Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor

Dit protocol helpt u bij het identificeren van mutaties die optreden tijdens de reparatie van een dubbelstrengsbreuk geïnduceerd door single-guide RNA en CAS9. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een kosteneffectieve en robuuste manier is om mutaties op een specifieke genomische locus te detecteren. We gebruiken menselijke keratinocyten als voorbeeld, maar dit protocol kan worden aangepast aan elke transfecteerbare cellijn.

Taylor Bugbee, een niet-gegradueerde assistent van ons laboratorium, demonstreert dit protocol. Om te beginnen, kweek HFK LXSN- en HFK 8E6-cellen in platen van 10 centimeter bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide in een incubator met keratinocytenkweekmedia met menselijk keratinocytengroeisupplement en 1% penicilline streptomycine. Vervang de kweekmedia door drie milliliter trypsine-EDTA en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten.

Neutraliseer vervolgens de trypsine met een gelijk volume FBS-aangevulde media. Breng nu de cellen over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 maal G. Suspensiecellen opnieuw met 10 milliliter keratinocytenkweekmedia met menselijk keratinocytengroeisupplement en bepaal de concentratie van cellen met een hemocytometer.

Daarna zaaien twee platen elk voor HFK LXSN- en HFK 8E6-cellen in vier milliliter keratinocytenkweekmedia met menselijk keratinocytengroeisupplement en 1% penicilline streptomycine. Na het zaaien incubeer je de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in een couveuse. Vervang op de dag van transfectie de media door drie milliliter antibioticavrije aangevulde media en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius in een couveuse.

Om de cellen te transfecteren, verwarm transfectiereagentia tot kamertemperatuur en pipetteer ze voorzichtig voor gebruik. Plaats een geschikte hoeveelheid transfectiebuffer in twee steriele centrifugebuizen van 1,5 milliliter voor elke cellijn en label ze als buis één en neptransfectie, of buis twee. Voeg vervolgens twee microgram plasmide DNA-expressie, CAS9, single-guide, RNA-targeting human CD4 toe aan buis één en pipetteer voorzichtig om volledig te mengen.

Voeg een gelijk volume steriel water toe aan buis twee. Voeg een geschikte hoeveelheid van het transfectiereagens toe aan buis één met DNA-mengsel en de neptransfectie of buis twee. Meng ze met een pipet voorzichtig volledig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten om de complexen te vormen.

Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de plaat en schud de kweekplaat voorzichtig gedurende één minuut om het transfectiemengsel gelijkmatig te verdelen. Om de cellen door trypsinisatie te oogsten, vervangt u kweekmedia door één milliliter trypsine EDTA en incubeert u gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Neutraliseer vervolgens trypsine met een gelijk volume FBS-aangevulde media.

Breng voor elke celplaat de celsuspensie over in twee microcentrifugebuizen met gelijke aliquots en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 maal G. Na centrifugering suspensie de celkorrel opnieuw uit één buis in één milliliter PBS voor sequencing en in een andere buis, met ijskoude PBS voor immunoblot. Immunoblot-assay werd uitgevoerd om de CAS9-expressie in niet-getransfecteerde en getransfecteerde HFK-cellen te vergelijken.

De resultaten tonen aan dat niet-getransfecteerde en getransfecteerde HFK-cellen een vergelijkbare hoeveelheid CAS9 tot expressie brachten, wat aangeeft dat de transfectie-efficiëntie vergelijkbaar is tussen twee cellijnen. Immunofluorescentiemicroscopiebeelden van gefosforyleerd histon H2AX S139 in SgRNA/CAS9 getransfecteerde cellen en niet-getransfecteerde controle werden verkregen. De resultaten gaven aan dat twee dubbelstrengsbreuken werden geïnduceerd door CAS9 SgRNA.

Genomische variaties werden gegroepeerd naar soorten mutatiegebeurtenissen in HFK LXSN en HFK 8E6, waarbij elke groep genomische variaties en het totale aantal variaties werden vergeleken tussen HFK LXSN en HFK 8E6. De resultaten toonden aan dat 8E6 de genomische variaties binnen 200 kilobase rond de door CAS9 geïnduceerde dubbelstrengsbreuken verhoogt, wat aangeeft dat HPV 8E6 dubbelstrengs breukherstel dereguleert en de genomische instabiliteit verhoogt. Het doel van immunoblot is om de transfectie-efficiëntie te meten, waarmee rekening moet worden gehouden tijdens gegevensanalyse.

Naast transfectie-efficiëntie kan immunofluorescentiemicroscopie worden gebruikt om dubbelstrengsbreukinductie te bevestigen met fosfo-H2AX als marker. We gebruiken de bèta HPV 8E6 als voorbeeld. Deze techniek kan worden gebruikt om veranderingen in mutatiefrequentie of -type te detecteren die worden veroorzaakt door andere reagentia zoals kleine molecuulremmers.