Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen
4 augustus 2021
Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.
Veel gentherapeutische en neurowetenschappelijke studies omvatten de injecties van AAV-vectoren in de hersenen van niet-menselijke primaten. Om deze studies succesvol te laten zijn, moet de injectietechniek betrouwbaar zijn. Onze injectietechniek is onmiddellijk en nauwkeurig.
Deze procedure werkt goed voor injectie bij verdoofde of wakkere dieren. Onze zelfgemaakte canule is gemakkelijk te hanteren en goedkoop. De procedure wordt gedemonstreerd door Kevin Mai, een technische technicus uit mijn laboratorium.
Om te beginnen stompt u een 30-gauge 13-millimeter hypodermische naaldpunt met een schijfslijper. Snijd vervolgens een stuk roestvrijstalen buis op een lengte, afhankelijk van de diepte van het doelhersengebied. Met een schijvenslijper, afschuin het ene uiteinde van de gesneden buis en strijk het andere glad.
Ontbraam de binnenkant van de buis met een broach. Snijd vervolgens een stuk PTFE-buis op een lengte die geschikt is voor het te laden vectoroplossingsvolume. Flare beide uiteinden van de buis door de stompe hypodermische naald in te brengen.
Steek de stompe hypodermische naald ongeveer vijf millimeter in het ene uiteinde van de PTFE-buis. Steek vervolgens het ongeflankte uiteinde van de roestvrijstalen buis ongeveer vijf millimeter in het andere uiteinde. Test de canule door gefilterd water door de hypodermische naaldnaaf te injecteren.
Controleer of water de afgeschuinde roestvrijstalen buispunt soepel verlaat en dat er geen water uit beide juncties lekt. Plaats na het testen van de canule deze in een autoclaafzak en steriliseer deze door autoclaveren. Breng de vectoroplossing voorzichtig over naar een gesteriliseerde PCR-buis met een P-20-pipetter, waardoor bellenvorming wordt vermeden.
Bevestig vervolgens de canule met de afgeschuinde punt naar beneden gericht op een verticaal georiënteerde stereotaxische houder. Sluit vervolgens een luerlockspuit van één milliliter aan op de injectienaaldnaaf van de canule. Dompel de afgeschuinde punt onder in de vectoroplossing.
Oefen vervolgens zachte negatieve druk uit met de spuit van één milliliter om de oplossing in de canule te laden terwijl u de meniscus visueel volgt tussen de oplossing en de lucht. Zodra de vectoroplossing is geladen, gaat u door met de zachte negatieve druk totdat de oplossing de naaldnaaf bereikt. Verwijder vervolgens de spuit van één milliliter en injecteer langzaam gekleurde minerale olie langs de binnenwand van de hypodermische naaldnaaf, waarbij u ervoor zorgt dat luchtbellen worden vermeden.
Bevestig de hypodermische naaldnaaf aan een van de twee open poorten van een drieweg luer lock stopcock. Sluit vervolgens de poort. Vul een spuit van één milliliter met lucht en bevestig deze aan een van de andere twee poorten.
Sluit ten slotte de resterende poort van de stopkraan om de spuit op de canule aan te sluiten. Door de spuit te bevestigen, wordt lucht in de stopkraan geforceerd en door deze lucht naar de onbezette poort te verplaatsen, wordt voorkomen dat de vectoroplossing terug naar beneden wordt geduwd in de canule. Duw de lucht van de spuit langzaam in de canule.
Zodra de gekleurde olie verschijnt aan de punt van de stompe naald in de PTFE-buis, controleert u op lucht tussen de oplossing en de gekleurde olie. Blijf positieve druk uitoefenen totdat een druppel vectoroplossing zichtbaar is aan de afgeschuinde canulepunt. Sluit vervolgens de stopkraan om te voorkomen dat de vector door de zwaartekracht de canule verlaat.
Zodra de vectoroplossing is geladen, bevestigt u de canule op de stereotaxische manipulator. Om vervolgens de stopkraan op de elektrische luchtpomp aan te sluiten, neemt u de pompslang van de niet-steriele assistent. Pak de luer lock connector door de wand van een steriele sleeve.
Laat de kraag van de mouw vallen, zodat deze door de zwaartekracht langs de buis kan worden uitgeschoven. Bevestig vervolgens de stopkraan en plak de huls stevig rond de luer lock connector. Test vervolgens de luchtpomp en canule door de luchtpomp op lage druk te zetten, voordat u deze inschakelt en de druk verhoogt totdat de olie door de canule gaat en een druppel vectoroplossing zichtbaar is aan de tip van de canule.
Plak een plastic liniaal op de PTFE-buis om de beweging van de meniscus tijdens de injectie te meten. Drijf vervolgens de canule naar beneden met de stereotaxische manipulator totdat de punt het oppervlak bereikt en noteer de diepte. Rijd de canule naar de diepste plaats om langs het spoor te worden geïnjecteerd.
Het oppervlak zal bij contact kuiltjes worden. Om mis-targeting als gevolg van weefselcompressie te minimaliseren, drijft u de canule naar beneden en schiet u de diepste injectieplaats met 500 micrometer. Trek je vervolgens langzaam terug.
Andere alternatieven zijn de canule langzaam naar beneden rijden of snel rijden en één tot vijf minuten op de bodem wachten. Zodra de canule op de diepste injectieplaats is geplaatst, gebruikt u de elektrische luchtpomp om 0,5 microliter van de vectoroplossing gedurende 10 tot 30 seconden te injecteren. Bevestig de injectiestroom door de meniscus tussen de gekleurde olie en de vectoroplossing in de PTFE-buis te volgen.
Na een minuut wachten, trekt u de canule terug naar de volgende injectieplaats langs het spoor. Laat na de laatste injectie de canule 10 minuten op zijn plaats om vectorefflux te voorkomen. Trek vervolgens de canule in en gooi deze weg in een biohazard sharps-container.
Injectie van AAV-vectoren die het kanaal rhodopsine II-transgen in de linker superieure colliculus dragen, gevolgd door stimulatie met continu blauw licht bij 40 milliwatt, produceerde een reeks opeenvolgende actiepotentialen. Lichtpulsen van één milliseconde riepen bij 40 milliwatt geen actiepotentialen op, maar riepen ze betrouwbaar op bij 160 milliwatt. Optische stimulatie van de superieure colliculus veroorzaakt door visueel geleide saccades verminderde de saccadewinst geleidelijk.
De traagheid van deze verandering is consistent met optogenetisch geïnduceerde plasticiteit. Levering van geel laserlicht aan de oculomotorische vermis na AAV-injecties in de nucleus reticularis tegmentae pontis onderdrukte mosachtige vezelactiviteit, die een input is voor het cerebellum. Deze onderdrukking verminderde de Purkinje-celactiviteit, die een output is van het cerebellum.
Tijdens optogenetische onderdrukking nam de vuursnelheid af en veranderde in een gebarsten poriënpatroon, wat suggereert dat de geremde mosachtige vezelinvoer naar Purkinje-cellen de vertragingsfase van het saccade beïnvloedt door de tweede uitbarsting te veroorzaken. Kanaal rhodopsine kwam uitsluitend tot expressie in Purkinje-cellen van de oculomotorische vermis. Levering van korte lichtpulsen verhoogde de eenvoudige piekactiviteit van een geïsoleerde Purkinje-cel.
Een enkele lichtpuls van 1,5 milliseconde riep vaak meer dan één eenvoudige piek op. Optogenetische eenvoudige spike-activering getimed om op te treden tijdens de saccade verhoogde saccade amplitude, wat de desinhibitory rol van Purkinje-cellen op de oculomotorische burstgenerator bevestigt. Luchtbellen in de canule kunnen de olievectormeniscus verstoren, de bepaling van injectievolumes bemoeilijken en een fijne regeling van het debiet voorkomen.
Om deze redenen is het laden van de vectoroplossingen zonder luchtbellen van cruciaal belang voor deze procedure. Zes tot acht weken na de injectie kunnen optogenetische manipulaties worden uitgevoerd en kan het hersenweefsel worden verwerkt voor histologische analyse. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om veel vectoren in enkele dieren te testen, wat op zijn beurt de ontwikkeling en validatie van nieuwe vectoren vergemakkelijkt.
Een specifiek gebied van actueel belang is de ontwikkeling van vectoren die zich richten op specifieke neuronale typen.
Overzicht
Deze studie presenteert een betrouwbare en onmiddellijke injectietechniek voor het afleveren van AAV-vectoren in de hersenen van niet-menselijke primaten, wat cruciaal is voor optogenetische toepassingen. De methode maakt het mogelijk om specifieke hersengebieden te targeten, waarbij succesvolle stimulatie van het colliculus superius leidde tot opmerkelijke elektrofysiologische veranderingen en inzichten in plasticiteit.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Optogenetica
- Gentherapie
Achtergrond
- Optogenetica vereist een nauwkeurige en betrouwbare toediening van virale vectoren.
- De injectietechniek moet een accurate targeting en identificatie van hersengebieden mogelijk maken.
- Eerdere methoden kunnen tekortschieten in effectiviteit of precisie, waardoor verbeterde technieken noodzakelijk zijn.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare injectieprocedure voor AAV-vectoren bij niet-humane primaten te ontwikkelen.
- Om de effecten van optogenetische stimulatie op neuronale responsen te onderzoeken.
- Om een methode vast te stellen die toepasbaar is voor zowel wakker als geanestheseerde subjecten.
Gebruikte methoden
- Voor het toedienen van de vectorsolutions werd gebruikgemaakt van een zelfgemaakte canule.
- Voor de constructie werden een hypodermische naald van 30-gauge en roestvrijstalen buisjes gebruikt.
- De methode omvatte nauwkeurige stappen voor de preparatie, het laden en het injecteren van de oplossing.
- Injecties van de vectorsolution werden onder precieze controle uitgevoerd met behulp van een elektrische luchtpomp.
- Elektrofysiologische responsen werden gemonitord tijdens en na de injecties.
Belangrijkste resultaten
- Injectie van AAV-vectoren leidde tot een significante generatie van actiepotentialen als reactie op optische stimulatie.
- Elektrofysiologische veranderingen wijzen op optogenetisch geïnduceerde plasticiteit in saccadische responsen.
- Vectorinfusie resulteerde in een waargenomen onderdrukking van de cerebellaire output, wat duidt op gewijzigde patronen van neuronale activiteit.
Conclusies
- De voorgestelde injectietechniek maakt nauwkeurige targeting mogelijk voor optogenetische studies in primaatmodellen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van neuronale mechanismen en plasticiteit in verband met visuele verwerking.
- Een verbeterde injectienauwkeurigheid heeft belangrijke implicaties voor toekomstige toepassingen van gentherapie.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Betrouwbare, ruimtelijk precieze toediening van AAV-vectoren in de hersenen van niet-menselijke primaten (NHP) is een cruciale randvoorwaarde voor translationele optogenetica en de ontwikkeling van neurologische gentherapie. Deze methode pakt de uitdaging van reproduceerbare vectoradministratie bij NHP's aan, wat robuuste doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie ondersteunt voorafgaand aan klinische translatie. De mogelijkheid om multiplexe vectortesten in beperkte diercohorten te faciliteren, heeft een directe impact op de efficiëntie van de portfolio en het voorspellend vertrouwen in therapeutische pijplijnen voor het centrale zenuwstelsel (CZS).
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt een rigoureuze analyse van optogenetische constructen en vectortropisme mogelijk in een ziekterelevant NHP-systeem.
- Ondersteunt de functionele validatie van neuronale targets via gecontroleerde optische modulatie en elektrofysiologische read-outs.
- Faciliteert mechanische de-risking door nauwkeurige ruimtelijke en volumetrische toediening van kandidaatvectoren mogelijk te maken.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde hersenregio's van niet-menselijke primaten voor op downstream optogenetische en elektrofysiologische assays.
- Standaardiseert injectievolumes en -snelheden, wat de reproduceerbaarheid tussen experimentele runs verbetert.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van vectorexpressie en functionele resultaten mogelijk voor het screenen van vectorcandidates.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door mens-relevante neurale circuits in NHPs te modelleren.
- Biedt continuïteit van de ontdekking van vectoren tot preklinische validatie in een high-fidelity systeem.
- Vermindert het biologische risico door een robuuste, histologisch verifieerbare afgifte en expressie van therapeutische constructen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze injectietechniek vormt de koppeling tussen vroege ontdekking, targetvalidatie en de ontwikkeling van preklinische modellen voor programma's op het gebied van genetherapie voor het centrale zenuwstelsel (CZS) en optogenetica.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door nauwkeurige manipulatie van neurale circuits in NHPs mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor reproduceerbare, kwantitatieve vectoradministratie voor comparatieve evaluatie van kandidaatconstructen.
- Analytics: Levert meetbare output zoals injectievolume, snelheid en postmortale histologische bevestiging.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door mensachtige neurale responsen in NHPs te modelleren.
- Enterprise Reuse: Biedt een gestandaardiseerd, schaalbaar protocol dat aanpasbaar is aan diverse combinaties van vectoren en doelwitten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, standaardisatie en doorvoersnelheid voor vector-testing in NHPs.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalallocatie door het mogelijk maken van robuuste preklinische datageneratie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van CNS-gentherapie-assets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie en de neuroanatomie van niet-menselijke primaten (NHP) voor een nauwkeurige targeting.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde faciliteiten voor de fabricage van canules, injectie-instrumentarium en histologische analyse-infrastructuur.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie tussen teams om reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpasbaar aan verschillende hersenregio's en vectortypen door indien nodig het protocol te modificeren.
- Zorgvuldige uitsluiting van luchtbellen is cruciaal om de injectienauwkeurigheid te behouden en onderbrekingen in de stroom te voorkomen.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Making a Cannula
2:09
Loading the Vector Solution for Injection
4:14
Cannula Insertion into the Target Brain Area and Injection
6:33
Results: Optogenetic Manipulations by Adeno-Associated Viral (AAV) Vector Injections in Awake Monkeys
8:39
Conclusion
