In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Dit protocol beschrijft een in vitro kiemende angiogenesetest die veel kenmerken van de vorming van bloedvaten samenvat en kan worden gebruikt voor het testen van geneesmiddelen. Deze methode is eenvoudig te implementeren in een lab, robuust en schaalbaar. Het heeft veel overeenkomsten met testen met menselijke endotheelcellen en microsferen.

Dit model bootst op robuuste wijze het fenotype na met defecte endotheelcelselectie en georiënteerde endotheelcelmigratie die leidt tot pathologische angiogenese. Het werk kan inzicht geven in de mechanismen die kiemende angiogenese reguleren, de belangrijkste genen en de betrokken signaalroutes, met name door genetische screening uit te voeren De belangrijkste uitdaging is het handhaven van de kwaliteit of pluripotentie van embryonale stamcellen van muizen in cultuur. Het regelmatig controleren van de pluripotentiestadia en morfologie van de cellijnen is belangrijk.

Het is ook belangrijk om een karyotypering van de cellijnen uit te voeren, omdat ze de neiging hebben om te kweken om chromosomen te verliezen of te winnen. Begin met het coaten van een put van de celkweekplaat met zes putten met 500 microliter 0,1% gelatine-oplossing en plaats deze gedurende 30 minuten in een koolstofdioxide-incubator. Was vervolgens de met gelatine beklede platen met PBS en voeg 500 microliter vers bereide CM plus minus medium toe.

Om een zuivere populatie van embryonale stamcellen van muizen of mESCs te verkrijgen, trypsiniseert u de celkweekplaat met 10x TVP-buffer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Resuspendien vervolgens de cellen in één milliliter mesodermdifferentiatiemedium voordat ze gedurende 30 minuten naar de met gelatine gecoate zesputplaat worden overgebracht om de embryonale fibroblasten van de muis te laten hechten terwijl de mESCs in suspensie blijven. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter voordat levende cellen worden geteld met behulp van een Neubauer-hemocytometer in Trypan-blauwe kleurstof.

Centrifugeer vervolgens de cellen op 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspensie van de celkorrel in een geschikt volume mesodermdifferentiatiemedium. Bereid vier polystyreenschalen met lage aanhechting van 94 millimeter door 15 milliliter steriel water aan de bodem toe te voegen.

Nadat u de celsuspensie in een steriel plastic reservoir hebt overgebracht, laadt u vier posities van een meerkanaalspipet met 22 microliter celsuspensie per kanaal. Til het omgekeerde deksel van de schaal van 94 millimeter op het schone oppervlak van de stroomkast met de binnenkant naar boven gericht. Leg 40 druppels van de celsuspensie op het binnenoppervlak van elk deksel en keer het deksel voorzichtig om zonder verstoring om het terug op de schaal te plaatsen, zodat de druppels naar het water gericht zijn.

Incubeer de gerechten gedurende vier dagen in een kooldioxide-incubator, beschouw dit als differentiatiedag nul. Na vier dagen incubatie verzamelt u de hangende druppels in een conische buis van 15 milliliter met behulp van een P1000-pipet. Laat EB-sediment in de buis voordat u het supernatant verwijdert.

Resuspendeer de EB's in drie milliliter 2x vasculair differentiatiemedium voordat EB-suspensie wordt overgebracht en gelijkmatig wordt verdeeld in een schaal met een agarcoating van 60 millimeter. Incubeer de gerechten in een kooldioxide-incubator tot dag negen met een medium verversing om de twee dagen. Bereid een kweekschaal van 35 millimeter door een milliliter van het kiemmedium aan de bodem toe te voegen.

Om gelatie op te wekken, incubeer je het gerecht gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel negen dagen oude EB's uit één agarschaal in een conische buis van 15 milliliter en verwijder het supernatant. Resuspendeer de EB's in twee milliliter koud kiemmedium om over te brengen naar de kweekschaal bedekt met de eerste laag kiemmedium.

Verdeel de EB's over de hele plaat en zorg ervoor dat ze op gelijke afstand van elkaar staan. De eerste kiemvorming moet duidelijk zijn na incubatie gedurende ongeveer 24 tot 48 uur. Gebruik op dag 12 een spatel om de collageengel met EB's voorzichtig over te brengen naar een glazen dia.

Verwijder de overtollige vloeistof met een pipet en droog de gel uit door een gaasje nylon linnen en absorberende filterkaarten op de gel te leggen. Oefen gedurende twee minuten druk uit met een gewicht van 250 gram. Verwijder vervolgens de nylon papieren om de dia's 30 minuten aan de lucht te laten drogen bij kamertemperatuur.

Na het drogen, fixeer de EB's met behulp van zinkoplossing een nacht op vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag het fixeermiddel voordat u de dia's vijf keer met PBS wast. Permeabiliseer de EB's en PBS met 0,1% Triton X-100.

Verwijder na 15 minuten de permeabilisatieoplossing om de dia's vijf keer gedurende vijf minuten met PBS te wassen. Incubeer de EB's in de blokkeringsbuffer gedurende een uur op kamertemperatuur en was ze gedurende vijf minuten met PBS. Voeg vervolgens het primaire antilichaam verdund in de blokkeringsbuffer toe en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.

Incubeer vervolgens de dia's met Goat anti-Rat Alexa 555 secundair antilichaam in een blokkerende buffer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Was na incubatie de dia's drie keer met PBS gedurende vijf minuten en één keer met water voordat u ze monteert voor microscopie. De 3D-kiemangiogenesetest werd uitgevoerd op drie EB's met twee geneesmiddelen, DC101 en DAPT.

Beide verbindingen blokkeerden geleidelijk de angiogenese in het EB-model met toenemende concentraties. De verschillende concentraties van geneesmiddelen in EB's toonden aan dat hoge doses DC101 het aantal en de lengte van de vaatkiemen remmen. DAPT had tegenovergestelde effecten bij de dosis van één micromol per liter.

DAPT verhoogde sterk het aantal endotheelpuntcellen per vatspruiten met een misleidend fenotype, zelfs bij lage doses, in vergelijking met DC101. Defecte vaatkieming werd waargenomen bij erfelijke hemorragische teleangiëctasie-EB's van ACVRL1-controle en ACVRL1 heterozygote genotypen met talrijke misleidingsfenotypen die onder willekeurige hoeken ten opzichte van de oudervaten ontkiemen. Mengsels van een wild-type mESC-lijn in een één-op-één verhouding met een ongelabelde mESC wild-type lijn, leidden tot een gelijke bijdrage aan de leidende endotheelcellen.

Microscopische analyse van deze representatieve chimere EB werd uitgevoerd om de genotypische oorsprong van de leidende endotheelpuntcellen te identificeren. Om de dekking van muurschilderingen van de vaatkiem te kwantificeren, werden EB's gefixeerd en gekleurd voor endotheelcelmarkers, PECAM en muurcelmarker, alfa-gladde spieractine. Een hoge vergrotingsafbeelding onthulde dat één individuele vatspruit was omgeven door muurschilderingen.

De binaire transformatie werd uitgevoerd na scheiding van kleurkanalen en de verhouding van PECAM-positieve vaten bedekt door alfa-SMA-positieve muurschilderingscellen werd gekwantificeerd. De genetische achtergrond van de embryonale stamcellijn is ook een belangrijke factor waarmee de onderzoekers rekening moeten houden, omdat sommige lijnen beter ontkiemen dan andere. Deze methode kan worden gebruikt om genetische screening uit te voeren met behulp van RNAi-benaderingen of een bank van embryonale stamcellen van muizen met genmutaties.