Selectie van transporter-gerichte remmende nanobodies door solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie

Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt voor high-throughput screening en identificatie van remmende en niet-remmende nanobodies gericht op elektrogene transporters gereconstitueerd in proteoliposomen of aanwezig in membraanblaasjes. Het ontwerpen van transfertests kan in meerdere gevallen moeilijk zijn, vooral als gelabelde substraten niet beschikbaar zijn. Als dezelfde elektrofysiologie het mogelijk maakt om het effect van nanobodies op transport voor vrijwel elke elektrogene transporter te bestuderen, omdat SSM-elektrofysiologie geen gelabelde substraten vereist.

Nanobodies zijn onderzocht op hun gebruik in medische toepassingen. Deze techniek kan helpen bij het screenen van potentiële remmers gericht op specifieke elektrogene transporters van mensen of menselijke pathogenen. Neem om te beginnen 10 schone buizen en breng 10 milliliter van het niet-activerende solid-supported membraan, of SSM, buffer over in elke buis.

Om de activerende SSM-buffers voor te bereiden, voegt u het substraat toe aan de buizen met behulp van een reeks concentraties rond de verwachte halve maximale concentratie. Start de SSM-software en laat de machine automatisch initialiseren. Stel het opslagpad voor gegevens in.

Bevestig door op de knop OK te drukken. Selecteer het standaard initiële reinigingsprotocol in de workflowopties en klik op Uitvoeren. Monteer vervolgens de met proteoliposoom gecoate chip op de socket.

Beweeg de arm om de chip te vergrendelen. Omsluit de gemonteerde chip met de dop. Selecteer het programma CapCom in de workflow en laat het uitvoeren om de geleidbaarheid en capaciteit te bepalen.

Bevestig dat de geleidbaarheid lager is dan vijf nanosiemens en de capaciteit tussen 15 en 35 nanofarad voordat u deze voor de meting gebruikt. Breng de activerende oplossingen over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffer over in een reservoir en plaats deze naast de spaanhouder op de reservoirpositie aan de rechterkant.

Maak een protocol voor de workflow met behulp van een reeks niet-activerende, activerende en niet-activerende oplossingssequenties, of een BAB-reeks, in een lus die drie metingen uitvoert en naar de volgende activerende buffer voor alle 10 buffers gaat. Gebruik de standaardstroomsnelheid van 200 microliter per seconde met één seconde, één seconde, één seconde stroomtijden voor de BAB-sequentie en klikspel om de meting te starten. Sla het protocol op en laat de workflow uitvoeren door op de afspeelknop te klikken.

Voer vervolgens hetzelfde experiment uit met eiwitvrije liposomen. Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten en gebruik de functie voor piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer. Zet de piekstroom uit tegen de substraatconcentratie om het half maximale effect van de concentratie, of EC50, van het substraat via niet-lineaire regressie te bepalen.

Breng 50 milliliter van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis. Voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van vijf millimol en gebruik dit voor een positieve controlemeting. Breng 10 milliliter van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis.

Voeg substraat choline toe aan vijf millimolar en nanobody aan 500 nanomolaire eindconcentratie. Herhaal de stap voor elk nanolichaam om de activerende oplossingen voor te bereiden zoals gedemonstreerd. Start de SSM-machine en meet de capaciteit en geleidbaarheid van de met proteoliposoom gecoate chip, zoals eerder aangetoond.

Breng de activerende oplossing zonder nanobody over in een injectieflacon en plaats de buffer in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffer zonder nanobody over in een reservoir en plaats deze in de sondebemonsteraar. Herhaal dit proces vervolgens voor alle oplossingen die nanobodies bevatten met activerende en niet-activerende oplossing.

Maak een protocol voor de workflow met behulp van een BAB-reeks. Maak een lus die drie metingen van de BAB-sequentie uitvoert met behulp van buffers zonder nanobodies, twee metingen van de BAB-sequentie met buffers die een nanobody bevatten, 120 seconden vertragingstijd incubatie met het nanobody en drie metingen van de BAB-sequentie met buffers die het nanobody bevatten. Sla de workflow op en laat deze uitvoeren door op de afspeelknop te klikken.

Maak vervolgens een nieuw protocol voor de workflow met behulp van een BAB-sequentie en een lus van vijf metingen om het reversibel gebonden nanolichaam uit te spoelen. Sla de workflow op en laat deze uitvoeren door op de afspeelknop te klikken. Vergelijk de laatste piekstroom van de metingen met de initiële substraat-only meting.

Als de piekstroom de beginwaarde bereikt, is het nanolichaam met succes weggespoeld en zijn de begincondities hersteld. Anders herhaalt u de workflow of wijzigt u een nieuwe chip. Herhaal dit proces met behulp van afzonderlijke chips voor elk nanobody-scherm, of herhaal dit met meerdere nanobodies met dezelfde chip.

Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten. Vervolgens selecteert de software automatisch de functie voor piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer. Normaliseer de piekstroom en de aanwezigheid van het nanolichaam op basis van de voortschrijdende substraat-only meting.

Plot de piekstromen in het histogram en vergelijk de piekstromen van de substraat-only metingen met de piekstromen gemeten in de aanwezigheid van nanobodies om remmende nanobodies te identificeren. Breng 50 milliliter van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis en voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van vijf millimolar en gebruik dit als de activerende oplossing voor positieve controle. Voeg vijf milliliter van de niet-activerende oplossing toe aan acht schone buizen en voeg vervolgens substraat choline en remmend nanolichaam toe aan de buizen in concentraties in het verwachte IC50-bereik.

Voeg 10 milliliter van de niet-activerende oplossing toe aan de acht buizen en voeg remmend nanolichaam toe aan elke buis die overeenkomt met de niet-activeringsbuffer. Start de SSM-opstelling en meet de capaciteit en geleidbaarheid van de met proteoliposomen gecoate chip. Breng de activerende oplossing zonder nanobody over in een injectieflacon en plaats deze in de sondebemonsteraar.

Breng vervolgens de niet-activerende buffer zonder nanobody over in een reservoir en plaats deze op de reservoirpositie naast de chiphouder aan de rechterkant. Breng de activerende en niet-activerende oplossingen die nanobodies bevatten over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar. Maak een protocol voor de workflow met behulp van een BAB-reeks.

Voeg een lus toe om elke concentratie twee keer te meten, incubaleer gedurende 120 seconden en meet nog drie keer. Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten en selecteer de functie voor de piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer. Zet de piekstromen uit tegen de nanolichaamconcentratie om de IC50 te bepalen via niet-lineaire regressie.

Voor het bepalen van de substraatconcentratie die moet worden gebruikt tijdens een screening van nanobodies, werd elektrogeen transport gemeten onder verschillende substraatconcentraties om EC50 te bepalen. Een substraatconcentratie die overeenkomt met de verzadigingsomstandigheden, vijf millimolair, werd geselecteerd en constant gehouden in alle activerende buffers. Het effect van remmende nanobodies op elektrogeen transport werd gevisualiseerd uit de afname van de amplitude van piekstromen.

Na het uitvoeren van het wasprotocol om nanobody los te maken, werd een herstel van 80 tot 95% van de initiële piekstroomamplitude waargenomen. Bij het overschakelen van niet-activerende naar activerende omstandigheden werden geen significante artefactstromen geïntroduceerd door nanobodies die in deze buffers aanwezig waren. Na het selecteren van nanobodies met remmende eigenschappen werden de IC50-waarden voor individuele nanobodies bepaald.

Het is cruciaal om voldoende tijd te geven voor de kalibratie van de proteoliposomen op de chip met de buffer die het nanobody bevat. Omdat de binding omkeerbaar is, moet het nanobody aanwezig zijn in zowel activerende als niet-activerende buffers.