Name: Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Leer eiwitaggregatie detecteren met fluorescentiecorrelatiespectroscopie voor neurodegeneratieonderzoek. Deze methode analyseert diffusie-eigenschappen van TDP25 en mutant SOD1 in cellysaten en levende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.K. werd ondersteund door een Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), door een grant-in-aid van de Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, door een subsidie van Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) en een grant-in-aid van Hoansha Foundation. M. K. werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) en een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).

1. Materialen en reagentia
<ol><li>Gebruik pyrogene vrije oplossingen en medium voor celkweek (Tabel 1).</li>
	<li>Bereid oplossingen voor het biochemische experiment met ultrapure water en gebruik als DNase / RNase vrij.</li>
	<li>Selecteer een geschikte FBS voor de celcultuur met een partijcontroleproces. Aangezien de geselecteerde FBS-lot regelmatig verandert, kunnen de catalogus en het lotnummer voor FBS hier niet worden weergegeven.</li>
	<li>Plasmide DNA<ol>
<li>Bereid pmeGFP-N15 voor op eGFP monomeerexpressie; pmeGFP-C1-TDP256 voor GFP-TDP25-expressie; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 voor SOD1-G85R-GFP-expressie; en pCAGGS8 als drager. OPMERKING: meGFP is een monomere variant met A206K-mutatie van verbeterde GFP (eGFP). TDP25 is een ALS-geassocieerd C-terminal fragment van TDP-43. SOD1-G85R is een ALS-geassocieerde mutant van SOD1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celspanning<ol>
<li>Gebruik murien neuroblastoom Neuro2a cellen. OPMERKING: Neuro2a-cellen hebben een hoge transfectie-efficiëntie en drukken exogene eiwitten zeer uit. Voor TDP25-expressie zijn celstammen met hoge expressie-efficiënties zoals Neuro2a- of HEK293-cellen vereist. In HeLa-cellen kon TDP25 niet efficiënt worden uitgedrukt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Celcultuur en transfectie
<ol><li>Bereid een plastic schaal van 100 mm die Neuro2a-cellen halfconfluently kweekt in een normaal groeimedium. OPMERKING: Het is noodzakelijk om ongeveer 48-72 uur na het vorige zaaien bij 37 °C te incuberen totdat de semi-samenvloeiing is bereikt.</li>
	<li>Verwijder het medium.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA-oplossing toe aan de celkweekschaal en incubeer ze gedurende 1 minuut bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 9,5 ml normaal groeimedium toe aan de schaal en hang de losgemaakte cellen op.</li>
	<li>Als u Trypan blauw gebruikt om de dode cellen te beitsen, telt u het aantal cellen met behulp van een celteller of handmatig. Verdun vervolgens de cellen in kweekmedium (1,0 × 105/ml).</li>
	<li>Voeg 2 ml celsuspensie toe aan een plastic schaal van 35 mm voor cellyse of een glazen basisschaal voor live-celmeting.</li>
	<li>Incubeer het gerecht gedurende 1 dag op 37 °C.</li>
	<li>Start de volgende voorbereidingen 15 minuten voor de dag van de transfectie.</li>
	<li>Bereid twee buizen van 1,5 ml voor en voeg 100 μL Opti-MEM I toe aan elke buis.</li>
	<li>Meng in de eerste buis 1,0 μg plasmide-DNA (oplossing A). Meng in de tweede tube 2,5 μL Lipofectamine 2000 (oplossing B). OPMERKING: Om de transfectie-efficiëntie te behouden, moet u de totale HOEVEELHEID DNA hetzelfde houden. Om het expressieniveau voor FCS-meting in levende cellen te verlagen, moet de fractiehoeveelheid plasmide-DNA voor eiwitexpressie afnemen (bijv. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R en 0,8 μg pCAGGS-mengsel). Houd bovendien dezelfde verhouding tussen het volume lipofectamine 2000 en de hoeveelheid plasmide-DNA.</li>
	<li>Meng oplossing A en B voorzichtig door er een in een van beide buizen toe te voegen en incubeer deze vervolgens gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (oplossing C).</li>
	<li>Voeg oplossing C toe aan het cultuurmedium; en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C.</li>
</ol>3. Cellysis & middelgrote uitwisseling
<ol><li>Controleer de GFP-expressie met behulp van een routinemicroscoop.</li>
	<li>Verwijder het medium in de schaal.</li>
	<li>Voeg 2 ml PBS bij 25 °C toe om het medium uit te wassen. Verwijder de PBS.</li>
	<li>Leg de schaal op een aluminium plaat bovenop het gemalen ijs. OPMERKING: We gebruiken een 1 mm dikke aluminium plaat gesneden in een zondagse gereedschapswinkel of in de handel verkrijgbaar als laboratoriumapparatuur.</li>
	<li>Voeg 200 μL lysisbuffer toe bij 4 °C. Schud de schaal lichtjes zodat de buffer gelijkmatig verdeeld is over de bodem van de schaal.</li>
	<li>Schraap de schaal met een celschraper en herstel het lysaat met onopgelost celafval in een nieuwe buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing bij 20.400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Herstel het supernatant in een nieuwe buis van 1,5 ml en houd het op 4 °C of op ijs. OPMERKING: Vries het lysaat niet in.</li>
	<li>Vervang voor metingen van levende cellen het medium vóór de meting. Controleer de celbevestiging met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Bevestig de expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>4. Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) kalibratie
<ol><li>Start het systeem en voer de bedieningssoftware uit. Schakel de Argon+ laser (458/477/488/514 nm) in. Stabiliseer het systeem ten minste gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Stel het optische pad in: Grootlichtsplijter: HFT488; Dichroïsche spiegel: NFT600; Fluorescentiebarrièrefilter: een banddoorlaatfilter 505-540 (BP505-540); Detector: lawine fotodiode (APD)).</li>
	<li>Stel de pinholegrootte in door de waarde direct in te voeren (66 μm; 1 luchtige eenheid).</li>
	<li>Voeg de Rhodamine 6G (Rh6G) oplossing toe aan een put van de afdekglaskamer op het podium.</li>
	<li>Voeg de onderdompeling ultrapure water op het doel. Gebruik de onderdompelingsolie niet.</li>
	<li>Plaats de kamer op het microscoopstadium. Verplaats het werkgebied naar de juiste positie.</li>
	<li>Focus op het bovenste glasoppervlak door het verstrooide licht van het glasoppervlak te meten. Nadat u de objectieve lens naar beneden hebt verlaagd, draait u de scherpstelknop met de klok mee om deze aan te passen. OPMERKING: Controleer de draairichting van de scherpstelknop omdat deze tegenovergesteld is aan die in Japan en Duitsland.</li>
	<li>Breng het brandpunt 200 μm boven het bovenste glasoppervlak om de binnenkant van de oplossing te observeren.</li>
	<li>Klik op de telsnelheid en controleer de snelheid van het aantal fotons.</li>
	<li>Verhoog geleidelijk de AOTF-waarde (acousto-optic tunable filters) (bijv. excitatielasertransmissie) zodat de telsnelheidswaarde meer dan 10 kHz is.</li>
	<li>Klik op de pinhole-aanpassing en open de wizard pinhole-aanpassing. Zoek de pinhole positie met het hoogste (een piek) aantal fotonen in zowel de x- als de y-as.</li>
	<li>Draai de correctiering van de objectieve lens zo dat de tellingen per molecuul (CPM) de hoogste zijn. OPMERKING: Aangezien de dikte van het afdekglas van de hier gespecificeerde kamer 0,12-0,17 mm is, bevindt de correctiering zich rond het minimum of slechts een paar omwentelingen ervan, waar de CPM maximaal is.</li>
	<li>Verlaag de AOTF-waarde geleidelijk, zodat de CPM-waarde 2-3 kHz wordt.</li>
	<li>Verkrijg de autocorrelation functie (ACF) van Rh6G gedurende 90 s.</li>
	<li>Zodra de meting is voltooid, klikt u op Aanpassen om curve-fittinganalyse uit te voeren.</li>
	<li>Selecteer een model voor eencomponent driedimensionale (3D) diffusie met een tripletstatus. OPMERKING: De Rh6G is monodisperse en eencomponenten diffuus met een triplettoestand.</li>
	<li>Stel de begintijd van de montage in door de rode lijn te verplaatsen. Klik op Alles passen en controleer de afwijking van de pasvorm. Zorg er na het uitvoeren van de curvefitting voor dat de diffusietijd (DT) en de structuurparameter (SP) ruwweg tussen respectievelijk 20-30 μs en 4-8 liggen.</li>
	<li>Onthoud de waarde van de structurele parameter. Gebruik de SP-waarde voor curvemontageanalyse van alle ACL's die op dezelfde dag worden gemeten, onder dezelfde optische omstandigheden, en met hetzelfde type glazen basisschaal of kamerdekselglas dat op het microscoopstadium is geplaatst.</li>
</ol>5. FCS-meting in cellysaat
<ol><li>Bereid de cellysaten voor (zie hierboven).</li>
	<li>Plaats het lysaat op de glazen afdekkamer. Plaats een deksel om uitdroging te voorkomen en het podiumdeksel voor lichte schaduw.</li>
	<li>Stel de aanschafconditie, laservermogen, meettijd en herhalingen in.</li>
	<li>Klik op Telsnelheid en pas de AOTF-waarde van de laser aan zodat de CPM-waarde meer dan 1 kHz wordt.</li>
	<li>Voer een proefmeting uit gedurende 1 min. Controleer of de berekende ACF een positieve amplitude en glad verval vertoont.</li>
	<li>Voer de hoofdmeting gedurende 5 minuten uit. OPMERKING: De totale meettijd wordt geleidelijk verhoogd totdat de vorm van de ACF niet verandert, zelfs niet als de meettijd wordt verhoogd.</li>
	<li>Klik op Aanpassen om curve-fittinganalyse uit te voeren.</li>
	<li>Selecteer een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een tripletstatus. Vergeet niet om de SP-waarde in te voeren en de instelling te wijzigen in "Opgelost" niet "Gratis" voordat u op Alles passen klikt.</li>
	<li>Exporteer de ingerichte tabel als een door tabs gescheiden tekstbestand.</li>
	<li>Exporteer indien nodig de ACF- en count-tariefrecord als een door tabbladen gescheiden tekstbestand.</li>
</ol>6. FCS-meting in levende cellen
<ol><li>Vervang het medium door een nieuw medium voor de meting.</li>
	<li>Gebruik een warmtefase incubator. Zet de celkweekschaal op het microscoopstadium.</li>
	<li>Bevestig de scherpstelling en positie met behulp van de confocale micrope. Selecteer de meetcel. Zoom in en pas de celpositie aan. Verkrijg fluorescentiebeelden van een GFP-expresserende cel met behulp van de modus voor langzame scansnelheid.</li>
	<li>Selecteer een FCS-meetpositie met behulp van Positie in de sectie "FCS".</li>
	<li>Selecteer ten minste één FCS-meetpunt met behulp van een kruisdraad (figuur 1).</li>
	<li>Meet de ACF gedurende 1 min. OPMERKING: Omdat fluorescerende eiwitten de neiging hebben om in levende cellen te worden gefotobleekt als gevolg van langzame beweging in vergelijking met de oplossing, moet de meettijd minimaal zijn. Het is over het algemeen moeilijk om ACF in de cel zo soepel te verkrijgen als oplossingsmetingen, omdat langdurige metingen zullen leiden tot fotobleaching van fluorescerende eiwitten.</li>
	<li>Klik op Aanpassen om curve-montageanalyse uit te voeren met behulp van een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een tripletstatus. OPMERKING: Voor metingen van levende cellen zou een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een triplettoestand beter zijn omdat het empirisch moeilijk is om de chi-kwadraatwaarde te verlagen met een 3D-diffusiemodel met één component vanwege het bestaan van verschillende mobiele componenten in de levende cel. Maar zelfs met behulp van een model voor driecomponenten 3D-diffusie, worden de diffusiecomponenten meestal niet gescheiden in vergelijking met het gebruik van het model voor twee componenten.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
<li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li>
<li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230(2016).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li>
<li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Deze auteurs hebben geen belangenconflicten.

Wat de systeemkalibratie vóór de metingen betreft, moet hetzelfde glaswerk worden gebruikt als het glaswerk dat wordt gebruikt om het monster te meten (bv. de 8-putten bedekken de glazen kamer voor cellysaat en de glazen basisschaal van 35 mm voor levende cellen). Door de adsorptie van Rh6G op het glas kan de effectieve concentratie soms afnemen. Als dat het gevolg is, moet een sterk geconcentreerde Rh6G-oplossing zoals 1 μM alleen voor de pinhole-aanpassing worden gebruikt. Extreem hoge fotontellingen moeten worden verm...

Eiwitaggregaties met neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, enzovoort1 zijn bekend als giftig en zouden de eiwithomeostase (proteostase) in de cellen en organen verstoren, wat dan kan leiden tot veroudering2. De klaring van eiwitaggregatie wordt verwacht als een therapeutische strategie; chemische stoffen die eiwitaggregatievorming voorkomen en eiwitaggregaten afbreken (bijv. kleine moleculen of geneesmiddelen) zijn echter nog niet vastgesteld. Bovendien blijft de manier waarop eiwitaggregatie toxiciteit uitoefent ongrijpbaar. Daarom is het belangrijk om, om onderzoeksprojecten met betrekking tot eiwitaggregatie te bevorderen, procedures met een hoge doorvoer in te voeren om eenvoudig eiwitaggregatie te detecteren. Eiwitaggregatiedetectie met behulp van antilichamen die de conformatie van eiwitaggregatie en aggregatiespecifieke fluorescerende kleurstof herkennen, is veel gebruikt3. Het is echter moeilijk om de aggregatie te detecteren, vooral in levende cellen met behulp van dergelijke klassieke procedures. 
Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een procedure om eiwitaggregatie en structurele verandering te detecteren. FRET is echter niet in staat om eiwitdynamiek te analyseren (bijv. diffusie en oligomerisatie van eiwitten in levende cellen)3. Daarom introduceren we hier een eenvoudig protocol om eiwitaggregatie in oplossing (bijv. cellysaat) en levende cellen te detecteren met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS), die de diffusie-eigenschap en helderheid van fluorescerende moleculen met één molecuulgevoeligheidmeet 4. FCS is een fotontellingsmethode met behulp van een laserscan confocale microscoop (LSM). Met behulp van een zeer gevoelige fotondetector en berekening van de autocorrelatiefunctie (ACF) van de aankomsttijd van foton wordt de passeertijd en helderheid van de fluorescerende moleculen in het detectievolume gemeten. De diffusie vertraagt met een toename van het molecuulgewicht; zo kan intermoleculaire interactie worden geschat met behulp van FCS. Sterker nog, een toename van de helderheid van het fluorescerende molecuul duidt op homo-oligomerisatie van de moleculen. Daarom is FCS een krachtig hulpmiddel om een dergelijke eiwitaggregatie te detecteren.

<table><tbody><tr><td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&middot;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>100-mm plastic dishes</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>35-mm glass base dish</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Voor meting van levende cellen</td></tr><tr><td>35-mm plastic dishes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium plaat</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Objectief</td></tr><tr><td>Celkrabber</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetaat filtermembraan (0.22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Dekglaskamer 8-wells</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Voor oplossingsmeting</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>basismedium</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>biosera</td><td></td><td>Lotcontrole vereist</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>FCS-systeem</td></tr><tr><td>Murine neuroblastoma Neuro2a cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>Plasmied-DNA voor de transfectiedrachter</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing (&times;100 )</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>Plasmied-DNA voor TDP25 getagd met monomer eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>Plasmied-DNA voor eGFP monomeer expressie</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>Plasmied-DNA voor ALS-gekoppelde G85R mutant van SOD1 getagd met monomer eGFP</td></tr><tr><td>Protease remmercocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Eiwitaggregatie is een kenmerk van neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (ZvH), enzovoort. Om oplosbare of diffuse eiwit oligomeren of aggregaten te detecteren en te analyseren, is fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) gebruikt, die de diffusiesnelheid en helderheid van een enkel deeltje met een enkele molecuulgevoeligheid kan detecteren. De juiste procedure en knowhow voor de detectie van eiwitaggregatie zijn echter niet op grote schaal gedeeld. Hier tonen we een standaardprocedure van FCS-meting voor diffusie-eigenschappen van aggregatiegevoelige eiwitten in cellysaat en levende cellen: ALS-geassocieerd 25 kDa carboxyl-terminal fragment van TAR DNA/RNA-bindend eiwit 43 kDa (TDP25) en superoxide dismutase 1 (SOD1). De representatieve resultaten tonen aan dat een deel van de aggregaten van groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld TDP25 enigszins was opgenomen in de oplosbare fractie van murien neuroblastoom Neuro2a cellysaat. Bovendien toont GFP-gelabelde SOD1 met ALS-geassocieerde mutatie een langzamere diffusie in levende cellen. Dienovereenkomstig introduceren we hier de procedure om de eiwitaggregatie via de diffusie-eigenschap ervan te detecteren met behulp van FCS.

We voerden FCS-meting uit van GFP-TDP25 in cellysaat en SOD1-G85R-GFP in levende cellen. In beide gevallen konden een positieve amplitude en gladde ACL's worden verkregen. We hebben aangetoond dat een deel van GFP-TDP25, uitgedrukt in Neuro2a-cellen, werd teruggevonden in de oplosbare fractie onder de aangegeven toestand6. In de oplosbare fractie van het cellysaat werden extreem heldere fluorescentiemoleculen gedetecteerd in het fotontellingssnelheidsrecord met behulp van FCS(...

We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Het beste principe van de fluorescentiecorrelatiespectroscopie, FCS, werd aanvankelijk uitgevonden in de jaren 1970. In de jaren 1990 werden belangrijke en vele verbeteringen voor FCS vastgesteld door te combineren met een confocale apparaatmicroscopie. Sindsdien wordt FCS gebruikt voor vele chemische en viruskuurtoepassingen, zoals moleculaire interacties en eiwitaggregatieanalyse.Eiwitaggregatie is een kenmerk van neurodegeneratieve aandoeningen. Fluorescentiehelderheid zijn enkelvoudige deeltjes in werking van moleculaire grootte verklaard door diffusie-eigenschappen. Het is erg belangrijk bij het meten van eiwitaggregaties omdat het geprojecteerde levenscyclussen van moleculen kan bepalen, maar ook de homo- of heteropolymerisatie kan onderscheiden.Hier introduceren we een procedure om diffusie van amyotrofische laterale sclerose geassocieerd met geaggregeerde vormeiwit te meten met behulp van FCS in cellysaten en levende cellen. Bereid 100 millimeter plastic schotel groeien Neuro2a cel zitten comfortabel in de normale groei medium. Bevestig de celconfluency.Verwijder het medium. Voeg 3,5 milliliter Trypsin-EDTA-oplossing toe aan de derde patroonschaal en incubeer ze gedurende één minuut op 37 graden Celsius. Voeg 9,5 milliliter normaal groeimedium toe aan de schaal en hang ze op.De celsuspensie wordt gemengd met trypanblauw om de dode cellen te bevlekken. Voeg suspensie toe aan de celtellingsdia. Tel het aantal cellen met behulp van de celteller of handmatig.Controleer het live celnummer en hun levensvatbaarheid. Verdun de cel in het getelde medium met 1,0 maal 10 tot een vermogen van 5 per milliliter. Voeg twee milliliter celsuspensie toe aan de 35 millimeter plastic schaal voor cellysis of groeiruimteschaal voor live celmeting.Incubeer het gerecht een dag op 37 graden Celsius. Bereid de volgende dag het mengsel van plasmide-DNA en de transfectiereagentia. Voeg het transfectiemengsel toe aan het celgetelde medium en incubeer de cellen gedurende 24 uur.Een dag later. Controleer de GFP-expressie met behulp van een routinemicroscoop. Je kunt de zeer heldere TDP25-ingrediëntlichamen in cellen zien.Cellyse moet worden uitgevoerd op de biochemische bank. Verwijder het medium in de schaal. Voeg twee milliliter PBS toe op 25 graden Celsius om als medium te wassen.Verwijder de PBS. Leg de schaal op een aluminium plaat op de bovenkant van het gemalen ijs. Voeg onmiddellijk de 200 microliter lysis buffer toe aan de schaal.Schraap de schaal met een celschraper. Herstel het lysaat met onopgelost celafval in een nieuwe buis van 1,5 millimeter. Centrifugeer het lysaat op vier graden Celsius.Voor metingen van levende cellen moet u het medium vóór de meting vervangen door een nieuw medium. Controleer de celbevestiging met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Controleer ook de GFP-expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.Gebruik een confocale microscoop-gecombineerd FCS-systeem. Schakel de 488 nanometer laser in. Stabiliseer het systeem minstens 30 minuten.Stel het optische pad in. Gebruik een laser van 488 nanometer voor het directe licht. Gebruik een geschikte beam splitter en dichroic meters.En ook fluorescentie fusers. Meestal gebruiken we afdekglaskamers voor kalibratie- en oplossingsmetingen. Voorzichtig, neem de afdekkamer.Plaats het glasoppervlak op het lensscreeningspapier. Giet de FCS kalibratie. Voeg ook de Rhodamine 6G-oplossing toe.Voeg het ultrapure water toe aan het doel. Gebruik de olie niet. Plaats de kamer op het microscooppodium.Verplaats het werkgebied naar de juiste positie. Maak de pinhole-aanpassing en open de pinhole-aanpassingswizard. Bewaak de telsnelheid van het foton als grove beweging van het pinhole voor de x-richting.De helderste positie werd terecht bepaald. Controleer vervolgens de telsnelheid van het foton als fijne beweging. De helderste positie is met succes bepaald Dit is de pinhole positie voor x-richting.Zoek op dezelfde manier de helderste positie van het pinhole naar y-richting. De helderste positie voor y-richting werd ook met succes bepaald. Maak de x- en y-positie van het pinhole nog erger.Het is beter om de pinhole positie aan te passen voor de meting van elke dag. Wanneer het livepad wordt gewijzigd, moet de pinhole-positie opnieuw worden aangepast. Maak een telsnelheid en bewaak het aantal telefoons.Ga naar de CPM-bewakingsmodus. Tel de correctiering van het object dat u hebt uitgevoerd, zodat de CPM-waarde de hoogste is. Sluit het venster met de telsnelheid.Begin met de Rhodamine 6G oplossingsmeting. Nadat de meting is voltooid, klikt u op de pasvorm om curve-fittinganalyse uit te voeren. Selecteer een model voor de montage van de oude correlatiefunctie.Voor Rhodamine 6G selecteert u het model voor 1-componenten, 3-dimensionale diffusie met een triplettoestand. Stel de begintijd van de montage in door de rode lijn te verplaatsen. Klik op Alles passen om de montageberekening te starten.Controleer de pasvormafwijking. Zorg ervoor dat de zijkanten zijn geplaatst en negatief, rond nul. Controleer de gemonteerde waarden.Zorg ervoor dat de diffusietijd ongeveer tussen de 20-30 microseconden ligt. Bovendien is de structurele parameter van vier tot acht. Open het montagepaneel en selecteer een model voor de meting.Voer dezelfde structurele parameterwaarde in het model in voor het voorbeeld in het deelvenster Passend. Zorg ervoor dat het type moet worden ingesteld als Opgelost. GFP-TDP25 meting in cellysaat.Plaats het lysaat in de afdekkamer. Plaats het deksel om opdrogen van het lysaat te voorkomen. Plaats het podiumdeksel voor lichte schaduw.Stel in het acquisitiepaneel het laservermogen, de meettijd en de herhalingen in. Start de acquisitie. Er werd een piek waargenomen.Er werd weer een piek waargenomen. De piek geeft heldere moleculen aan die door het detectielichaam gaan. Spikes duiden op oplosbare oligomeren of aggregaten.Maak een pasvorm om curve fitting analyse uit te voeren. Selecteer het model voor 2-componenten, 3-dimensionale diffusie met tripletstatus. Stel de begintijd van de montage in.Klik op Alles passen. Controleer de gemonteerde waarden. SOD1-G85R getagd met GFP-meting in een levende cel.In tegenstelling tot oplossingsmeting, raad ik aan om de heat stage incubator te gebruiken. Zet de celklindende schotel op het microscooppodium. Bevestig de scherpstelling en de positie met behulp van de oculaire.Selecteer een meetcel. Zoom in en pas de celpositie aan met behulp van een snelle scanmodus. Maak de momentopname van de cellen met behulp van de modus voor langzame scansnelheid.Selecteer een FCS-meetpositie met behulp van het gereedschap Positie. Het kruishaar geeft de meetpositie aan. Start de meting.De lichte daling van het aantal foton's suggereert fotobleaching van GFP. Voer de curve-fitting uit. Representatieve resultaten van GFP-TDP25 in cellysaat worden weergegeven.De bovenste grafiek een record van foton telling tarief. Waar pijlen zijn, is een piek, wat oplosbare oligomeren en aggregaten suggereert. De middelste grafiek vertegenwoordigt de oude correlatiefunctie.De grijze lijn toont de lage, oude correlatiefunctie. De magentalijn toont de gemonteerde functie. De stippellijnen geven de begin- en eindtijden aan voor montage.De onderste tabel toont de gemonteerde waarde. Vervolgens worden representatieve resultaten van SOD1-G85R-GFP in een levende cel weergegeven. De bovenste grafiek vertegenwoordigt een record van ons aantal foton.De geleidelijke afname van de geregistreerde fotontelling werd waargenomen, wat wijst op fotobleaching van de GFP-groei voor verschillende metingen. Dit komt door de trage diffusiesnelheid in levende cellen. De middelste grafiek vertegenwoordigt de oude correlatiefunctie van SOD1.De grijze lijn toont de lage, oude correlatiefunctie. De magentalijn toont de gemonteerde functie. De stippellijnen geven de begin- en eindtijden met montage aan.De onderste tabel toont de gemonteerde waarden. Hier laten we u deze procedure zien om diffusie te meten van elke cel geassocieerd TDP-25 in cellysaat en alles wat mutant is van SOD1 in levende cellen met behulp van FCS. De oplosbare oligomeren en aggregatie in cellysaat kunnen vaak worden waargenomen als pieken of uitbarstingen.Aan de andere kant worden dergelijke pieken in levende cellen zelden waargenomen, behalve mogelijk voor de hand liggende levende structuren. Een langzaam verspreidende soort mutante SOD1's voegt voor ons een gemiddelde helderheid toe voor enkele deeltjes zoals SOD1 homopolymerisatie binnenin. De hier getoonde procedure is eenvoudig en de moeite waard.FCS bevat geen straling;direct slapende toestand. Het is gewoon jouw, en onze, verbeeldingskracht empathie.

detection-protein-aggregation-using-fluorescence-correlation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

This video demonstrates the technique of fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) to study protein homo-oligomerization. Fluorescently-labeled proteins in a sample are dimerized using an agent when studying protein oligomerization using FFS. Using a confocal microscope, as the proteins move in and out of the small observation volume, the analysis of the fluctuations in the brightness of the fluorescent molecules is performed to determine the oligomeric state of the proteins.

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Homo-Oligomerization

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor,...

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Antilichamen die zich aan target receptoren van het celoppervlak binden kunnen verlenen bevleesdheid en clustering wijzigingen. Deze dynamische veranderingen hebben gevolgen voor het karakteriseren van Geneesmiddelenontwikkeling in de doelcellen. Dit protocol maakt gebruik van de confocal microscopie en afbeelding correlatie spectroscopie via ImageJ/FIJI te kwantificeren van de omvang van de receptor clustering op het celoppervlak.

Confocale microscopie onthult cel oppervlakte Receptor aggregatie via afbeelding correlatie spectroscopie

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

We beschrijven de toepassing van infrarood nano spectroscopie en hoge-resolutie atomaire kracht microscopie om het proces van eiwit zelf montage te visualiseren in oligomere aggregaten en amyloïde fibrils, die nauw verbonden is met het ontstaan en de ontwikkeling van een breed scala aan humane neurodegeneratieve aandoeningen.

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Dit protocol beschrijft een unieke methode voor het detecteren van de binding tussen verbindingen en eiwitmoleculen, en biedt de voordelen van minimaal verlies van eiwitmonsters en een hoge nauwkeurigheid van de gegevens.

Detectie van CD40-eiwit-umbelliferon-interactie via differentiële scanfluorescentie

Leer eiwitaggregatie detecteren met fluorescentiecorrelatiespectroscopie voor neurodegeneratieonderzoek. Deze methode analyseert diffusie-eigenschappen van TDP25 en mutant SOD1 in cellysaten en levende cellen.

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Meer video's verkennen