Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Het protocol demonstreert een snelle methode voor de identificatie van bacteriële eiwitten met behulp van antibiotica-inductie en massaspectrometrie. Het grote voordeel van de techniek is de snelheid en eenvoud. Monstervoorbereiding is ongecompliceerd.

De techniek kan worden uitgebreid tot de karakterisering van pathogene bacteriën, zoals virulentiefactoren of antibioticaresistentie om een geschikte behandeling voor een bacteriële infectie beter te informeren. Gebruik om te beginnen een steriele lus van één microliter om bacteriën te oogsten uit enkele kolonies die op LB-agarplaat worden gekweekt. En breng over op een twee milliliter O-ring ring lijn schroefdop microcentrifuge buis met 300 microliter HPLC-kwaliteit water.

Draai vervolgens kort de buis en pellet de cellen door centrifugering, in een relikwiewater van 0,75 microliter van het monstersupernatant op het roestvrijstalen MALDI-doelwit, en laat het drogen. Overlay de gedroogde monstervlek met 0,75 microliter van een verzadigde oplossing van sinapinic acid bereid in 33% acetonitril, 67% water en 0,2% trifluoro-azijnzuur, en laat de vlek drogen. Zodra de vlek is gedroogd, laadt u het doelwit in de massaspectrometer.

Open de acquisitiesoftware en klik op MS Linear Mode Acquisition Of mass-to-charge range en mass-to-charge van de onder- en bovengrenzen in hun respectievelijke velden. Klik op de monsterspot om te worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon. Druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de cursor over de voorbeeldvlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor een laserablatie of ionisatie.

Laat de muisknop los om de acquisitie te starten en verzamel 1000 laserschoten voor elke monsterplek. Als er geen ionen worden gedetecteerd, verhoogt u de laserintensiteit door de glijdende schaalbalk onder laserintensiteit aan te passen totdat het eiwitionensignaal wordt gedetecteerd. Nadat u de MS Linear Mode Acquisition hebt voltooid, klikt u op de MS/MS Reflectron Mode Acquisition.

Voer de te analyseren voorlopermassa in het veld Precursor Mass in. Voer vervolgens een isolatiebreedte in daltonen in het venster Precursor Mass in voor de lage en hoge massazijde van de voorlopermassa. Klik op de knop CID Uit.

Klik vervolgens op de knop Metastable Suppressor On. Pas de laserintensiteit aan tot ten minste 90% van de maximale waarde door de glijdende schaalbalk aan te passen zoals gedemonstreerd. Klik op de monsterplek die moet worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon, druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de cursor over de monstervlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor laserablatie of ionisatie, laat de muisknop los om de acquisitie te starten en verzamel 10.000 laserfoto's voor elke monsterplek zoals gedemonstreerd.

Dubbelklik op het uitvoerbare bestand Protein Biomarker Seeker en het venster van de grafische gebruikersinterface verschijnt. Voer de massa van de eiwitbiomarker in het veld Mature Protein Mass in en de massameetfout in het veld Mass Tolerance in. Klik optioneel op de knop Complimentary b/y ion Protein Mass Calculator om de eiwitmassa te berekenen uit een vermeende complementaire fragmentionenpaar en het pop-upvenster van de Protein Mass Calculator Tool verschijnt.

Voer de verhouding tussen massa en lading van het vermeende complementaire fragmentionenpaar in, klik op de knop Paar toevoegen en de Calculator Protein Mass verschijnt. Kopieer deze waarde in het veld Mature Protein Mass en sluit het gereedschapsvenster Protein Mass Calculator. Klik op het vak Residubeperking instellen.

Selecteer de peptidelengte van het eindterminaalsignaal en de pop-up met een glijdende schaal en cursor verschijnt en verplaatst de cursor naar de gewenste signaalpeptidelengte. Als de signaalpeptidelengte niet is geselecteerd, wordt een onbeperkte sequentie-afkapping uitgevoerd door de software. Selecteer onder de Fragment Ion Condition de Residues For Polypeptide Backbone Cleavage door op de vakjes van een of meer residuen, D-E-N en/of P. te klikken En klik vervolgens op de Enter Fragment Ions Plus One to be search knop, en de pop-up fragment pagina zal verschijnen.

Klik vervolgens op de knop Fragmention toevoegen en er verschijnt een vervolgkeuzeveld voor elk fragmention dat moet worden ingevoerd. Voer de massa in op ladingsverhoudingen van de fragmentionen en de bijbehorende massa door ladingstolerantie. Klik vervolgens op de knop Opslaan en sluiten.

Blader in het rechtervak van Hoeveel fragmentionen moeten worden gematcht om het minimumaantal fragmentionen te selecteren dat moet worden gematcht voor identificatie en selecteer de cysteïneresiduen in hun geoxideerde toestand. Als de eiwitten na de zoekopdracht niet worden geïdentificeerd, herhaalt u de zoekopdracht met cysteines in hun verminderde toestand. Klik onder Bestandsinstellingen op het pictogram FASTA-bestand selecteren om door het FASTA-bestand te bladeren en het TE SELECTEREN dat de in silico-eiwitsequenties van de eerder geconstrueerde bacteriestam bevat.

Selecteer vervolgens een uitvoermap en maak een uitvoerbestandsnaam. Klik op het pictogram Zoekopdracht uitvoeren op bestandsvermeldingen. Er verschijnt een pop-upvenster met de titel Zoekparameters bevestigen waarin de zoekparameters worden weergegeven voordat de zoekopdracht wordt gestart.

En als de zoekparameters correct zijn, klikt u op Zoekopdracht starten. Als de parameters onjuist zijn, klikt u op Annuleren en voert u de juiste parameters opnieuw in. Zodra de zoekopdracht is gestart, wordt het parametervenster gesloten en verschijnt er een nieuw pop-upvenster met een voortgangsbalk, met de voortgang van de zoekopdracht en een lopende telling van het aantal gevonden identificaties.

Na voltooiing van de zoekopdracht wordt de voortgangsbalk automatisch gesloten en wordt een samenvatting van de zoekopdracht weergegeven in het logveld van de grafische gebruikersinterface, samen met een nieuw pop-upvenster met de gevonden eiwitidentificaties. In de huidige studie werden bacterieculturen gekweekt in LB met twee verschillende concentraties mytomycine-C. Het massaspectrum van bacteriekweek gekweekt met een mytomycine-C-concentratie.

Cold shock protein C, cold shock protein E en een plasmide-borne protein met onbekende functie werden geïdentificeerd. Het onbekende eiwition op 9780 werd geanalyseerd door MS / MS, en het voorloperion werd geïsoleerd met een tijdionenselectievenster van ongeveer 100 dalton. Het fragmention bij massa om 9675,9 te laden is overloop van de dissociatie van het metastabieerbare eiwition bij 9655.

De sequentie van het immuniteitseiwit voor colicine E3 bevat basisresidu mogelijke plaatsen van ionisatie. De fragmentionen gedetecteerd uit polypeptide backbone splitsing, wanneer de gereduceerde vorm van cysteïne werd gebruikt tijdens de zoektocht. De N-terminale methionine wordt verwijderd als een post-translatie modificatie.

Toen de bacteriecultuur werd gekweekt met een hoge mytomycine-C-concentratie, werd het immuniteitseiwit van bacteriocine geïdentificeerd. De onbekende piek bij 9651 werd geanalyseerd door MS / MS en het voorloperion werd geïsoleerd met een smaller en asymmetrisch TIS-venster van minus 75 plus 60 dalton. De sequentie van het immuniteitseiwit van bacteriocine bevat basisresiduen mogelijke plaatsen van ionisatie.

De fragmentionen gedetecteerd uit polypeptide backbone splitsing, wanneer de gereduceerde vorm van cysteïne werd gebruikt tijdens de zoektocht. met de verschillende concentraties antibiotica kan de relatieve eiwitrijkdom variëren. Deze werden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie.

Let bij het oogsten van bacteriële cellen op koloniemorfologie en bacteriegroei met betrekking tot antibiotica en concentratie. Een lus van één microliter cellen is nodig om eiwitten te detecteren.