weefselintegriteit te waarborgen.
