Name: Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Leer hoe je DNA-eindresectie kwantificeert in gekweekte cellen met behulp van BrdU-labeling en celcyclusmarkering. Deze methode onderscheidt homologe recombinatie van niet-homologe eindverbinding voor onderzoek naar DNA-herstelmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Marie-Christine Caron voor haar uitstekende technische advies. Dit werk wordt ondersteund door financiering van de Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. bekleedt een Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S is een FRQS PhD student fellow, en S.Y.M is een FRQS postdoctoraal fellow.

1. Celkweek, behandelingen en coverslippreparaat
OPMERKING: Alle celbeplating, transfecties en behandelingen, afgezien van bestraling, moeten plaatsvinden onder een steriele celkweekkap.
<ol><li>Dag 1<ol>
<li>Plaats in een plaat met 6 putten een enkele afdekplaat in elke put voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ~ 150.000 HeLa-cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling, naar wens. OPMERKING: Als transfecteert, wordt het aanbevolen om een omgekeerde transfectie uit te voeren op het moment van plating, of het is mogelijk om enkele uren na het platen een voorwaartse transfectie uit te voeren om hechting mogelijk te maken. Een omgekeerde transfectie wordt bereikt door de transfectiemix aan de coverslip toe te voegen voordat de cellen worden toegevoegd; transfectie begint dus voordat de cellen beginnen te hechten. Een voorwaartse transfectie daarentegen is de toevoeging van het transfectiemengsel na hechting aan het oppervlak, meestal op de volgende dag. Het is echter mogelijk om dit op dezelfde dag te doen, op voorwaarde dat er voldoende tijd wordt gegeven voor de cellen om zich te hechten.</li>
		<li>Gebruik voor deze methode 4 putten: Put 1: siRNA-controle (siCTRL genoemd); Nou 2: siRNA tegen PARP-1 (siPARP-1); Nou 3: onbehandeld; Wel 4: Te behandelen cellen met 5 μM BMN673 1 uur voorafgaand aan de bestraling. OPMERKING: In dit protocol werden alle tests uitgevoerd onder bestraalde omstandigheden (zie rubriek 1.3).</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator 's nachts, hoewel het transfectieprotocol tot 3 dagen incubatie mogelijk maakt. De incubatietijd voorafgaand aan de BrdU-behandeling is afhankelijk van de siRNA-transfectie-efficiëntie. Als er geen transfectie is, is incubatie gedurende 16 uur voldoende om hechting aan de coverslip en enige celgroei mogelijk te maken. OPMERKING: De omstandigheden van de incubator kunnen worden gewijzigd op basis van de gebruikte cellijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 2<ol>
<li>Voeg BrdU toe in een eindconcentratie van 10 μM in de juiste kweekmedia en incubeer gedurende 16 uur (één celcyclus). OPMERKING: De BrdU-oplossing wordt bereid in dimethylsulfoxide; de gebruikte stamoplossing is 10 mM en wordt opgeslagen in aliquots bij -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 3<ol>
<li>Bestraal de platen met een totale dosis van 5 Gy röntgenstraling (varieer de dosis bestraling afhankelijk van het type bestralingsapparaat, bijvoorbeeld bestralingen voor kleine dieren versus tafelbestralingen). Zie de tabel met materialen voor het merk en het model van de gebruikte bestralingsmachine.</li>
		<li>Breng de platen terug naar de incubator en laat de cellen gedurende 3 uur los.</li>
		<li>Bereid tijdens de incubatietijd van 3 uur de twee buffers, A en B, en 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). OPMERKING: Buffers A en B en de sucrose moeten vers worden bereid op de dag van fixatie, met behulp van verse sucrose-oplossing om besmetting te voorkomen.<ol>
<li>Bereid buffer A (pre-extractiebuffer) voor, volgens de volgorde (30 ml) beschreven in tabel 1. OPMERKING: De 1M sucrose moet op de dag van gebruik worden bereid om besmetting te voorkomen.</li>
			<li>Bereid buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) voor volgens de volgorde beschreven in tabel 1 (30 ml). OPMERKING: Buffer B moet in de aangehaalde volgorde worden bereid om precipitatie van Tween-20 en natriumdeoxycholaatoplossing te voorkomen.</li>
			<li>Bereid 4% PFA, 2 ml per conditie (10 ml), onder een chemische kap (tabel 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorextractie en fixatie
OPMERKING: Alle voorextractie en fixatie worden uitgevoerd met de coverslips die in de weefselkweekplaat op ijs of bij 4 °C achterblijven; de coverslip wordt pas in de laatste stap van de montage opgetild (zie discussie).
<ol><li>Voorextractie<ol>
<li>Zuig het medium op, was de cellen twee keer voorzichtig met 1x PBS en verwijder de PBS. Voeg 2 ml voorextractiebuffer A toe en incubeer onmiddellijk bij 4 °C gedurende 10 minuten. OPMERKING: Het is belangrijk dat de incubatietijd in buffer A niet wordt verlengd. Verlengde incubatie in de pre-extractiebuffers zal resulteren in een verhoogd aantal losgemaakte cellen van de coverslip. Als alternatief kan in plaats van incubatie bij 4°C incubatie op ijs worden gedaan.</li>
		<li>Verwijder buffer A door middel van aspiratie. OPMERKING: Was de coverslips niet na het verwijderen van buffer A. Ga verder met de volgende stap.</li>
		<li>Voeg 2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B toe en incubeer onmiddellijk bij 4 °C gedurende 10 minuten. Aspirateer buffer B zorgvuldig en was de cellen eenmaal zorgvuldig met 1x PBS. Aspiraleer de 1x PBS zorgvuldig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixatie<ol>
<li>Fixeer de cellen door 2 ml 4% PFA onder de chemische kap toe te voegen. OPMERKING: PFA is giftig en moet worden gemanipuleerd onder een chemische kap.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Was de dekenslips twee keer met 1x PBS en zuig het overtollige op.</li>
		<li>Bedek de coverslips met 100% koude methanol en incubeer de coverslips bij -20 °C gedurende 5 min. Was twee keer met 1x PBS. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De coverslips kunnen bij 4 °C in 1x PBS worden bewaard en de plaat indien nodig in aluminiumfolie worden gewikkeld. De cellen mogen niet langer dan 5 dagen worden bewaard voordat het IF-protocol wordt voortgezet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Permeabilisatie
<ol><li>Incubeer de cellen met 2 ml 1x PBS met 0,5% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was de dekenslips drie keer met 2 ml 1x PBS.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Blokkeringsstap<ol>
<li>Bereid voldoende verse blokkeringsbuffer (3% BSA in 1x PBS) voor om 2 ml per coverslip te gebruiken. OPMERKING: Bereid een extra 5 ml blokkerende buffer voor om de antilichaamoplossingen te maken.</li>
		<li>Voeg 2 ml blokkeerbuffer toe aan elke put en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Primaire antilichaam incubatie<ol>
<li>Bereid de primaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: BrdU RPN202 1:1000 en prolifererend celkernair antigeen (PCNA) 1:500, 100 μL per coverslip. OPMERKING: Om het antilichaam te behouden, kan een kleiner volume worden gebruikt, 75-100 μL voor een coverslip van 22 x 22 mm, 50-75 μL voor een coverslip van 18 x 18 mm.</li>
		<li>Voeg op elke coverslip 100 μL primaire antilichaamoplossing toe. Bedek de coverslips met een vierkant parafilm met een pincet en positioneer de parafilm voorzichtig om geen bubbels te creëren.</li>
		<li>Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer.</li>
		<li>Verwijder de vierkanten van de parafilm en was de dekplaten drie keer met 2 ml steriele 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Secundaire antilichaamincubatie<ol>
<li>Bereid voldoende secundaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: anti-muis 488 fluorescerende secundaire A11011 (voor BrdU) verdunning 1:800 en anti-konijn 568 fluorescerende secundaire A11011 (voor PCNA) verdunning 1:800. OPMERKING: De gebruikte kleuren kunnen worden aangepast aan de experimentele behoeften. Het specifieke gebruikte merk is te vinden in de Materialentabel.</li>
		<li>Voeg op elke coverslip 100 μL secundaire antilichaamoplossing toe, bedek de coverslips met een vierkant parafilm met een pincet en plaats de parafilm voorzichtig zonder bubbels.</li>
		<li>Incubeer het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met de plaat bedekt met aluminiumfolie.</li>
		<li>Was de dekenslips drie keer met 2 ml 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nucleaire kleuring<ol>
<li>Bereid een volume van 2 ml per coverslip van 1x PBS met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in een eindconcentratie van 1 μg/ml (1:1000).</li>
		<li>Voeg op elke coverslip 2 ml van de DAPI-oplossing toe. Incubeer de coverslips bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met de plaat bedekt met aluminiumfolie. Was de coverslips twee keer met 1x PBS.</li>
		<li>Bedek de coverslips met 1x PBS en gebruik een naald of een fijn pincet om de coverslip van de bodem van de put te tillen. Dep de overtollige vloeistof voorzichtig af door zachtjes op een keukenpapiertje op een rand te tikken. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de dia niet laat vallen of dat het vlakke oppervlak met de hechtende cellen het papier raakt.</li>
		<li>Monteer de coverslips op dia's met behulp van 10-20 μL IF-specifieke montagemedia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Beeldverwerving en -analyse
OPMERKING: Beeldacquisitie kan worden gedaan op verschillende soorten fluorescerende microscopen. Er werd gebruik gemaakt van een epifluorescentiemicroscoop met een 63x olieobjectief; zie de tabel met materialen voor het merk en model. Z-stacks zijn niet vereist, hoewel ze van nut kunnen zijn, afhankelijk van de cellijn en het niveau van mitochondriale kleuring.
<ol><li>Beeldanalyse<ol>
<li>Maak voor elke afbeelding meerdere tiff-bestanden; voeg alle vlakken samen, maar houd de kleurkanalen gescheiden. Importeer deze bestanden in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) en analyseer met behulp van de Spikkeltel-pijplijn (Aanvullende video 1).</li>
		<li>Upload de afbeeldingen (aanvullende figuur S1A).<ol>
<li>Om te beginnen met het maken van het project, laadt u de spikkeltelpijplijn in het programma en de afbeeldingen die in het opgegeven gebied moeten worden geanalyseerd.</li>
			<li>Gebruik de module NamesAndTypes om aan elke afbeelding een betekenisvolle naam toe te wijzen waarmee andere modules verwijzen naar it-C01: Representing BrdU Channel; C02: Vertegenwoordigt PCNA-kanaal; C03: Vertegenwoordigt DAPI-kanaal. OPMERKING: Deze identificatiemiddelen zijn afhankelijk van de microscoop; er moet een id in de bestandsnaam staan om onderscheid te maken tussen de kanalen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bepaal welk bestand zal worden gebruikt om de kernen te identificeren en geef het een naam (wijzig deze naam indien nodig) (zie Aanvullende figuur S1B en Aanvullende figuur S1C).<ol>
<li>Selecteer de diameter van het object tussen eenheden van 50 en 300 pixels, wat het acceptabele groottebereik voor kernen is, maar wijzig de waarde zodat deze in de kernen in de afbeelding past. OPMERKING: Het kan zijn dat 50 een te grote waarde is en voorkomt dat kleinere kernen worden geïdentificeerd; evenzo kan 300 het mogelijk maken om grote groepen kernen als 1 te tellen.</li>
			<li>Gooi objecten buiten het diameterbereik weg om ervoor te zorgen dat alleen objecten die aan de criteria voldoen, worden geteld.</li>
			<li>Verwijder objecten die randen raken om cellen te verwijderen die zich mogelijk slechts gedeeltelijk in het veld bevinden.</li>
			<li>Pas de drempelwaarde toe om bij de specifieke afbeeldingen te passen. Let op de volgende instellingen als voorbeeld. Wijzig de drempelcorrectiefactor op basis van hoe streng de drempelstrategie zal zijn. Andere instellingen zijn onder meer drempelstrategie: Globaal; drempelmethode: Otsu; drempels voor twee klassen of drie klassen: twee klassen; drempelafvlakkingsschaal: 1; drempelafvlakkingsfactor: 1; onder- en bovengrenzen op drempel: 0,0 en 1,0; methode om samengeklonterde objecten te onderscheiden: Vorm; en methode om scheidingslijnen tussen samengeklonterde objecten te tekenen: Propagateren. OPMERKING: Voor elke parameter biedt cell profiler aanvullende definities en de beschikbare mogelijkheid voor de variabele-instelling.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identificeer het primaire object om de foci te identificeren (aanvullende figuur S2A).<ol>
<li>Gebruik de volgende instellingen: selecteer de invoerafbeelding: Maskedgreen; het te identificeren primaire object genoemd: BrdUFoci; typische diameter van het object: 1-15; gooi het object buiten het diameterbereik weg: Ja; verwijder het object dat de rand van de afbeelding raakt: Nee; drempelstrategie: Adaptatief; drempelmethode: Otsu; drempels voor twee klassen of drie klassen: drie klassen; drempelafvlakkingsschaal: 1; drempelafvlakkingsfactor: 3; en grootte van het afvlakfilter: 4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Meetintensiteit (aanvullende figuur S2B).<ol>
<li>Selecteer de afbeelding die u wilt meten: OrigGreen.</li>
			<li>Klik op Nog een afbeelding toevoegen. Selecteer de afbeelding die u wilt meten: PCNA. Selecteer objecten om te meten: Kernen. OPMERKING: Dit zal worden gebruikt om de BrdU- en PCNA-intensiteit te meten - de uiteindelijke gegevens die in een grafiek worden weergegeven.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li>
<li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li>
<li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li>
<li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+poly%28ADP-ribose%29+formation+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li>
<li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li>
<li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Precision+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li>
<li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitor+resistance%3A+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li>
<li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954(2019).</li>
<li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19(2014).</li>
<li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li>
<li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li>
<li>Huertas, P., Cruz-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+resection+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li>
<li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft een methode die gebruik maakt van IF-kleuring om variaties in DNA-resectie in cellulose te meten. De huidige standaard voor het observeren van een effect op DNA-resectie is door RPA-kleuring; dit is echter een indirecte methode die kan worden beïnvloed door DNA-replicatie. Eerder is een andere op BrdU-integratie gebaseerde DNA-resectie IF-techniek beschreven voor het classificeren van de resulterende intensiteiten in BrdU-positieve en BrdU-negatieve cellen. Met deze methode konden cellen d...

Modulatie van DNA-reparatiefactoren is een steeds evoluerende methode voor kankertherapie, met name in DNA DSB-reparatie-deficiënte tumoromgevingen. De remming van specifieke reparatiefactoren is een van de ingenieuze strategieën die worden gebruikt om kankercellen te sensibiliseren voor DNA-schadelijke stoffen. Tientallen jaren van onderzoek leidden tot de identificatie van verschillende mutaties van DNA-reparatiegenen als biomarkers voor therapeutische strategiekeuzes1. Bijgevolg is het DNA-reparatieveld een hub geworden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen om een breed scala aan behandelingen te garanderen, waardoor het concept van gepersonaliseerde geneeskunde wordt versterkt. 
DSB's worden gerepareerd door twee hoofdroutes: NHEJ en HR2. De NHEJ-route is foutgevoelig, waardoor de twee DNA-uiteinden snel worden geligeerd met weinig tot geen DNA-eindverwerking en waarbij het eiwitkinase (DNA-PKcs), het Ku70/80-complex, 53BP1 en RIF1-eiwitten3 betrokken zijn. HR daarentegen is een getrouw mechanisme geïnitieerd door BRCA14. Een essentiële stap in HR-reparatie is het DNA-end resectieproces, dat is de afbraak van de gebroken uiteinden die leidt tot enkelstrengs (ss) DNA met 3'-OH-uiteinden. BRCA1 vergemakkelijkt de rekrutering van de downstream eiwitten die het resectosoom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 vormen, die betrokken zijn bij de 5' tot 3' DNA-resectie5.
De initiële eindresectie wordt bereikt door de endonuclease-activiteit van MRE11, waardoor verdere verwerking door de DNA2- en EXO1-nucleasen mogelijk is. De gegenereerde ssDNA-overhangen worden snel gecoat met Replicatie-eiwit A (RPA) om ze te beschermen tegen verdere verwerking. Vervolgens nemen BRCA2, PALB2 en BRCA1 deel aan de bemiddeling van de verplaatsing van RPA en de assemblage van het RAD51-nucleofilament dat nodig is voor homologiegericht reparatiemechanisme. Een fijne balans tussen het gebruik van NHEJ en HR is noodzakelijk voor het optimale behoud van de genomische integriteit. De routekeuze hangt af van de celcyclusfase. HR wordt bij voorkeur gebruikt tijdens de S tot G2-fasen waarin DNA-resectie op het hoogste niveau is en de zusterchromatiden beschikbaar zijn om een goede reparatie te garanderen.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) is een van de vroegste eiwitten die voor de DSB worden gerekruteerd. Het regelt zowel de resectieactiviteit als de assemblage van stroomafwaartse effectoren die betrokken zijn bij de NHEJ5,6. PARP-1 is ook vereist voor DNA enkelstrengs breukherstel tijdens replicatie7,8. Vanwege de belangrijke rol in DNA-reparatie worden PARP-remmers (PARPi) gebruikt als kankertherapieën. Bij verschillende HR-deficiënte kankers leidt parpi-behandeling tot een synthetische letale respons als gevolg van het onvermogen van HR-deficiënte cellen om de geaccumuleerde schade te herstellen via een alternatieve route9,10. Er zijn momenteel vier door de FDA goedgekeurde PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib en Talazoparib (ook wel BMN 673 genoemd), die worden gebruikt voor verschillende borst- en eierstokkankerbehandelingen11. PARPi-resistentie komt echter vaak voor en één mogelijke oorzaak ontstaat door de herovering van HR-vaardigheid12. Verlies of remming van PARP-1 in aanwezigheid van bestraling ontregelt de resectosoommachinerie, wat leidt tot de accumulatie van langere ssDNA-traktaten13. Daarom is een diepgaande studie van DNA-resectie in vivo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de daaropvolgende ontwikkeling van nieuwe strategieën om kanker te behandelen en PARPi-resistentie te overwinnen.
Er zijn verschillende methoden gebruikt om DNA-resectiegebeurtenissen te detecteren5. Een van die methoden is de klassieke IF-gebaseerde techniek die indirecte kleuring en visualisatie van het gereseceerde DNA na stress-geïnduceerde DSB mogelijk maakt met behulp van een anti-RPA-antilichaam. Het labelen van genomisch DNA met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) en het detecteren van alleen ssDNA is een directe meting van DNA-resectiegebeurtenissen. Het omzeilt de monitoring van RPA, die betrokken is bij meerdere cellulaire processen zoals DNA-replicatie. In de hier beschreven methode zorgen cellen geïncubeerd met BrdU voor een enkele celcyclus ervoor dat BrdU kan worden opgenomen in één streng van het replicerende cellulaire DNA. Na resectie wordt IF-kleuring uitgevoerd onder omstandigheden die BrdU-detectie alleen in de ssDNA-vorm mogelijk maken, met behulp van een anti-BrdU-antilichaam. Dit antilichaam heeft alleen toegang tot blootgestelde BrdU-nucleotiden en zal die niet detecteren die zijn geïntegreerd in dubbelstrengs DNA. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kan het gereseceerde DNA worden gevisualiseerd in de vorm van punctate BrdU/ ssDNA-foci. De nucleaire intensiteit van deze foci kan worden gebruikt als een uitlezing om resectie na DNA-schade te kwantificeren. Dit artikel beschrijft stap voor stap de processen van deze methode, die kunnen worden toegepast op de meeste cellijnen van zoogdieren. Deze methode zou van breed nut moeten zijn als een eenvoudige manier om DNA-eindresectie in cellulo te monitoren, als een proof of concept.

<table><tbody><tr><td>Alexa 568 geit anti-konijn</td><td>Molecuulflessen</td><td>A11011</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-muis</td><td>Molecuulflessen</td><td>A11001</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Anti PARP1 (F1-23)</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Anti PCNA (SY12-07)</td><td>Novus</td><td>NBP2-67390</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td><td>Abcam</td><td>Ab7291</td><td>1:100000</td></tr><tr><td>anti-BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Benchtop X-ray Irradiator</td><td>Cell Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMN673</td><td>MedChem Express</td><td>HY-16106</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell profiler</td><td>Broad Institute</td><td>V 3.19</td><td>https://cellprofiler.org/</td></tr><tr><td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>10063542</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Dekglasjes: Vierkant 22 x 22</td><td>Fisher scientific</td><td>12 541B</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>63x onderdompeling objectief</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td><td>VWR</td><td>51030408</td><td>37% CO2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BioShop Canada</td><td>MAG520.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>Naald</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bio Products</td><td>311-010-CS</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>Cedarlane Labs</td><td>15710-S(EM)</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>P-36930</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>siPARPi</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td></tr><tr><td>siRNA control</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholcate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop Canada</td><td>SUC507.5</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr><tr><td>Trition X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van wereldwijde dna double-strand eindresectie met behulp van brdu-dna-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

De studie van de DNA-schaderespons (DDR) is een complex en essentieel veld, dat alleen maar belangrijker is geworden door het gebruik van DDR-gerichte geneesmiddelen voor de behandeling van kanker. Deze doelwitten zijn poly(ADP-ribose) polymerasen (PARP's), die verschillende vormen van DNA-reparatie initiëren. Het remmen van deze enzymen met behulp van PARP-remmers (PARPi) bereikt synthetische letaliteit door een therapeutische kwetsbaarheid te verlenen in homologe recombinatie (HR) -deficiënte cellen als gevolg van mutaties in borstkanker type 1 (BRCA1), BRCA2 of partner en localizer van BRCA2 (PALB2). 
Cellen behandeld met PARPi accumuleren DNA dubbelstrengs breuken (DSB's). Deze breuken worden verwerkt door de DNA-eindresectiemachinerie, wat leidt tot de vorming van enkelstrengs (ss) DNA en daaropvolgende DNA-reparatie. In een BRCA1-deficiënte context veroorzaakt het nieuw leven inblazen van DNA-resectie door mutaties in DNA-resectieremmers, zoals 53BP1 en DYNLL1, PARPi-resistentie. Daarom is het kunnen monitoren van DNA-resectie in cellulo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om PARPi-resistentie te overwinnen. Immunofluorescentie (IF)-gebaseerde technieken maken het mogelijk om wereldwijde DNA-resectie na DNA-schade te monitoren. Deze strategie vereist lange-puls genomische DNA-etikettering met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU). Na DNA-schade en DNA-eindresectie wordt het resulterende enkelstrengs DNA specifiek gedetecteerd door een anti-BrdU-antilichaam onder inheemse omstandigheden. Bovendien kan DNA-resectie ook worden bestudeerd met behulp van celcyclusmarkers om onderscheid te maken tussen verschillende fasen van de celcyclus. Cellen in de S/G2-fase maken de studie van eindresectie binnen HR mogelijk, terwijl G1-cellen kunnen worden gebruikt om niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) te bestuderen. Een gedetailleerd protocol voor deze IF-methode gekoppeld aan celcyclusdiscriminatie wordt in dit artikel beschreven.

In dit protocol werd de op bromodeoxyuridine (BrdU) gebaseerde test gebruikt om de resectierespons van HeLa-cellen op door bestraling veroorzaakte schade kwantitatief te meten. De gegenereerde ssDNA-sporen worden gevisualiseerd als afzonderlijke foci na immunofluorescentiekleuring (figuur 1A). De geïdentificeerde foci werden vervolgens gekwantificeerd en uitgedrukt als de totale geïntegreerde intensiteit van de BrdU-kleuring in de kernen (figuur 1B, aanv...

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Dit protocol maakt cellulokwantificering van DNA en resectie na DNA-schade mogelijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de celcyclusmarkering die de cellen beperkt tot de S- en G2-fase, waardoor het bromodeoxyuridinesignaal het resultaat is van DNA en resectie. Jean-Yves Masson, een hoofdonderzoeker, en Sofiane Y.Mersaoui, een postdoctoraal onderzoeker, demonstreren de procedure.Werk onder een steriele kweekkap en plaats een enkele dekplaat in elke put van een plaat met zes putten voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ongeveer 150.000 HeLa cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling. Bestraal op dag drie, na de nachtelijke incubatie met BrdU in een eindconcentratie van 10 micromolair, de platen met een totale dosis van vijf grijze röntgenbestraling.Breng na bestraling de platen terug voor incubatie bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofoxide bevochtigde incubator gedurende drie uur. Voor pre-extractie, aspirateer het medium en was de cellen voorzichtig twee keer met PBS. Voeg na het verwijderen van PBS twee milliliter pre-extractiebuffer A toe en incubeer de cellen bij vier graden Celsius op ijs gedurende 10 minuten.Na 10 minuten, aspiraatbuffer A, voeg twee milliliter cytoskelet stripping buffer B toe en herhaal de incubatie. Aspirateer vervolgens voorzichtig buffer B en was de cellen met PBS. Na het aanzuigen van PBS fixeert u de cellen door twee milliliter van 4% paraformaldehyde onder de chemische kap toe te voegen.Na verwijdering van het paraformaldehyde en wasbeurten met PBS, bedek de coverslips met 100% koude methanol voor incubatie bij min 20 graden Celsius gedurende vijf minuten en was de coverslips twee keer met PBS. Voor permeabilisatie, incubateer de cellen met twee milliliter PBS bevatten 0,5% Tritan X-100 bij kamertemperatuur. Was de dekens na 15 minuten drie keer met twee milliliter PBS.Voeg voor immunostaining twee milliliter blokkerende buffer toe aan elke put. Voeg na een uur incubatie 100 microliter primaire antilichaamoplossing toe aan elke coverslip. Gebruik een pincet om de coverslips te bedekken met vierkante parafilm en plaats de parafilm zorgvuldig om geen bubbels te creëren.Bedek vervolgens de plaat met aluminiumfolie en incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer. Verwijder de volgende dag de parafilmvierkanten en was de dekplaten drie keer met twee milliliter PBS. Voeg na het wassen 100 microliter secundaire antilichaamoplossing toe aan elke coverslip en bedek de coverslips met een vierkant parafilm zoals gedemonstreerd.Incubeer het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende één uur en bescherm de plaat tegen licht met behulp van folie. Was vervolgens de coverslips drie keer met twee milliliter 1X PBS. Voeg voor nucleaire kleuring twee milliliter DAPI-oplossing toe aan elke coverslip en was de coverslips met PBS.Voeg 10 tot 20 microliter IF-specifiek montagemedium toe aan microscoopglaasjes. Gebruik de naald of het fijne pincet om de deklip van de bodem van de put te tillen. Dep overtollige vloeistof voorzichtig af door zachtjes op een keukenpapier te tikken en monteer de coverslips op microscoopglaasjes.Voor beeldacquisitie en -analyse importeert u deze bestanden in CellProfiler en analyseert u ze met behulp van de spikkeltelpijplijn. Identificeer het primaire object om de foci te identificeren met behulp van de instellingen die worden beschreven in het tekstmanuscript en meet de intensiteit. Representatieve beelden van 5-broom-2-prime-deoxyuridine foci vorming en prolifererende cel nucleaire antigeen kleuring na bestraling worden hier getoond.De gegenereerde enkelstrengs DNA-sporen werden gevisualiseerd als afzonderlijke foci. De geïdentificeerde foci werden vervolgens gekwantificeerd en uitgedrukt als de totale geïntegreerde intensiteit van de bromodeoxyuridinekleuring in de kernen. Co-kleuring toonde differentiatie tussen de korteafstandsresectie als gevolg van niet-homologe eindverbinding en de langeafstandsresectie van homologe recombinatie met behulp van een anti-PCNA-antilichaam om cellen te identificeren die door de S-fase gaan.PCNA is prominent aanwezig in de kern en bereikt maximale expressie tijdens de S-fase van de celcyclus met een vrij intense kleuring. Het resultaat in waarden wordt vervolgens uitgezet als een scatterplot om onderscheid te maken tussen PCNA-positieve en PCNA-negatieve kernen. De PCNA-negatieve resultaten worden uit de dataset verwijderd om brdU-intensiteitsgebaseerde analyse mogelijk te maken vanwege het lage BrdU-signaal, ongeacht de aandoening.De PCNA-negatieve kernen herbergen een basaal geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci van 900 willekeurige eenheden en deze waarde bereikt 1.800 AE in PCNA-positieve kernen. In de siRNA-controleconditie is de geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci per kern ongeveer 1.500 AE in de PCNA-positieve kernen. Na een efficiënte knockdown van PARP-1 met behulp van een siRNA, werd een significante toename van de intensiteit van de BrdU-foci tot ongeveer 1.900 AE waargenomen.Deze techniek kan belangrijke inzichten bieden in de eerste fase van homologe recombinatie, waardoor wordt bepaald of een eiwit betrokken is bij de eerste stap van het reparatietraject. De incubatietijd voor de pre-extractiebuffers moet strikt worden aangehouden. Overmatige blootstelling aan deze buffers zal resulteren in overmatige celloslating en een verhoogd achtergrondsignaal.

assessment-global-dna-double-strand-end-resection-using-brdu-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

Het bepalen van de celcyclus positie van een populatie van cellen, of begrijpen hoe signalen proliferatie van invloed zijn, gemakkelijk kan worden gemeten door middel van flowcytometrie gebruik van dit protocol. We brengen verslag uit een eenvoudige experimentele benadering voor vlekken cellen en kwantificeren van hun positie in de cel cyclus.

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

Bijhouden kleine veranderingen in de progressie en kinetiek van celcyclus stadia worden door gebruik van een combinatie van metabolische labeling van nucleinezuren met BrdU en totaal genomisch DNA kleuring via propidium jodide. Deze methode wordt voorkomen dat van de chemische synchronisatie van fietsen cellen, waarbij de introductie van niet-specifieke DNA-schade die op zijn beurt invloed celcyclus.

Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

Toediening van twee analogen van thymidine, Edu en BrdU, bij zwangere muizen maakt de analyse van de celcyclus en in neurale voorlopercellen in de embryonale hersenen van muizen. Deze werkwijze is nuttig om de effecten van genotoxische stress, zoals ioniserende straling, tijdens de hersenontwikkeling bepalen.

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Het volgende protocol presenteert de detectie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus met behulp van celcyclussynchronisatie gevolgd door RPA2-immunofluorescerende kleuring.

Visualisatie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Leer hoe je DNA-eindresectie kwantificeert in gekweekte cellen met behulp van BrdU-labeling en celcyclusmarkering. Deze methode onderscheidt homologe recombinatie van niet-homologe eindverbinding voor onderzoek naar DNA-herstelmechanismen.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Meer video's verkennen