Name: Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer een snelle methode voor identificatie van immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse. Deze aanpak versnelt onderzoek naar bacteriële afweermechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protein Biomarker Seeker software is vrij beschikbaar (gratis) door contact op te nemen met Clifton K. Fagerquist op clifton.fagerquist@usda.gov. We willen de steun van dit onderzoek erkennen door ARS, USDA, CRIS-subsidie: 2030-42000-051-00-D.

1. Microbiologische monstervoorbereiding
<ol><li>Ent 25 ml Luria-bouillon (LB) in een conische buis van 50 ml met E. coli O113:H21 stam RM7788 (of een andere bacteriestam) uit een glycerolvoorraad met behulp van een steriele lus van 1 μL. Beding de buis en de voorkweek op 37 °C met schudden (200 rpm) gedurende 4 uur.</li>
	<li>Aliquot 100 μL voorgekweekte bouillon en verspreid op een LB agarplaat aangevuld met 400 of 800 ng / ml mitomycine-C. Kweek agar platen statisch 's nachts in een incubator bij 37 °C. LET OP: STEC-stammen zijn pathogene micro-organismen. Voer alle microbiologische manipulaties uit, buiten het kweken, in een BSL-2 bioveiligheidskast.</li>
	<li>Oogst bacteriële cellen uit enkele zichtbare kolonies met behulp van een steriele lus van 1 μL en breng over naar een met O-ring beklede schroefdop microcentrifugebuis van 2,0 ml met 300 μL water van HPLC-kwaliteit. Sluit de buis, vortex kort en centrifugeer gedurende 2 minuten op 11.337 x g om de cellen te pelleteren.</li>
</ol>2. Massaspectrometrie
<ol><li>Plaats 0,75 μL aliquot van het monster supernatant op het roestvrijstalen MALDI-doel en laat het drogen. Overlay de gedroogde monstervlek met a0,75 μL aliquot van een verzadigde oplossing van sinapinic acid in 33% acetonitril, 67% water en 0,2% trifluoracetinezuur. Laat de plek drogen.</li>
	<li>Analyseer de gedroogde monstervlekken met behulp van een MALDI-TOF-TOF massaspectrometer.<ol>
<li>Nadat u het MALDI-doel in de massaspectrometer hebt geladen, klikt u op de knop voor MS lineaire modusacquisitie in de acquisitiesoftware. Voer het te analyseren m/z-bereik in door de m/z van de onder- en bovengrenzen (bijv. 2 kDa tot 20 kDa) in hun respectieve velden in te voeren in de software van de acquisitiemethode.</li>
		<li>Klik op de voorbeeldspot om te worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon in de software. Druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de muiscursor over de voorbeeldvlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor laserablatie / ionisatie. Laat de muisknop los en de acquisitie zal initiëren. Verzamel 1.000 lasershots voor elke monsterplek. OPMERKING: Gegevensverzameling wordt in realtime weergegeven in het software-acquisitievenster.</li>
		<li>Als er geen ionen worden gedetecteerd, verhoogt u de laserintensiteit door de glijdende schaalbalk onder Laserintensiteit in de software aan te passen totdat het eiwitionensignaal wordt gedetecteerd. Dit wordt drempel genoemd. OPMERKING: Kalibreer het instrument voorafgaand aan de monsterspotanalyse extern in MS lineaire modus met eiwitkalibraten waarvan de m/z het te analyseren bereik overspannen, bijvoorbeeld de +1- en +2-ladingstoestanden van eiwitkalibraten: cytochroom-C, lysozym en myoglobine bestrijken een massabereik van 2 kDa tot 20 kDa. Een tussenmassa binnen het gespecificeerde massabereik wordt gebruikt als focusmassa, bijvoorbeeld 9 kDa. De focusmassa is het ion waarvan de m/z optimaal is gericht voor detectie door de lineaire modusdetector.</li>
		<li>Wanneer de ms lineaire modus acquisitie is voltooid, klikt u op de knop voor MS/MS reflectron mode acquisitie in de acquisitie software. Voer de te analyseren voorlopermassa in het veld Precursor Mass in. Voer vervolgens een isolatiebreedte (in Da) in het Precursor Mass Window in voor de lage en hoge massazijde van de precursormassa, bijvoorbeeld ±100 Da.</li>
		<li>Klik op de knop CID Uit. Klik op de knop Metastable Suppressor ON. Pas de laserintensiteit aan tot ten minste 90% van de maximale waarde door de glijdende schaalbalk onder de laserintensiteit in de software aan te passen.</li>
		<li>Klik op de voorbeeldspot om te worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon in de software. Druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de muiscursor over de voorbeeldvlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor laserablatie / ionisatie. Laat de muisknop los en de acquisitie wordt gestart. Verzamel 10.000 laserfoto's voor elke monsterplek. OPMERKING: Voorafgaand aan de monsterspotanalyse moet het instrument extern worden gekalibreerd in MS/MS-reflectronmodus met behulp van de fragmentionen van post-source decay (PSD) van de +1-ladingstoestand van gealkyleerd thioredotoxine35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwerk geen ruwe MS-gegevens. Verwerk ms/ms-psd ruwe gegevens met behulp van de volgende reeks stappen in de opgegeven volgorde: geavanceerde basislijncorrectie (32, 0,5, 0,0) gevolgd door ruisonderscheiding (twee standaarddeviaties) gevolgd door Gaussiaanse afvlakking (31 punten).</li>
	<li>Inspecteer MS/MS-PSD-gegevens handmatig op de aanwezigheid van prominente fragmentionen gegenereerd door PBC19,20.</li>
	<li>Evalueer MS/MS-gegevens met betrekking tot de absolute en relatieve abundantie van fragmentionen en hun signaal-ruis (S/N). Gebruik alleen de meest voorkomende fragmentionen voor eiwitidentificatie, vooral als de MS / MS-PSD-gegevens luidruchtig zijn.</li>
</ol>3. In silico eiwit database constructie
<ol><li>Genereer een tekstbestand met in silico eiwitsequenties van de bacteriestam, die door de Protein Biomarker Seeker-software worden gescand voor de eiwitidentificatie. Eiwitsequenties zijn afgeleid van whole-genome sequencing (WGS) van de stam die wordt geanalyseerd (of een nauw verwante stam).</li>
	<li>Ga naar de NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) website om ongeveer 5.000 eiwitsequenties te downloaden van de specifieke bacteriestam (bijv. Escherichia coli O113:H21 stam RM7788) die wordt geanalyseerd. De maximale downloadgrootte is 200 reeksen.<ol>
<li>Kopieer en plak de 25 downloads vervolgens in één tekstbestand. Selecteer de FASTA-indeling (tekst) voor elke download.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Operating Protein Biomarker Seeker software
<ol><li>Dubbelklik op het uitvoerbare bestand Protein Biomarker Seeker. Er verschijnt een venster met de grafische gebruikersinterface (GUI)(Figuur 1,bovenpaneel).</li>
	<li>Voer de massa van de eiwitbiomarker (zoals gemeten in MS-lineaire modus) in het Mature Protein Mass-veld in. Voer vervolgens de massameetfout in het veld Massatolerantie in. De standaard massameetfout is ±10 Da voor een eiwit van 10.000 Da.</li>
	<li>Klik eventueel op de knop Complementary b/y ion Protein Mass Calculator om de eiwitmassa te berekenen uit een vermeende complementair fragmentionenpaar (CFIP of b/y). Er verschijnt een pop-upvenster, Protein Mass Calculator Tool(Figuur 1,onderste paneel).<ol>
<li>Voer de m/z van de vermeende CFIP in en klik op de knop Paar toevoegen. De berekende eiwitmassa verschijnt.</li>
		<li>Kopieer en plak dit getal in het veld Mature Protein Mass en sluit het venster Protein Mass Calculator Tool.</li>
	</ol></li>
	<li>Selecteer een N-terminal signaalpeptidelengte door op het vak Residubeperking instellen te klikken. Er verschijnt een pop-up met een glijdende schaal en cursor. Verplaats de cursor naar de gewenste signaalpeptidelengte (maximaal 50). Als er geen signaalpeptidelengte is geselecteerd, wordt een onbeperkte sequentie-afkapping uitgevoerd door de software.</li>
	<li>Selecteer onder de Fragment Ion Condition in de GUI residuen voor polypeptide backbone cleavage (PBC). Klik op de vakjes van een of meer residuen: D, E, N en/of P.<ol>
<li>Klik op de knop Fragmentionen (+1) invoeren om te worden doorzocht. Er verschijnt een pop-upfragmentpagina. Klik vervolgens op de knop Fragmention toevoegen, wat overeenkomt met het aantal fragmentionen dat moet worden ingevoerd, d.w.z. één klik voor elk fragmention. Er verschijnt een vervolgkeuzelijst voor elk fragmention dat moet worden ingevoerd.</li>
		<li>Voer de m/z van de fragmentionen en de bijbehorende m/z-tolerantie in. Wanneer u klaar bent, klikt u op de knop Opslaan en sluiten. OPMERKING: Een redelijke m/z-tolerantie is ±1,5.</li>
		<li>Selecteer het minimum aantal fragmentionen dat moet worden gematcht voor een identificatie door naar het gewenste aantal te scrollen in het vak rechts van Hoeveel fragmentionen moeten worden gematcht. OPMERKING: Drie wedstrijden zouden voldoende moeten zijn.</li>
		<li>Selecteer cysteïneresiduen om in hun geoxideerde toestand te zijn door op de overeenkomstige cirkel te klikken. Als er na de zoekopdracht geen eiwitidentificaties worden gevonden, herhaalt u de zoekopdracht met cysteines in hun verminderde toestand. Als er na de zoekopdracht geen identificaties worden gevonden, verbreedt u de fragmentiontolerantie tot ±3 en herhaalt u de zoekopdracht.</li>
	</ol></li>
	<li>Klik onder Bestandsinstellingenop de knop FASTA-bestand selecteren om door het FASTA-bestand (tekst) te bladeren en te selecteren dat de in silico-eiwitsequenties bevat van de bacteriestam die eerder is geconstrueerd in protocolstappen 3.1 tot 3.2. Selecteer vervolgens een uitvoermap en maak een uitvoerbestandsnaam.</li>
	<li>Klik op de knop Zoekopdracht uitvoeren op bestandsvermeldingen. Er verschijnt een pop-upvenster met de titel Zoekparameters bevestigen (figuur 1,onderste paneel), waarin de zoekparameters worden weergegeven voordat de zoekopdracht wordt gestart.</li>
	<li>Als de zoekparameters correct zijn, klikt u op de knop Zoekopdracht starten. Als de zoekparameters niet correct zijn, klikt u op de knop Annuleren en voert u de juiste parameters opnieuw in. Zodra de zoekopdracht is gestart, wordt het parametervenster gesloten en verschijnt er een nieuw pop-upvenster met een voortgangsbalk(figuur 1,onderste paneel) met de voortgang van de zoekopdracht en een lopende telling van het aantal gevonden identificaties.</li>
	<li>Na voltooiing van de zoekopdracht (enkele seconden) wordt de voortgangsbalk automatisch gesloten en wordt een samenvatting van de zoekopdracht weergegeven in het veld Logboek van de GUI(Figuur 2,bovenpaneel). Daarnaast verschijnt er ook een nieuw pop-upvenster met de eiwitidentificatie(s) indien aanwezig(Figuur 2,onderste paneel). OPMERKING: In silico worden eiwitsequenties met niet-herkende residuen, bijvoorbeeld U of X, automatisch overgeslagen uit de analyse en deze sequenties worden vervolgens gerapporteerd met een apart pop-upvenster om de operator te waarschuwen over welke (eventuele) sequenties zijn overgeslagen na voltooiing van de zoekopdracht.</li>
</ol>5. Bevestiging van de eiwitsequentie na het zoeken
<ol><li>Bevestig de juistheid van een kandidaatvolgorde door handmatige analyse. OPMERKING: Het doel van de Protein Biomarker Seeker-software is om een eiwitsequentie met hoge nauwkeurigheid te identificeren door veel duidelijk onjuiste eiwitsequenties uit overweging te nemen en sequentieafkapping op te nemen als een mogelijke PTM in het volwassen eiwit. Omdat het aantal mogelijke geretourneerde kandidaatsequenties weinig is, is handmatige bevestiging beheersbaar.</li>
	<li>Genereer een tabel met de gemiddelde m/z van b- en y-type fragmentionen van de kandidaatsequentie met behulp van massaspectrometrie of proteomische software met dergelijke functionaliteit. Vergelijk de gemiddelde m/z van in silicofragmentionen aan de C-terminale zijde van D-, E- en N-residuen (en aan de N-terminale zijde van P-residuen) met de m/z van prominente fragmentionen uit de MS/MS-PSD-gegevens. OPMERKING: De meest prominente MS/MS-PSD-fragmentionen moeten gemakkelijk kunnen worden gematcht met D-, E- en N-geassocieerde silicofragmentionen. Het fragmentatiemechanisme van het asparaginezuureffect is echter minder efficiënt in de buurt van de N- of C-termini van een eiwitsequentie36.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Overwegingen bij het protocol De belangrijkste sterke punten van het huidige protocol zijn de snelheid, eenvoud van monstervoorbereiding en het gebruik van een instrument dat relatief eenvoudig te bedienen, te trainen en te onderhouden is. Hoewel bottom-up en top-down proteomische analyse door vloeistofchromatografie-ESI-HR-MS alomtegenwoordig zijn en in veel opzichten veel beter dan top-down door MALDI-TOF-TOF, vereisen ze meer tijd, arbeid en expertise. De complexiteit van instrumenten kan vaak van ...

Analyse en identificatie van onverteerde eiwitten door massaspectrometrie wordt de top-down proteomische analyse1,2,3, 4genoemd. Het is nu een gevestigde techniek die gebruik maakt van elektrospray ionisatie (ESI)5 en hoge resolutie massaanalysatoren6, en geavanceerde dissociatie technieken, bijvoorbeeld elektron overdracht dissociatie (ETD), elektronenvangst dissociatie (ECD)7, ultraviolette foto-dissociatie (UV-PD)8, enz.
De andere zachte ionisatietechniek is matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI)9,10,11 die minder uitgebreid is gebruikt voor de top-down analyse, deels omdat het voornamelijk is gekoppeld aan time-of-flight (TOF) massaanalysatoren, die een beperkte resolutie hebben in vergelijking met andere massaanalysatoren. Ondanks deze beperkingen zijn MALDI-TOF- en MALDI-TOF-TOF-instrumenten gebruikt voor de snelle top-down analyse van zuivere eiwitten en gefractioneerde en ongefractioneerde mengsels van eiwitten. Voor de identificatie van zuivere eiwitten is in-source decay (ISD) een bijzonder nuttige techniek omdat het massaspectrometrie (MS) analyse van ISD-fragmentionen mogelijk maakt, evenals tandem massaspectrometrie (MS / MS) van eiwitionfragmenten die sequentiespecifiek fragment leveren, vaak van de N- en C-termini van het doeleiwit, analoog aan Edman-sequencing12,13 . Een nadeel van de ISD-benadering is dat, net als bij Edman-sequencing, het monster slechts één eiwit mag bevatten. De enige eiwitbehoefte is te wijten aan de behoefte aan eenduidige toeschrijving van fragmentionen aan een voorloperion. Als er twee of meer eiwitten in een monster aanwezig zijn, kan het moeilijk zijn om toe te wijzen welke fragmentionen tot welke voorloperionen behoren.
Fragment ion/precursor ion attributie kan worden aangepakt met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Zoals bij elk klassiek MS/MS-experiment worden precursorionen massaal geselecteerd/geïsoleerd voorafgaand aan fragmentatie, en de gedetecteerde fragmentionen kunnen worden toegeschreven aan een specifiek voorloperion. De voor deze benadering beschikbare dissociatietechnieken zijn echter beperkt tot voornamelijk hoge-energie botsing-geïnduceerde dissociatie (HE-CID)14 of post-source decay (PSD)15,16. HE-CID en PSD zijn het meest effectief in het fragmenteren van peptiden en kleine eiwitten, en de sequentiedekking kan in sommige gevallen beperkt zijn. Bovendien resulteert PSD in polypeptide backbone cleavage (PBC) voornamelijk aan de C-terminale kant van asparagine- en glutaminezuurresiduen door een fenomeen dat het asparaginezuureffect wordt genoemd17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS heeft ook een nichetoepassing gevonden in de taxonomische identificatie van micro-organismen: bacteriën21,schimmels22en virussen23. MS-spectra worden bijvoorbeeld gebruikt om onbekende bacteriën te identificeren in vergelijking met een referentiebibliotheek van MS-spectra van bekende bacteriën met behulp van patroonherkenningsalgoritmen voor vergelijking. Deze aanpak is zeer succesvol gebleken vanwege de snelheid en eenvoud, hoewel het een nachtelijke kweek van het isolaat vereist. De eiwitionen die door deze benadering worden gedetecteerd (meestal minder dan 20 kDa) bestaan uit een MS-vingerafdruk die taxonomische resolutie mogelijk maakt op geslachts- en soortniveau en in sommige gevallen op de ondersoort24 en stamniveau25,26. Er blijft echter een noodzaak om niet alleen taxonomisch potentieel pathogene micro-organismen te classificeren, maar ook specifieke virulentiefactoren, toxines en antimicrobiële resistentie (AMR) factoren te identificeren. Om dit te bereiken, wordt de massa van peptiden, eiwitten of kleine moleculen gemeten door MS en vervolgens geïsoleerd en gefragmenteerd door MS / MS.
Pathogene bacteriën dragen vaak cirkelvormige stukjes DNA die plasmiden worden genoemd. Plasmiden, samen met profagen, zijn een belangrijke vector van horizontale genoverdracht tussen bacteriën en zijn verantwoordelijk voor de snelle verspreiding van antimicrobiële resistentie en andere virulentiefactoren over bacteriën. Plasmiden kunnen ook antibacteriële (AB) genen dragen, bijvoorbeeld colicine en bacteriocine. Wanneer deze genen tot expressie worden gebracht en de eiwitten worden uitgescheiden, werken ze om de eiwitvertalingsmachinerie van naburige bacteriën die dezelfde milieuniche bezetten uit te schakelen27. Deze bacteriedodende enzymen kunnen echter ook een risico vormen voor de gastheer die ze heeft geproduceerd. Als gevolg hiervan wordt een gen mede tot expressie gebracht door de gastheer dat specifiek de functie van een AB-enzym remt en wordt aangeduid als het immuniteitseiwit (Im).
DNA-beschadigende antibiotica zoals mitomycine-C en ciprofloxacine worden vaak gebruikt om de SOS-respons te induceren in Shiga-toxineproducerende E. coli (STEC) waarvan het Shiga-toxinegen(stx) wordt aangetroffen in een profaaggenoom dat aanwezig is in het bacteriële genoom28. We hebben eerder antibiotica-inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS en top-down proteomische analyse gebruikt om Stx-typen en subtypen geproduceerd door STEC-stammen29,30,31, 32te detecteren enteidentificeren. In het vorige werk werd STEC O113:H21 stam RM7788 's nachts gekweekt op agarmedia aangevuld met mitomycine-C. In plaats van de verwachte B-subeenheid van Stx2a bij m/z ~7816 te detecteren, werd echter een ander eiwition gedetecteerd bij m/z ~7839 en geïdentificeerd als een plasmide-gecodeerd hypothetisch eiwit met onbekende functie33. In het huidige werk identificeerden we twee plasmide-gecodeerde AB-Im-eiwitten geproduceerd door deze stam met behulp van antibiotische inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, en top-down proteomische analyse met behulp van stand-alone software die is ontwikkeld om silico-eiwitsequenties afgeleid van whole-genome sequencing (WGS) te verwerken en te scannen. Daarnaast werd de mogelijkheid van post-translation modifications (PTM) met sequentie-afkapping in de software opgenomen. De immuniteitseiwitten werden met behulp van deze software geïdentificeerd uit de gemeten massa van het volwassen eiwition en sequentiespecifieke fragmentionen van PBC veroorzaakt door het asparaginezuureffect en gedetecteerd door MS / MS-PSD. Ten slotte werd een promotor geïdentificeerd stroomopwaarts van de AB / Im-genen in een plasmide-genoom dat de expressie van deze genen kan verklaren wanneer deze stam wordt blootgesteld aan een DNA-beschadigend antibioticum. Delen van dit werk werden gepresenteerd op de National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 augustus 2020)34.

<table><tbody><tr><td>4000 Series Explorer software</td><td>AB Sciex</td><td>Versie 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-1</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 biohazard cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome-C</td><td>Sigma</td><td>C2867-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Data Explorer software</td><td>AB Sciex</td><td>Versie 4.9</td><td></td></tr><tr><td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td><td>G-Biosciences</td><td>786-231</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW software</td><td>Lighthouse Data</td><td>Versie 10.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>9120973</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L4919-1G</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-343</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin Plus Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620207</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0440-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Myoglobin</td><td>Sigma</td><td>M5696-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model 420</td><td></td></tr><tr><td>Sinapinic acid</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861580</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1 uL loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-595</td><td></td></tr><tr><td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td><td>Sigma</td><td>T0910-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537-100G</td><td></td></tr><tr><td>Water Optima LC/MS grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in escherichia coli met behulp van maldi-tof-tof-ms/ms en top-down proteomische analyse

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Dit protocol identificeert de immuniteitseiwitten van de bacteriedodende enzymen: colicine E3 en bacteriocine, geproduceerd door een pathogene Escherichia coli-stam met behulp van antibiotica-inductie, en geïdentificeerd door MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met software die intern is ontwikkeld. Het immuniteitseiwit colicine E3 (Im3) en het immuniteitseiwit van bacteriocine (Im-Bac) werden geïdentificeerd uit prominente b- en/of y-type fragmentionen gegenereerd door de polypeptide backbone cleavage (PBC) aan de C-terminale kant van asparaginezuur, glutaminezuur en asparagineresiduen door het fragmentatiemechanisme van het asparaginezuureffect. De software scant snel in silico-eiwitsequenties die zijn afgeleid van de hele genoomsequencing van de bacteriestam. De software verwijdert ook iteratief aminozuurresiduen van een eiwitsequentie in het geval dat de volwassen eiwitsequentie wordt afgekapt. Een enkele eiwitsequentie bezat massa- en fragmentionen die consistent waren met die gedetecteerd voor elk immuniteitseiwit. De kandidaatsequentie werd vervolgens handmatig geïnspecteerd om te bevestigen dat alle gedetecteerde fragmentionen konden worden toegewezen. De N-terminale methionine van Im3 werd post-translationeel verwijderd, terwijl Im-Bac de volledige sequentie had. Bovendien ontdekten we dat slechts twee of drie niet-complementaire fragmentionen gevormd door PBC nodig zijn om de juiste eiwitsequentie te identificeren. Ten slotte werd een promotor (SOS-box) geïdentificeerd vóór de antibacteriële en immuniteitsgenen in een plasmidegenoom van de bacteriestam.

Figuur 3 (bovenpaneel) toont de MS van STEC O113:H21 stam RM7788 's nachts gekweekt op LBA aangevuld met 400 ng/ml mitomycine-C. Pieken bij m/z 7276, 7337 en 7841 waren eerder geïdentificeerd als cold-shock protein C (CspC), cold-shock protein E (CspE) en een plasmide-borne protein met onbekende functie, respectievelijk33. Het eiwition bij m/z 9780 [M+H]+ werd geanalyseerd door MS/MS-PSD zoals weergegeven in figuur 3 (onderste ...

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Het protocol demonstreert een snelle methode voor de identificatie van bacteriële eiwitten met behulp van antibiotica-inductie en massaspectrometrie. Het grote voordeel van de techniek is de snelheid en eenvoud. Monstervoorbereiding is ongecompliceerd.De techniek kan worden uitgebreid tot de karakterisering van pathogene bacteriën, zoals virulentiefactoren of antibioticaresistentie om een geschikte behandeling voor een bacteriële infectie beter te informeren. Gebruik om te beginnen een steriele lus van één microliter om bacteriën te oogsten uit enkele kolonies die op LB-agarplaat worden gekweekt. En breng over op een twee milliliter O-ring ring lijn schroefdop microcentrifuge buis met 300 microliter HPLC-kwaliteit water.Draai vervolgens kort de buis en pellet de cellen door centrifugering, in een relikwiewater van 0,75 microliter van het monstersupernatant op het roestvrijstalen MALDI-doelwit, en laat het drogen. Overlay de gedroogde monstervlek met 0,75 microliter van een verzadigde oplossing van sinapinic acid bereid in 33% acetonitril, 67% water en 0,2% trifluoro-azijnzuur, en laat de vlek drogen. Zodra de vlek is gedroogd, laadt u het doelwit in de massaspectrometer.Open de acquisitiesoftware en klik op MS Linear Mode Acquisition Of mass-to-charge range en mass-to-charge van de onder- en bovengrenzen in hun respectievelijke velden. Klik op de monsterspot om te worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon. Druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de cursor over de voorbeeldvlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor een laserablatie of ionisatie.Laat de muisknop los om de acquisitie te starten en verzamel 1000 laserschoten voor elke monsterplek. Als er geen ionen worden gedetecteerd, verhoogt u de laserintensiteit door de glijdende schaalbalk onder laserintensiteit aan te passen totdat het eiwitionensignaal wordt gedetecteerd. Nadat u de MS Linear Mode Acquisition hebt voltooid, klikt u op de MS/MS Reflectron Mode Acquisition.Voer de te analyseren voorlopermassa in het veld Precursor Mass in. Voer vervolgens een isolatiebreedte in daltonen in het venster Precursor Mass in voor de lage en hoge massazijde van de voorlopermassa. Klik op de knop CID Uit.Klik vervolgens op de knop Metastable Suppressor On. Pas de laserintensiteit aan tot ten minste 90% van de maximale waarde door de glijdende schaalbalk aan te passen zoals gedemonstreerd. Klik op de monsterplek die moet worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon, druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de cursor over de monstervlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor laserablatie of ionisatie, laat de muisknop los om de acquisitie te starten en verzamel 10.000 laserfoto's voor elke monsterplek zoals gedemonstreerd.Dubbelklik op het uitvoerbare bestand Protein Biomarker Seeker en het venster van de grafische gebruikersinterface verschijnt. Voer de massa van de eiwitbiomarker in het veld Mature Protein Mass in en de massameetfout in het veld Mass Tolerance in. Klik optioneel op de knop Complimentary b/y ion Protein Mass Calculator om de eiwitmassa te berekenen uit een vermeende complementaire fragmentionenpaar en het pop-upvenster van de Protein Mass Calculator Tool verschijnt.Voer de verhouding tussen massa en lading van het vermeende complementaire fragmentionenpaar in, klik op de knop Paar toevoegen en de Calculator Protein Mass verschijnt. Kopieer deze waarde in het veld Mature Protein Mass en sluit het gereedschapsvenster Protein Mass Calculator. Klik op het vak Residubeperking instellen.Selecteer de peptidelengte van het eindterminaalsignaal en de pop-up met een glijdende schaal en cursor verschijnt en verplaatst de cursor naar de gewenste signaalpeptidelengte. Als de signaalpeptidelengte niet is geselecteerd, wordt een onbeperkte sequentie-afkapping uitgevoerd door de software. Selecteer onder de Fragment Ion Condition de Residues For Polypeptide Backbone Cleavage door op de vakjes van een of meer residuen, D-E-N en/of P. te klikken En klik vervolgens op de Enter Fragment Ions Plus One to be search knop, en de pop-up fragment pagina zal verschijnen.Klik vervolgens op de knop Fragmention toevoegen en er verschijnt een vervolgkeuzeveld voor elk fragmention dat moet worden ingevoerd. Voer de massa in op ladingsverhoudingen van de fragmentionen en de bijbehorende massa door ladingstolerantie. Klik vervolgens op de knop Opslaan en sluiten.Blader in het rechtervak van Hoeveel fragmentionen moeten worden gematcht om het minimumaantal fragmentionen te selecteren dat moet worden gematcht voor identificatie en selecteer de cysteïneresiduen in hun geoxideerde toestand. Als de eiwitten na de zoekopdracht niet worden geïdentificeerd, herhaalt u de zoekopdracht met cysteines in hun verminderde toestand. Klik onder Bestandsinstellingen op het pictogram FASTA-bestand selecteren om door het FASTA-bestand te bladeren en het TE SELECTEREN dat de in silico-eiwitsequenties van de eerder geconstrueerde bacteriestam bevat.Selecteer vervolgens een uitvoermap en maak een uitvoerbestandsnaam. Klik op het pictogram Zoekopdracht uitvoeren op bestandsvermeldingen. Er verschijnt een pop-upvenster met de titel Zoekparameters bevestigen waarin de zoekparameters worden weergegeven voordat de zoekopdracht wordt gestart.En als de zoekparameters correct zijn, klikt u op Zoekopdracht starten. Als de parameters onjuist zijn, klikt u op Annuleren en voert u de juiste parameters opnieuw in. Zodra de zoekopdracht is gestart, wordt het parametervenster gesloten en verschijnt er een nieuw pop-upvenster met een voortgangsbalk, met de voortgang van de zoekopdracht en een lopende telling van het aantal gevonden identificaties.Na voltooiing van de zoekopdracht wordt de voortgangsbalk automatisch gesloten en wordt een samenvatting van de zoekopdracht weergegeven in het logveld van de grafische gebruikersinterface, samen met een nieuw pop-upvenster met de gevonden eiwitidentificaties. In de huidige studie werden bacterieculturen gekweekt in LB met twee verschillende concentraties mytomycine-C. Het massaspectrum van bacteriekweek gekweekt met een mytomycine-C-concentratie.Cold shock protein C, cold shock protein E en een plasmide-borne protein met onbekende functie werden geïdentificeerd. Het onbekende eiwition op 9780 werd geanalyseerd door MS / MS, en het voorloperion werd geïsoleerd met een tijdionenselectievenster van ongeveer 100 dalton. Het fragmention bij massa om 9675,9 te laden is overloop van de dissociatie van het metastabieerbare eiwition bij 9655.De sequentie van het immuniteitseiwit voor colicine E3 bevat basisresidu mogelijke plaatsen van ionisatie. De fragmentionen gedetecteerd uit polypeptide backbone splitsing, wanneer de gereduceerde vorm van cysteïne werd gebruikt tijdens de zoektocht. De N-terminale methionine wordt verwijderd als een post-translatie modificatie.Toen de bacteriecultuur werd gekweekt met een hoge mytomycine-C-concentratie, werd het immuniteitseiwit van bacteriocine geïdentificeerd. De onbekende piek bij 9651 werd geanalyseerd door MS / MS en het voorloperion werd geïsoleerd met een smaller en asymmetrisch TIS-venster van minus 75 plus 60 dalton. De sequentie van het immuniteitseiwit van bacteriocine bevat basisresiduen mogelijke plaatsen van ionisatie.De fragmentionen gedetecteerd uit polypeptide backbone splitsing, wanneer de gereduceerde vorm van cysteïne werd gebruikt tijdens de zoektocht. met de verschillende concentraties antibiotica kan de relatieve eiwitrijkdom variëren. Deze werden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie.Let bij het oogsten van bacteriële cellen op koloniemorfologie en bacteriegroei met betrekking tot antibiotica en concentratie. Een lus van één microliter cellen is nodig om eiwitten te detecteren.

identification-antibacterial-immunity-proteins-escherichia-coli-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

De toepassing van matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF) massaspectrometrie (MS) rechtstreeks bloed kweekbouillon versnelt de identificatie van bacteriën. De onderhavige methode is een snelle en betrouwbare methode voor de identificatie van Gram-negatieve bacteriën direct uit bloed kweekbouillon.

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

Massa-spectrometrie gebaseerde phyloproteomics (MSPP) werd gebruikt om een verzameling van Campylobacter jejuni ssp typen. Doylei isoleert De stam in vergelijking met multilocus volgorde typen (MLST).

subtypering van<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP)

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de scheiding, identificatie en karakterisering van proteoforms in EiwitSteekproeven met behulp van capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS). Het protocol kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters.

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Dit protocol maakt een snelle, kosteneffectieve evaluatie van de microbiële samenstelling in zuivelproducten mogelijk door culturomics te combineren met MALDI-TOF MS. Het levert taxonomieresultaten die vergelijkbaar zijn met 16S rRNA-sequencing met een kortere doorlooptijd dan traditionele kweekmethoden.

Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

Leer een snelle methode voor identificatie van immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse. Deze aanpak versnelt onderzoek naar bacteriële afweermechanismen.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse (Video) | JoVE Journal

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Meer video's verkennen