Gebruik van in vivo postnatale elektroporatie om cerebellaire korrelneuronmorfologie en synapsontwikkeling te bestuderen
9 juni 2021
Hier beschrijven we een methode om synaptogenese van korrelneuronen in het cerebellum van de muis te visualiseren gedurende het tijdsverloop van de postnatale hersenontwikkeling wanneer deze cellen hun synaptische structuren verfijnen en synapsen vormen om zichzelf te integreren in het algehele hersencircuit.
Het protocol bestudeert cerebellaire korrelneuronen in verschillende stadia van ontwikkeling om de belangrijkste morfologische groei te visualiseren. De voordelen van de techniek zijn celspecifieke targeting, snelle expressie van getransfecteerde constructen en schaarse labeling van cellen die de studie van celautonome effecten mogelijk maakt. Begin met het snijden van een segment van 11,2 millimeter uit een punt van een laadpipet en plaats het gesneden deel over de punt van de Hamilton-spuit als afstandhouder om de injectiediepte te beperken tot 1,5 millimeter.
Bevestig de afstandhouder op de punt van de spuit met lijm of parafilm. Om de morfologie van enkelvoudige geëlektroperde CGN's van sagittale hersensecties van de experimentele pup te bestuderen, neemt u Z-stack-afbeeldingen met 0,5 micrometer per stapel op een confocale microscoop. Afbeelding van één cel per afbeeldingsvenster voor eenvoudige beeldanalyse en 3D-reconstructie.
Analyseer neurietlengte en dendritische klauwvorming op een geblindeerde manier met behulp van eenvoudige neuriet tracer. Upload eenkanaals Z-stack afbeeldingen van geëlektroperde CGN's naar Fiji en klik op Plugins"Segmentation" en Simple Neurite Tracer"Select Create New 3D Viewer"(Selecteer Create New 3D Viewer" in het vervolgkeuzemenu. Scrol naar de basis van een dendriet die verbinding maakt met cell soma en start een pad door op de kruising te klikken.
Traceer het pad handmatig door door de secties te klikken waar het celvulsignaal het helderst is en op Y te drukken om het spoor te behouden. Traceer tot het einde van de dendriet en bevestig het pad door op F te drukken. Volg vervolgens de klauw vanaf de basis van de structuur tot het einde van de langste neuriet.
Traceer secundaire en tertiaire vertakkingen door Control ingedrukt te houden in Windows of ALT op een macOS en op het pad te klikken. Bevestig het pad door op F.Let erop dat de metingen voor de sporen zichtbaar zijn in een apart venster. Tel alle maten van de klauwtakken bij elkaar op om de totale lengte voor elke klauw te verkrijgen.
In de representatieve analyse toonden projectiebeelden van geëlektroperde CGN's van 3 tot 14 dagen na injectie een progressieve afname van het aantal dendrieten. CGN's ondergingen een fase van dendritische groei gevolgd door verfijning van 3 DPI tot 7 DPI die resulteerde in het snoeien van meer dan 50% van de overtollige dendrieten. Deze gebeurtenis valt samen met de geleidelijke verlenging van de resterende priëlen in de vorming van klauwachtige structuren aan het einde van elke dendriet, wat aangeeft dat deze ontwikkelingsprocessen gelijktijdig plaatsvinden.
Met 7 DPI werden klauwen gevonden op ongeveer 75% van de dendrieten. Elke gelabelde CGN werd gereconstrueerd in NMRS om het totale somato-dendritische oppervlak en volume te kwantificeren. Er werd geen significant verschil in CGN-grootte waargenomen tijdens de ontwikkeling.
Hoewel bij 7 DPI, vertoonden CGN's een significante 20% afname in volume in vergelijking met 3, 5 en 10 DPI. Het belangrijkste in de procedure is om het cerebellum nauwkeurig te lokaliseren vóór de injectie. De methode kan worden aangepast om genen in vivo genetisch te manipuleren om hun rol in de ontwikkeling van korrelneuronen te bestuderen door transfectie van shRNA's, siRNA's of Cre Recombinase.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bestuderen van de morfologische ontwikkeling van granulaire neuronen in het cerebellum (CGN's) in het ontwikkelende muiscerebellum met behulp van in vivo electroporatie. De techniek maakt schaarse labeling en genetische manipulatie van CGN's mogelijk, waardoor gedetailleerde analyse van dendritische groei, klauwvorming en synaptogenese tijdens cruciale ontwikkelingsstadia kan worden uitgevoerd. De methode combineert nauwkeurige injectie, confocale beeldvorming en kwantitatieve morfometrische analyse om de rijping van CGN's in de loop van de tijd te volgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Neuronen ondergaan aanzienlijke structurele en functionele veranderingen tijdens de hersenontwikkeling.
- Het cerebellum van knaagdieren is een modelsysteem voor het bestuderen van morfogenese op enkelcelniveau, in het bijzonder van CGN's.
- CGN's vormen gespecialiseerde dendritische klauwen die essentieel zijn voor synaptische input.
- Traditionele labelingsmethoden missen vaak cel-specificiteit of temporele resolutie.
Doel van de studie
- Om de morfologische ontwikkeling van individuele CGN's in vivo te visualiseren en te kwantificeren.
- Om dendritische groei, pruning en klauwvorming te volgen over verschillende ontwikkelingsfasen.
- Om een platform te bieden voor cel-autonome genetische manipulatie van CGN's.
Gebruikte methoden
- In vivo electroporatie van korrelneuronvoorlopers in het ontwikkelende cerebellum van de muis.
- Spars labeling van CGN's voor een duidelijke morfologische analyse.
- Confocale microscopie met Z-stack imaging voor 3D-reconstructie.
- Handmatig traceren en kwantificeren van neuritlengte en dendritische klauwstructuren met behulp van Fiji en Simple Neurite Tracer.
Belangrijkste resultaten
- Projectiebeelden van 3 tot 14 dagen na injectie (DPI) onthulden een progressieve afname van het aantal dendrieten per CGN.
- Tussen 3 en 7 DPI ondergingen de CGN's dendritische snoei, waarbij meer dan 50% van de overtollige dendrieten werd geëlimineerd.
- Er vormden zich klauwachtige structuren aan de uiteinden van de resterende dendrieten, waarbij klauwen op ~75% van de dendrieten aanwezig waren tegen 7 DPI.
- De grootte van de CGN bleef grotendeels constant, hoewel een significante afname van 20% in volume werd waargenomen bij 7 DPI vergeleken met andere tijdstippen.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde, cel-specifieke analyse van de morfologische ontwikkeling van CGN in vivo mogelijk.
- Dendritische snoei en klauwvorming zijn gelijktijdige processen tijdens de rijping van CGN.
- De methode is aanpasbaar voor genetische manipulatie om de genfunctie bij de ontwikkeling van CGN te bestuderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Kwantitatieve in vivo analyse van de morfologie van cerebellaire granulaire neuronen (CGN) en synapsontwikkeling beantwoordt aan een kritische behoefte aan voorspellend vertrouwen bij de validatie van neuro-ontwikkelingstargets. Mogelijkheden voor sparse labeling en genetische manipulatie maken mechanische risicoreductie mogelijk in de vroegste fasen van CNS-ontdekking. Deze benadering ondersteunt translationele continuïteit door cellulaire morfogenese te koppelen aan synaptische integratie, wat beslissingen over de portfolio in neurobiologisch gerichte R&D onderbouwt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Maakt directe ondervraging van genfuncties bij de morfogenese en synaptogenese van CGN mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door celautonome effecten in vivo te isoleren.
- Biedt kwantitatieve read-outs voor hypothese-gestuurde targetvalidatie.
- Faciliteert de triage van neurodevelopmentale targets op basis van morfologische en synaptische fenotypes.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde, reproduceerbare workflows op voor beeldvorming en analyse van neuronale morfologie.
- Levert kwantitatieve metrieken zoals het aantal dendrieten, klauwvorming en neurietlengte voor verdere screening.
- Maakt standaardisatie van assays mogelijk via geblindeerde, softwareondersteunde morfometrische analyse.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op screening van verbindingen of genetische screening in CNS-pipelines.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt morfologische fenotypes uit met ziekterelevante synaptische ontwikkeling in knaagdiermodellen.
- Ondersteunt de continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie van neurodevelopmentele interventies.
- Biedt een platform voor de evaluatie van translationele biomarkers van synaptische rijping.
- Vermindert risico's bij verdere ontwikkeling door cellulaire veranderingen te koppelen aan functionele synaptische resultaten.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze methode integreert het proces van vroege ontdekking tot identificatie van leadverbindingen in CNS-onderzoek, waardoor iteratieve hypothesetoetsing en kwantitatieve fenotypering van genetische of farmacologische interventies mogelijk worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het toetsen van nulhypothesen voor genfuncties in neuronale morfogenese en synapsvorming.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de analyse van dendritische en synaptische structuren.
- Analytica: Biedt geblindeerde, softwareondersteunde meting van neurietlengte, dendritische klauwen en celvolume.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen cellulaire fenotypes en ziekte-relevante synaptische ontwikkeling in vivo.
- Enterprise-hergebruik: Aanpasbaar voor diverse genetische manipulaties en CZS-modelsystemen binnen ontdekkingsprogramma's.
Operationele & bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van neuro-ontwikkelingstargets en mechanische risicoreductie.
- Operationele waarde: Standaardiseert in vivo beeldvorming en morfometrische analyse voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door genperturbatie te koppelen aan kwantificeerbare neuronale fenotypen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van CNS-targets mogelijk op basis van robuuste in vivo data.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de neuroanatomie van knaagdieren en nauwkeurige stereotactische injectietechnieken.
- Vereist toegang tot confocale microscopie en geavanceerde software voor beeldanalyse (bijv. Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams voor geblindeerde analyse en data-interpretatie.
- Aanpasbaar aan verschillende genetische constructen (shRNA, siRNA, Cre Recombinase) voor cel-autonome studies.
- De nauwkeurigheid van de injectie en de efficiëntie van de celmarkering zijn cruciaal voor reproduceerbare resultaten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
