Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Dit protocol maakt cellulokwantificering van DNA en resectie na DNA-schade mogelijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de celcyclusmarkering die de cellen beperkt tot de S- en G2-fase, waardoor het bromodeoxyuridinesignaal het resultaat is van DNA en resectie. Jean-Yves Masson, een hoofdonderzoeker, en Sofiane Y.Mersaoui, een postdoctoraal onderzoeker, demonstreren de procedure.

Werk onder een steriele kweekkap en plaats een enkele dekplaat in elke put van een plaat met zes putten voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ongeveer 150.000 HeLa cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling. Bestraal op dag drie, na de nachtelijke incubatie met BrdU in een eindconcentratie van 10 micromolair, de platen met een totale dosis van vijf grijze röntgenbestraling.

Breng na bestraling de platen terug voor incubatie bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofoxide bevochtigde incubator gedurende drie uur. Voor pre-extractie, aspirateer het medium en was de cellen voorzichtig twee keer met PBS. Voeg na het verwijderen van PBS twee milliliter pre-extractiebuffer A toe en incubeer de cellen bij vier graden Celsius op ijs gedurende 10 minuten.

Na 10 minuten, aspiraatbuffer A, voeg twee milliliter cytoskelet stripping buffer B toe en herhaal de incubatie. Aspirateer vervolgens voorzichtig buffer B en was de cellen met PBS. Na het aanzuigen van PBS fixeert u de cellen door twee milliliter van 4% paraformaldehyde onder de chemische kap toe te voegen.

Na verwijdering van het paraformaldehyde en wasbeurten met PBS, bedek de coverslips met 100% koude methanol voor incubatie bij min 20 graden Celsius gedurende vijf minuten en was de coverslips twee keer met PBS. Voor permeabilisatie, incubateer de cellen met twee milliliter PBS bevatten 0,5% Tritan X-100 bij kamertemperatuur. Was de dekens na 15 minuten drie keer met twee milliliter PBS.

Voeg voor immunostaining twee milliliter blokkerende buffer toe aan elke put. Voeg na een uur incubatie 100 microliter primaire antilichaamoplossing toe aan elke coverslip. Gebruik een pincet om de coverslips te bedekken met vierkante parafilm en plaats de parafilm zorgvuldig om geen bubbels te creëren.

Bedek vervolgens de plaat met aluminiumfolie en incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer. Verwijder de volgende dag de parafilmvierkanten en was de dekplaten drie keer met twee milliliter PBS. Voeg na het wassen 100 microliter secundaire antilichaamoplossing toe aan elke coverslip en bedek de coverslips met een vierkant parafilm zoals gedemonstreerd.

Incubeer het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende één uur en bescherm de plaat tegen licht met behulp van folie. Was vervolgens de coverslips drie keer met twee milliliter 1X PBS. Voeg voor nucleaire kleuring twee milliliter DAPI-oplossing toe aan elke coverslip en was de coverslips met PBS.

Voeg 10 tot 20 microliter IF-specifiek montagemedium toe aan microscoopglaasjes. Gebruik de naald of het fijne pincet om de deklip van de bodem van de put te tillen. Dep overtollige vloeistof voorzichtig af door zachtjes op een keukenpapier te tikken en monteer de coverslips op microscoopglaasjes.

Voor beeldacquisitie en -analyse importeert u deze bestanden in CellProfiler en analyseert u ze met behulp van de spikkeltelpijplijn. Identificeer het primaire object om de foci te identificeren met behulp van de instellingen die worden beschreven in het tekstmanuscript en meet de intensiteit. Representatieve beelden van 5-broom-2-prime-deoxyuridine foci vorming en prolifererende cel nucleaire antigeen kleuring na bestraling worden hier getoond.

De gegenereerde enkelstrengs DNA-sporen werden gevisualiseerd als afzonderlijke foci. De geïdentificeerde foci werden vervolgens gekwantificeerd en uitgedrukt als de totale geïntegreerde intensiteit van de bromodeoxyuridinekleuring in de kernen. Co-kleuring toonde differentiatie tussen de korteafstandsresectie als gevolg van niet-homologe eindverbinding en de langeafstandsresectie van homologe recombinatie met behulp van een anti-PCNA-antilichaam om cellen te identificeren die door de S-fase gaan.

PCNA is prominent aanwezig in de kern en bereikt maximale expressie tijdens de S-fase van de celcyclus met een vrij intense kleuring. Het resultaat in waarden wordt vervolgens uitgezet als een scatterplot om onderscheid te maken tussen PCNA-positieve en PCNA-negatieve kernen. De PCNA-negatieve resultaten worden uit de dataset verwijderd om brdU-intensiteitsgebaseerde analyse mogelijk te maken vanwege het lage BrdU-signaal, ongeacht de aandoening.

De PCNA-negatieve kernen herbergen een basaal geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci van 900 willekeurige eenheden en deze waarde bereikt 1.800 AE in PCNA-positieve kernen. In de siRNA-controleconditie is de geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci per kern ongeveer 1.500 AE in de PCNA-positieve kernen. Na een efficiënte knockdown van PARP-1 met behulp van een siRNA, werd een significante toename van de intensiteit van de BrdU-foci tot ongeveer 1.900 AE waargenomen.

Deze techniek kan belangrijke inzichten bieden in de eerste fase van homologe recombinatie, waardoor wordt bepaald of een eiwit betrokken is bij de eerste stap van het reparatietraject. De incubatietijd voor de pre-extractiebuffers moet strikt worden aangehouden. Overmatige blootstelling aan deze buffers zal resulteren in overmatige celloslating en een verhoogd achtergrondsignaal.