Chirurgie en monsterverwerking voor correlatieve beeldvorming van de muriene longklep

Dit protocol is belangrijk omdat het is ontworpen om vragen te beantwoorden over de structuurfunctie correleren van de muriene longklep, die over het algemeen lastig is vanwege de inherente heterogeniteit. De gecontroleerde fixatie en correlatieve beeldvorming werden gebruikt om de structuur op meerdere lengteschalen vast te leggen. Lokale beelden met hoge resolutie kunnen vervolgens worden teruggeplaatst naar de precieze anatomische locatie op de longklep.

De demonstranten van de procedure zijn Dr.Tai Yi, de directeur van microchirurgie in het Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde van het Nationwide Children's Hospital. Begin met het autoclaaf van de gereedschappen die nodig zijn voor de dissectie van de muis, waaronder fijne scharen, microforceps, microvasculaire klemmen, klemaanbrengende tangen, microneedlehouders, veerscharen en oprolmechanismen. Na het euthanaseren van een volwassen C57BL/6-muis, plaatst u deze in een dorsale ligfietspositie op een dienblad, zet u de ledematen vast met tape en voert u de thoracotomie uit.

Stel het hart bloot door overtollig vetweefsel en fascia te verwijderen, verwijder vervolgens het rechter atrium en doordrenk de linkerventrikel met zoutoplossing op kamertemperatuur. Verwijder het hele hart door de superieure vena cava, inferieure vena cava, longslagader en aorta te doorsnijden en snijd ongeveer twee millimeter boven de ventriculoatriale verbinding, die zal dienen als de buis voor druk. Verwijder de linker- en rechterventrikels om de kamers bloot te stellen aan atmosferische druk, zodat de longstamstructuur niet wordt beïnvloed door het verwijderen van de ventrikels.

Anastomose drukslang met de longslagader, waardoor ongeveer een millimeter afstand tussen de sinotubulaire verbinding en het einde van de slang overblijft om grote bewegingen van de folders en de longstam mogelijk te maken. Verhef het reservoir tot een analoge fysiologische druk en vul het met de zoutoplossing. Test het doorstroomsysteem om er zeker van te zijn dat er geen verstoppingen of luchtbellen zijn.

Bevestig een kraan aan de anastomosed longklep en zorg voor voldoende doorstroming door de slang door het uitstroomkanaal te schakelen. Zodra de stroom voldoende is, schakelt u de uitstroom naar de anastomosed longklep en zorgt u voor druk van de longstam die wordt geïdentificeerd door stamopgezette stand. Na bevestiging van de druk van de longstam, geleidelijk primaire fixatieve oplossing opnemen totdat 25% van de reservoircapaciteit van de zoutoplossing is gezuiverd.

Plaats een fixatief gedrenkt gaas over het weefselmonster om uitdroging te voorkomen. Doordrenkt het fixatief gedurende drie uur en vul het reservoir om een constante druk te behouden. Bewaar na perfusie de hartklep in de fixatieve oplossing bij vier graden Celsius tot gebruik gedurende maximaal een week.

Voor het kleuren, was het vaste hartklepmonster drie keer met koude 0,15 molaire cacodylaatbuffer gedurende vijf minuten en dompel de hartklep volledig onder in een oplossing van 1,5 kaliumferrocyanide, 0,15 molair cacodylaat, twee millimolylcalciumchloride en 2% osmiumtetroxide op ijs gedurende een uur. Was de monsters met dubbel gedestilleerd water op kamertemperatuur door ze vijf minuten in een buis te plaatsen met lichte agitatie. Na nog drie wasbeurten plaatst u het monster in gefilterde thiocarbohydrazideoplossing op kamertemperatuur.

Was het monster na 20 minuten driemaal met water, zoals eerder is aangetoond. Plaats vervolgens het monster in 2% osmiumtetroxide bij kamertemperatuur. Was het na 30 minuten drie keer gedurende vijf minuten met water en incubeer het monster 's nachts in 1% uranylacetaat bij vier graden Celsius.

Bereid ondertussen een oplossing van loodnitraat voor. Voer de volgende dag de wasstap drie keer uit zoals eerder is aangetoond en incubeer vervolgens het hartklepweefsel in lood aspartaatoplossing bij 60 graden Celsius gedurende 30 minuten. Was de monsters nog drie keer en voer vervolgens een seriële uitdrogingsbehandeling uit op de hartklepweefsels met vers bereide 20, 50, 70 en 90% ethanol op ijs gedurende elk vijf minuten, gevolgd door twee daaropvolgende behandelingen met 100% ethanol.

Na uitdroging verplaatst u de weefsels naar ijskoud aceton en plaatst u het vervolgens gedurende 10 minuten in verse aceton op kamertemperatuur. Maak voor inbedding het harsmengsel volgens de specificaties van de fabrikant. Plaats weefsels in volgende behandelingen van 25 tot 75, 50 tot 50 en 75 tot 25 hars tot acetonmengsel gedurende elk twee uur.

Plaats ten slotte de weefsels 's nachts in 100% hars. Leg de volgende dag weefsels in verse 100% hars. Breng na twee uur de weefsels over naar een inbeddingscapsule, voeg verse 100% hars toe en plaats het gedurende 48 uur in een oven van 60 graden Celsius om uit te harden.

De verwijderde anastomosed longslagader voor en na de toepassing van hydrostatische druk wordt hier getoond. De longstam distends radiaal aan te geven dat de longklep folders zijn in een gesloten configuratie. Microgecomputeerde tomografie bevestigde de bevestiging van de longklep.

De bijsluiters werden gesloten en de annulus was rond, terwijl verschillende gradaties van ontoereikende longklepdruk door fixatie of arteriële instorting werden waargenomen. Het micro CT-volume dat virtuele doorsneden weer geeft, was gecorreleerd met optische beelden om de snijrichting en locatie te bevestigen. SBF SEM-beelden met hoge resolutie werden genomen in een lokale regio in een bijsluiter wanneer het specimenblok zich op de gewenste locatie en oriëntatie bevond.

Gecorreleerde afbeeldingen tussen de micro CT-volumeweergave virtuele slice, lage resolutie en hoge resolutie SBF SEM-afbeeldingen worden hier weergegeven. In 3D-weergave van een gesegmenteerd gebied van de longklep kunnen extracellulaire componenten zoals endotheelcellen, valvulaire interstitiële cellen en extracellulaire vezels worden geïdentificeerd. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het uitvoeren van de druk kritiek is en ervoor zorgt dat de opbrengst zo hoog mogelijk is.