Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform
June 15th, 2021
Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.
Hart- en vaatziekten blijven wereldwijd doodsoorzaak nummer één. Traditionele in vitro modellen zijn afhankelijk van monolaagcultuur. Het hart, met name de hartspier of het myocardium, is echter complex in zijn 3D-anisotropie en cellulaire samenstelling.
Daarom is het van cruciaal belang om de complexiteit van de weefselsamenstelling binnen in vitro modellen te verbeteren om zowel de cellulaire bestanddelen als de structuur van het myocardium beter na te bootsen. Hier in dit werk demonstreren we een protocol voor de ontwikkeling van een 3D volwassen stamcel-afgeleid menselijk hartweefsel in een nieuw microfluïdisch apparaat. Dit apparaat bevat een 3D-hoofdweefselkanaal met aangeboren elliptische microposten die hoge uitlijningsgraden van de omliggende hydrogel ingekapselde hartcellen induceren.
Het hoofdkanaal wordt geflankeerd door mediakanalen met injectiepoorten die een nutriëntendiffusie door het weefsel mogelijk maken. Vanwege de zorg die nodig is bij het hanteren van de microfluïdische apparaten, is visuele weergave van dit protocol nuttig om 3D-hartweefsel correct vast te stellen in een microfluïdisch apparaat met ingebedde microposten voor verbeterde weefseluitlijning. Om de menselijke hartfibrose te scheiden, haalt u eerst de kolf uit de incubator.
Plaats deze in de bioveiligheidskast en begin de verbruikte media uit de kolf te halen. Neem vervolgens drie ML PBS 1X om de kolf te wassen. Sluit de dop en wervel de kolf zodat de bodem goed is bedekt met PBS.
Aspireer de PBS. Neem drie ML's van 37 graden trypsine en voeg toe aan de kolf. Kantel vervolgens de kolf en wervel zodat de bodem volledig is bedekt.
Zet vervolgens vier tot zes minuten in de couveuse. Neutraliseer de trypsine met VGV3 door drie ML's te nemen en die aan de kolf toe te voegen. Pipetteer de oplossing op en neer om alle cellen die achterblijven op de kolf los te maken.
Verzamel de celsuspensie in een Falcon-buis van 15 ML. Neem 10 microliters van de celsuspensie en doseer in een hemocytometer om de cellen met een microscoop te tellen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vier minuten op 250 G.
Na centrifugeren moet u het supernatant aspireren en voorzichtig zijn om de celkorrel niet te verstoren. Resuspend de cel pellet met verse VGV3 om een gewenste 75 miljoen cellen per ML suspensie te maken. Resuspend de cellen, dan zet de buis neer met een loszittende dop.
Om de cardiomyocyten te dissociaten, haalt u de plaat uit de incubator en aspireert u de media. Neem zes ML PBS en was de putten zodat er één ML PBS in elke put zit. Aspireer de PBS en zorg ervoor dat u de cellen die aan de plaat zijn bevestigd niet verstoort.
Voeg zes ML's verwarmde trypLE Express toe, zodat er één ML in elke put van een plaat met zes putten zit. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten met de trypLE. Neutraliseer de trypLE na 10 minuten met zes ML RPMI plus B27 plus insuline, zodat u één ML RMPI aan elke put toevoegt.
Gebruik een ML pipet om de oplossing te verzamelen en blaas deze tegen de achterkant van de putten om ervoor te zorgen dat alle cellen worden opgetild. Verzamel de celsuspensie in een Falcon-buis van 15 ML. Centrifugeer de buis gedurende drie minuten op 300 G.
Na centrifugeren, aspireren de media en de trypLE. Deze stap is belangrijk om de gevoelige cardiomyocyten te wassen. Deze stap zorgt ervoor dat alle trypLE weg is in 3D hartweefselvorming.
Resuspendeer de celkorrel in vijf ML RPMI plus B27 plus insuline. Gebruik een pipet van één ML om de oplossing op en neer te pipetten om een homogene celsuspensie te garanderen. Neem 10 microliters van de celsuspensie om te tellen met de hemocytometer.
Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten op 300 G. Aspireer de media na centrifugeren voor de tweede keer. Voeg de juiste hoeveelheid RPMI plus B27 plus insuline toe om een suspensie van 75 miljoen cellen per ML te bereiken en resuspend.
Om de collageenoplossing voor inkapseling voor te bereiden, moet u alle reagentia op een ijskast in de kap hebben. Neem vervolgens 75 microliter van het collageen. Het collageen is erg stroperig, dus neem langzaam op met de pipet en doseer het vervolgens in een microcentrifugebuis op ijs.
Neem 13,85 microliter RPMI en voeg toe aan het collageen in de Falcon tube. Neem vervolgens 10 microliters fenolrood en voeg toe aan het mengsel op ijs en resuspend. Neem ten slotte 1,15 microliter van één normale NaOH en voeg toe aan de suspensie om te neutraliseren.
Neem vervolgens een pipetpunt van 200 microliter en resuspend de ophanging. De volgende stap is inkapseling van de cellen in de collageen metrogel. Neem vervolgens een aliquot van acht microliter CMs en voeg toe aan een verse Falcon tube op ijs.
Neem vervolgens twee microliters CS en voeg toe aan dat celmengsel. Resuspend de cel suspensie en pak 5,6 microliter van de cel suspensie en zet in een verse Falcon buis. Pak dan het collageen dat je net hebt bereid, neem vier microliters van het collageen en neem vervolgens 2,4 microliter metrogel.
Pipetteer het mengsel op en neer om een homogene verdeling van de celhydrogelsuspensie te garanderen. Zodra de gelinjectie is voorbereid, kunt u in apparaten invoegen. Neem een nieuwe tip en geef je over.
Neem de Petrischaal van apparaten, steek de punt in de injectiepoort en injecteer langzaam en gestaag. Je zult zien hoe het apparaatkanaal zich vult met de celhydrogelsuspensie. Zodra de andere poort is gevuld, stopt u de injectie en verwijdert u de punt.
Draai na injectie de apparaten met een pincet om en plaats ze negen minuten in de grotere Petrischaal met water in de incubator. Haal na negen minuten de apparaten uit de incubator en draai rechtop en plaats ze vervolgens nog negen minuten terug in de incubator om hydrogelpolymerisatie te voltooien. Nu is het tijd om de media toe te voegen.
Neem dus RMPI plus B27 en steek de tip in de mediapoort en begin langzaam te duwen. Doe dit dan op de tegenoverliggende mediapoort. Het kan zijn dat de media niet injecteren, dus u kunt een druppel media op de poort plaatsen en vervolgens de pipet nemen en negatieve druk gebruiken om de media van de andere kant naar binnen te trekken.
Dus je zult zien hoe de media door het kanaal worden getrokken. Zodra media aan alle mediakanalen zijn toegevoegd, worden de apparaten op 37 graden teruggezet in de incubator. Het microfluïdische apparaat wordt linksboven weergegeven.
Dag één, zeven en 14 van cultuur worden getoond dit beeld. Na 14 dagen kweek moeten de cellen condenseren in sterk uitgelijnde structuren die zich rond de microposten vormen. Sporen van dag 14 worden hier getoond in C van spontane samentrekking, evenals immunofluorescente beelden van actine bevlekte en cardiale marker bevlekte weefsels.
Wat moet worden gezien, zijn sterk uitgelijnde actinevezels die zich na 14 dagen in cultuur vormen, evenals parallelle geriste volwassen sarcomen en gelokaliseerde spleetverbindingen. Tijdens deze procedure is het van cruciaal belang om alle materialen bij lage temperaturen op ijs te houden tijdens celhydrogelinjectie om voortijdige polymerisatie te voorkomen. De microfluïdische apparaten moeten met zorg worden behandeld, zowel tijdens de fabricage, injectie en uitgebreide weefselkweek.
De celinjecties moeten een stabiel proces zijn om ervoor te zorgen dat het hele kanaal is gevuld terwijl het snel wordt uitgevoerd om voortijdige polymerisatie of hydrogel uitdroging vóór mediatoevoeging te voorkomen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van menselijk hartweefsel. Het model bestaat uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten gecocultiveerd met cardiale fibroblasten in een collageen-gebaseerde hydrogel, gericht op het verbeteren van hartweefsel engineering en geneesmiddelenscreening.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hartweefsel engineering
- Stamcelbiologie
- Microfluïdica
Achtergrond
- Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak.
- Traditionele in vitro modellen gebruiken vaak monolayer culturen.
- De complexiteit van het myocard vereist meer geavanceerde modellen.
- 3D modellen kunnen de cellulaire samenstelling en structuur van het hart beter nabootsen.
Doel van het onderzoek
- Om een 3D model van menselijk hartweefsel te ontwikkelen.
- Om de representatie van hartweefsel in vitro te verbeteren.
- Om toepassingen in geneesmiddelenscreening en ziektemodellering te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een microfluïdisch apparaat.
- Creatie van een 3D hoofdweefselkanaal.
- Incorporatie van elliptische microposts voor celaflijning.
- Gecocultiveer van cardiomyocyten en cardiale fibroblasten in hydrogel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle ontwikkeling van uitgelijnd menselijk hartweefsel.
- Verbeterde structurele en functionele eigenschappen van het weefselmodel.
- Aangetoond potentieel voor verbeterde geneesmiddelenscreening.
- Biedt inzichten in cardiale ziektemodellering.
Conclusies
- Het 3D microfluïdische model bootst effectief menselijk hartweefsel na.
- Deze aanpak kan onderzoek naar hartgezondheid en ziekte bevorderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen gepersonaliseerde geneeskunde en therapeutisch testen omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Engineering 3D organized human cardiac tissue within a microfluidic platform addresses the critical gap in physiologically relevant in vitro cardiac models for drug discovery and disease research. This approach enables predictive evaluation of cardiac function and tissue architecture, supporting translational continuity from early discovery through preclinical assessment. The platform's reproducibility and alignment with native myocardium architecture enhance confidence in mechanistic and safety studies across the biopharma pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac-specific pathways in a structurally relevant human tissue context.
- Supports biological de-risking by modeling native myocardium anisotropy and cellular complexity.
- Facilitates functional target validation through observation of tissue maturation and contractility.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized 3D cardiac tissue system for reproducible compound screening.
- Delivers quantitative outputs such as tissue alignment, contraction, and marker expression.
- Enables scalability and platform reuse for high-content screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human cardiac biology for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by modeling human tissue responses.
- Reduces risk of late-stage attrition by providing predictive human cardiac data.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic 3D cardiac tissue model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, assay development, and translational research within a single platform.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies and pathway clarification in a human-relevant system.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and safety profiling.
- Analytics: Provides measurable outputs such as tissue alignment, contractility, and marker localization for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking native cardiac tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing cardiac biology and pharmacology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Standardizes tissue engineering and assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust human cardiac data early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell biology, tissue engineering, and microfluidics.
- Demands access to specialized microfluidic devices and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible tissue formation and analysis.
- Adaptation may be needed for different cardiac cell sources or disease models.
- Careful temperature and handling protocols are critical to prevent premature hydrogel polymerization and ensure tissue integrity.
