Name: Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Leer optische pincetten om RNA-eiwitinteracties te bestuderen voor vertaalregulatie met behulp van confocale microscopie. Deze methode maakt real-time monitoring van bindingsgebeurtenissen en krachtmetingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Anuja Kibe en Jun. Prof. Redmond Smyth voor het kritisch beoordelen van het manuscript. Wij danken Tatyana Koch voor de deskundige technische bijstand. We bedanken Kristyna Pekarkova voor de hulp bij het opnemen van experimentele video's. Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door de Helmholtz Association en financiering van de European Research Council (ERC) Grant Nr. 948636 (to NC).

1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Kloon de interessante sequentie in de vector met de Lambda DNA-fragmenten, die dienen als de handvatsequenties (figuur 2)43,50.</li>
	<li>Genereer eerst een DNA-sjabloon voor daaropvolgende in vitro transcriptie via PCR (figuur 2B; reactie 1). Bij deze PCR-stap wordt de T7-promotor toegevoegd aan het 5'-uiteinde van het zintuig DNA-molecuul32,33,43,50. Stel de PCR-reactie in volgens tabel 1. Voer de PCR uit in aliquots van 50 μL met de juiste cycli in de thermocycler.</li>
	<li>Bereid de handgrepen voor door twee afzonderlijke PCR-reacties (tabel 1, figuur 2B; reactie 2 en 3). Genereer eerst de 5'-handgreep met PCR. Genereer vervolgens het 3'-handvat en label het tegelijkertijd met digoxigenine met behulp van een 5'-digoxigenine-gelabelde primer32,33,43,50.</li>
	<li>Zuiver na de PCR het DNA met behulp van silica spin kolommen.</li>
	<li>Voer de in vitro transcriptiereactie uit met behulp van T7 RNA polymerase (Tabel 2)32,33,43,50. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 2-4 uur, afhankelijk van de lengte van het RNA. Voeg vervolgens DNase I toe aan de reactie en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om het DNA-sjabloon te verteren. Zuiver het RNA met behulp van silica spin kolommen.</li>
	<li>Voeg tijdens de etiketteringsreactie van de 5'-handgreep (tabel 3) biotine-16-dUTP toe aan het 3'-uiteinde van het handvat door T4 DNA-polymerase38,50. Voer de reactie uit bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Zuiver daarna het DNA met behulp van silica spin kolommen. OPMERKING: Aangezien de 5'-handgreep aan het uiteinde van 3' moet worden gelabeld (figuur 2B), kan de etikettering niet worden uitgevoerd tijdens de PCR.</li>
	<li>Meng de bovengenoemde componenten - 5'-handvat (3'gelabeld met biotine), 3' handvat (5' gelabeld met digoxigenine) en RNA - in een molaire verhouding van 1:1:1 in gloeibuffer (80% formamide, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), om de gewenste RNA/DNA-hybride te verkrijgen (tabel 4). Verwarm het gloeimengsel gedurende 10 minuten tot 85 °C en koel vervolgens langzaam af tot 4 °C.</li>
	<li>Meng het gegloeide monster met 1/10 volume van 3 M natriumacetaat (pH 5), 3 volumes ijskoude ethanol en incubeer bij -80 °C gedurende ten minste 1 uur of bij -20 °C gedurende één nacht.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Gooi het bovennatuurlijke middel weg en droog de pellet (meestal niet zichtbaar) onder vacuüm.</li>
	<li>Tot slot resuspend, de pellet in 50 μL RNase-vrij water en maak aliquots. Bewaar de aliquots bij -80 °C tot ze gebruikt zijn. Voor opslag op korte termijn kunnen de monsters ook bij -20 °C worden bewaard.</li>
</ol>2. Instrument instellen
OPMERKING: Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het commerciële optische pincetinstrument C-Trap van LUMICKS company. Daarom kunnen aanpassingen aan de gepresenteerde stappen nodig zijn tijdens het gebruik van andere optische pincetten. Indien niet gebruikt, wordt het microfluïdicasysteem van de machine bewaard in bleekmiddel (natriumhypochlorietoplossing) en moet het vóór gebruik worden gewassen.
<ol><li>Gooi het bleekmiddel weg en vul de spuiten met 1 ml RNase-vrij water.</li>
	<li>Voeg 50 μL 0,5 M natriumthiosulfaat toe aan ten minste 1 ml RNase-vrij water en was het systeem grondig (1 bar, ten minste 0,5 ml) om het resterende bleekmiddel in het systeem te verwijderen.</li>
	<li>Gooi de natriumthiosulfaatoplossing uit de spuiten weg. Vervang spuiten door nieuwe en was het systeem met ten minste 0,5 ml RNase-vrij water. OPMERKING: Wees voorzichtig dat het microfluïdicasysteem nooit droogvalt om luchtbellen in het systeem te voorkomen.</li>
	<li>Leg 2 druppels dompelolie (brekingsindex van 1,33) of ongeveer 70 μL water bovenop het objectief.</li>
	<li>Plaats de stroomcel in het houderframe op zijn plaats.</li>
	<li>Leg 2 druppels dompelolie (brekingsindex van 1,51) op de stroomcel.</li>
	<li>Schakel het laserapparaat in het pincet in. Zodra het actief is, schakelt u de overvullaser in de software-interface op 100% in.</li>
	<li>Stel met behulp van diagnosecamera's (Z-finder) de Z-as in het midden van de kamer tussen de tweede en de derde reflecties (interfaces) waar de brekingsringen het grootst zijn, door aan de microschroef te draaien. OPMERKING: Telkens wanneer het objectief dichter bij de meetkamer wordt geplaatst en het brandpuntsvlak van het objectief het raakvlak tussen twee fasen kruist, kan een reflectie worden herkend in de Z-finder-modus. Er zijn 4 interfaces mogelijk: (i) water/dompelolie en bodemglas (ii) bodemglas en buffer in de kamer (iii) buffer in de kamer en bovenglas (iv) bovenglas en dompelolie voor condensor.</li>
	<li>Stel de condensorpositie in (stel de vanglaser in op ongeveer 50%), zodat de condensor de dompelolie bovenop de meetkamer raakt.</li>
	<li>Pas de scherpstelling aan door langzaam naar beneden/omhoog te bewegen met de condensor, zodat er in de maanmodus ca. 10 lichtbanden worden getoond (diagnosecamera's).</li>
</ol>3. Monstermeting
<ol><li>Incubeer anti-digoxigenine-gecoate kralen (AD) met de monsterconstructies (3 μL van 0,1% (w/v) AD-kralsuspensie + 4 μL monster) en met 1 μL RNase-remmers en 8 μL van de testbuffer (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) bij RT gedurende 10-20 min. Verdun het monster na de incubatie in 500 μL testbuffer. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om zuurstofvangers, met name tijdens fluorescentiemetingen, aan de buffer toe te voegen om oxidatieve schade te voorkomen. Hier werd een zuurstofafvoersysteem gebruikt dat glucose (8,3 mg / ml), glucoseoxidase (40 E / ml) en catalase (185 U / ml) bevatte.</li>
	<li>Meng 0,8 μL van 1% (w/v) streptavidin-gecoate (SA) kralen met 1 ml assaybuffer.</li>
	<li>Gooi water uit de spuiten weg en vul de spuiten met de respectievelijke suspensies/oplossingen. Was minstens 2 minuten op ongeveer 1 bar en begin dan met het vangen van kralen. OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele opstelling kunnen verschillende kanaalopstellingen worden gebruikt (figuur 3). Meestal is één stroomkanaal gevuld met anti-digoxigenineparels die het RNA-molecuul dragen. Een tweede kanaal is gevuld met de streptavidin-gecoate kralen. Bufferkanaal wordt gebruikt om de tethers te vormen. Een vierde kanaal kan worden gebruikt om het RNA-bindende eiwit te laden (figuur 3C), of als alternatief kan RBP direct in het bufferkanaal worden toegevoegd (figuur 3B).</li>
	<li>Om de kralen vast te leggen, verplaatst u de optische vallen uit elkaar. Ga eerst naar het AD-kanaal en vang een AD-kraal in val 1. Verplaats vervolgens het werkgebied naar het SA-kanaal en vang een enkele SA-kraal met val 2. OPMERKING: Probeer op de interface van de buffer- en kralenkanalen te blijven om te voorkomen dat u de reeds gevangen kraal verliest of om te voorkomen dat u meerdere kralen vangt door dezelfde val.</li>
	<li>Zodra de kralen van de juiste grootte zijn opgevangen, gaat u naar het bufferkanaal en stopt u de laminaire stroom. Voer vervolgens krachtkalibratie uit om de stijfheid van de val te controleren. De respectieve stijfheidswaarden mogen in de x/y-as niet meer dan 10-15% verschillen. OPMERKING: Pas het laservermogen of de lasersplitsing tussen de vallen aan op basis van de grootte van de kraal. Krachtkalibratie hoeft niet voor elk kralenpaar te worden uitgevoerd zolang de kraalsjablonen overeenkomen (gelijkenisscore > 0,9). Het moet echter regelmatig worden uitgevoerd, of op zijn minst elke keer dat de testomstandigheden worden gewijzigd.</li>
	<li>Begin met vissen naar een tether door de kralen dicht bij elkaar te bewegen, een paar seconden te wachten en ze vervolgens weer uit elkaar te bewegen, herhaal totdat er een tether is gevormd. Een tetherformatie resulteert in een toename van de gemeten kracht bij het van elkaar wegtrekken van de twee kralen. OPMERKING: Om de vorming van meerdere tethers te voorkomen, mogen de kralen niet te dicht worden verplaatst. Bij het vangen van een tether tussen de twee kralen, kan de tetherkwaliteit worden gecontroleerd door het overstretching plateau te vinden. Het plateau moet tussen de 50 en 60 pN zijn voor een enkele tether.</li>
	<li>Na het verkrijgen van een tether, start u de meting. Afhankelijk van het bestudeerde fenomeen moeten verschillende meetopstellingen worden gekozen (figuur 1B-D). OPMERKING: Meestal wordt aan het begin van het experiment een force-ramp-experiment uitgevoerd om de tetherkwaliteit te controleren en het gedrag te onderzoeken. Daarna kan men ook beginnen met de experimenten met constante kracht of constante positie om de toestandsovergangen verder te bestuderen. Zodra er voldoende metingen zijn uitgevoerd op een RNA-monster om het gedrag ervan te bepalen, kunnen gelabelde factoren aan het systeem worden toegevoegd om confocale metingen uit te voeren.</li>
	<li>Om fluorescentiemetingen uit te voeren, schakelt u de confocale lasers en fotonentellereenheid in het optische pincet in.</li>
	<li>Schakel de excitatielaser van de gewenste golflengte in de software-interface in en stel het vermogen van de laser in op 5% of hoger, afhankelijk van de fluorofoor. OPMERKING: Verlaag, terwijl u niet meet, verlaagt u de vermogensinstelling van de excitatielaser tot 0% om overmatige fotoschade aan het monster te voorkomen.</li>
	<li>Begin met het in beeld brengen van het monster met behulp van de beeldfuncties van de software. OPMERKING: Om goed gefocuste beelden te krijgen, moeten het brandpuntsvlak van de confocale microscoop en optische vallen worden uitgelijnd. Hiervoor kan autofluorescentie van de polystyreenparels in het blauwe laserkanaal worden gebruikt. Het brandpuntsvlak van optische vallen wordt omhoog of omlaag bewogen in de z-as totdat het beeld van kralen zijn hoogste diameter bereikt. Op deze positie kan het fluorescentiesignaal van het molecuul dat tussen de kralen is vastgebonden, worden gemeten.</li>
	<li>Als u de kymograaffunctie wilt gebruiken, geeft u de x-y-positie van de kymograafas op, zodat de tether tussen de kralen kan worden gedetecteerd.</li>
	<li>Gedurende de meting kan de buffersamenstelling eenvoudig worden gewijzigd door de kralen naar verschillende kanalen te verplaatsen of door de buffer in het microfluïdicasysteem te veranderen.</li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>Voorbewerking van onbewerkte gegevens<ol>
<li>Door een eenvoudig script te gebruiken, kunt u de onbewerkte gegevens voldoende downsamplen om (i) een snellere daaropvolgende gegevensverwerking mogelijk te maken, maar (ii) nog steeds alle kritieke informatie te bevatten (figuur 4A). Meestal is 100-5000 Hz geschikt voor dit doel. OPMERKING: De frequentie voor het verzamelen van gegevens in experimenten met optische pincetten is vaak hoger dan nodig is voor de analyse - in de gepresenteerde experimenten is de frequentie voor het verzamelen van gegevens standaard ingesteld op 78 125 Hz. Omdat de opslagruimte beperkt is, is het handig en tijdbesparend om de bemonsteringsfrequentie van de gegevens te verminderen. Hier werden de ruwe gegevens met een factor 30 gedownsampled.</li>
		<li>Gebruik vervolgens een signaalfilter om de hoogfrequente meetruis van het signaal te verminderen (figuur 4A). Pas de parameters van de filtergraad en de afkapfrequentie dienovereenkomstig aan om de gegevensuitvoer van verschillende experimenten te optimaliseren (figuur 5). OPMERKING: Onder de signaalfilters is Butterworth filter51 een van de meest gebruikte. Een op maat geschreven python-script dat de voorverwerking van onbewerkte gegevens mogelijk maakt, wordt verstrekt in de aanvullende gegevens. Downsampling- en signaalfilterparameters (afkapfrequentie, filtergraad) moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende experimenten.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de volgende stappen uit voor de analyse van force-rampgegevens.<ol>
<li>Markeer de stappen handmatig door overeenkomstige punten op de krachttrajectplot te vinden of door aangepaste scripts te gebruiken. Ontvouwende stappen worden gekenmerkt door een plotselinge daling van de kracht in combinatie met een toename van de afstand in de kracht-afstand (FD) curve.</li>
		<li>Zodra ontvouwende gebeurtenissen zijn gemarkeerd, past u verschillende gebieden van de FD-curve aan met behulp van geschikte modellen (figuur 4D). OPMERKING: Voor het gebied vóór de eerste ontvouwende stap kan de tether als "dubbelstrengs" worden beschouwd en wordt deze gewoonlijk geschikt met behulp van een uitbreidbaar Worm-like-chain-model (WLC) 47,52,53. De delen na de eerste ontvouwende gebeurtenis worden beschouwd als een combinatie van dubbelstrengs nucleotiden (handvatten) en enkelstrengs nucleotiden (ongevouwen RNA-molecuul). Daarom is datafitting complexer - meestal wordt een combinatie van 2 WLC-modellen of WLC- en Free-jointed chain (FJC) -modellen gebruikt36,39,52. Het uitbreidbare WLC-model heeft twee belangrijke pasvormparameters: contourlengte (LC) en de persistentielengte (LP). Contourlengte komt overeen met de lengte van het volledig uitgerekte molecuul en persistentielengte definieert de buigeigenschappen van het betreffende molecuul. Het model kan worden beschreven met de volgende vergelijking (1). WLC kan worden gebruikt om het gedrag van zowel gevouwen als uitgevouwen gebieden te modelleren, hoewel voor elk van deze een afzonderlijk model met verschillende parameters moet worden gebruikt. (1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg"> waarbij x extensie is, LC contourlengte, F kracht, LP persistentielengte, kB Boltzmannconstante, T thermodynamische temperatuur en S rekmodulus. Het tweede model genaamd Freely-jointed chain (FJC) wordt vaak gebruikt om het gedrag van ongevouwen enkelstrengsregio's te beschrijven. Het gebruikt vergelijkbare parameters van de polymeren, maar behandelt elke eenheid van de "keten" als een stijve staaf, hier overeenkomend met de nucleotiden van het ontvouwde enkelstrengsgebied. De volgende vergelijking (2) beschrijft dit model: (2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg"> OPMERKING: Ons lab heeft onlangs een algoritme ontwikkeld dat batchverwerking van de ruwe force-ramp-gegevens mogelijk maakt, genaamd "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54." Het algoritme downsamples en filtert de gegevens, identificeert vervolgens mogelijke ontvouwende stappen en voert ten slotte gegevensaanpassing uit. De POTATO is gebouwd in een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).</li>
	</ol></li>
	<li>Verwerk gegevens met constante kracht als volgt: OPMERKING: De volgende instructies kunnen analoog worden toegepast op gegevens met een constante positie.<ol>
<li>Voor de gegevens over de constante kracht plot u de afstand in de tijd (figuur 5). Een histogram dat de frequentie (tellingen) van verschillende conformaties over de relatieve positieverandering weergeeft, is een nuttige manier om verschillende dominante en secundaire toestanden te karakteriseren (figuur 7).</li>
		<li>Monteer het histogram met behulp van (meerdere) Gaussische functies om het totale percentage individuele conformers bij een bepaalde kracht te schatten (figuur 7C). De Gaussische pasvorm, gemiddelde positie en de standaarddeviatie schetst de krachtgerelateerde relatie tussen verschillende populaties. OPMERKING: Een op maat geschreven python-script dat voorbewerking en basis bimodale Gaussiaanse aanpassing van constante krachtgegevens mogelijk maakt, wordt verstrekt in de aanvullende gegevens. Parameters (afkapfrequentie, filtergraad, verwachte gemiddelden, standaarddeviatiewaarden en amplitudes) moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende experimenten.</li>
		<li>Gebruik vervolgens het Hidden Markov-model om de toestanden verder te analyseren, wat extra vouwtussenproducten (conformers) kan blootleggen55. Voor meer informatie over het constante kracht en Hidden Markov model kan men verwijzen naar 55,56,57,58.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier demonstreren we het gebruik van fluorescentie-gekoppelde optische pincetten om interacties en dynamisch gedrag van RNA-moleculen met verschillende liganden te bestuderen. Hieronder worden kritische stappen en beperkingen van de huidige techniek besproken.
Kritieke stappen in het protocol Zoals voor veel andere methoden is de kwaliteit van het monster van cruciaal belang om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Daarom, om monsters van de hoogst mogelijke kwaliteit te verk...

Overdracht van genetische informatie van DNA naar eiwitten via mRNA's is een complex biochemisch proces, dat op alle niveaus nauwkeurig wordt gereguleerd door macromoleculaire interacties in cellen. Voor translationele regulatie spelen RNA-eiwitinteracties een cruciale rol om snel te reageren op verschillende stimuli en signalen1,2. Sommige RNA-eiwitinteracties beïnvloeden de mRNA-stabiliteit en veranderen daardoor de tijd dat een RNA translatief actief is. Andere RNA-eiwitinteracties zijn geassocieerd met hercoderingsmechanismen zoals stop-codon readthrough, bypassing of geprogrammeerde ribosomale frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Onlangs is aangetoond dat een aantal RNA-bindende eiwitten (RBP's) interageren met stimulerende mRNA-elementen en de translatiemachinerie om te bepalen wanneer en hoeveel hercodering in de cel zal plaatsvinden7,8,9,10,11. Dus, om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om de interactieprincipes en mechanische eigenschappen van deze RNA-eiwitcomplexen in detail te bestuderen.
Tientallen jaren werk hebben de basis gelegd voor het bestuderen van het meerstaps- en meercomponentenproces van vertaling, dat afhankelijk is van ingewikkelde communicatie tussen het RNA en eiwitcomponenten van de vertaalmachinerie om snelheid en nauwkeurigheid te bereiken12,13,14. Een cruciale volgende stap in het begrijpen van complexe regulerende gebeurtenissen is het bepalen van de krachten, tijdschalen en structurele determinanten tijdens translatie met hoge precisie12,15,16,17. De studie van RNA-conformatiedynamica en vooral hoe trans-acterende hulpfactoren tijdens translatie op de RNA-structuur inwerken, is verder verlicht door de opkomst van hulpmiddelen met één molecuul, waaronder optische pincetten of nulmodusgolfgeleiders16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optische pincetten (OT) vertegenwoordigen een zeer nauwkeurige single-molecule techniek, die is toegepast om vele soorten RNA-afhankelijke dynamische processen te bestuderen, waaronder transcriptie, en translatie26,27,28,29,30,31,32. Het gebruik van een optisch pincet heeft het mogelijk gemaakt om moleculaire interacties, nucleïnezuurstructuren en thermodynamische eigenschappen, kinetiek en energetica van deze processen in detail te onderzoeken16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optische pincet assay is gebaseerd op de beknelling van microscopische objecten met een gerichte laserstraal. In een typisch OT-experiment wordt het betreffende molecuul vastgebonden tussen twee transparante (meestal polystyreen) kralen (figuur 1A)27. Deze kralen worden vervolgens gevangen door optische vallen, die zich gedragen als veren. De kracht die op het molecuul wordt uitgeoefend, kan dus worden berekend op basis van de verplaatsing van de kraal uit het midden van de gerichte laserstraal (valcentrum). Onlangs is een optisch pincet gecombineerd met confocale microscopie (figuur 1B), waardoor fluorescentie- of Förster resonantie-energieoverdracht (FRET)-metingen40,41,42 mogelijk zijn. Dit opent een heel nieuw veld van mogelijke experimenten die gelijktijdige meting en dus nauwkeurige correlatie van krachtspectroscopie en fluorescentiegegevens mogelijk maken.
Hier demonstreren we experimenten met behulp van het optische pincet in combinatie met confocale microscopie om eiwit-RNA-interacties te bestuderen die translationele frameshifting reguleren. Tussen het objectief en de condensor maakt een stroomcel met vijf kanalen een continue monstertoepassing met laminaire stroming mogelijk. Via de microfluïdische kanalen kunnen verschillende componenten direct worden geïnjecteerd, wat de hands-on tijd vermindert en zeer weinig monsterverbruik tijdens het experiment mogelijk maakt.
Eerst wordt een basisrichtlijn voorgesteld om het ontwerp van OT-experimenten te ondersteunen en worden voordelen en valkuilen van verschillende opstellingen besproken. Vervolgens wordt de voorbereiding van monsters en experimentele workflows beschreven en wordt een protocol voor de data-analyse verstrekt. Om een voorbeeld te geven, schetsen we de resultaten verkregen van RNA-stretching-experimenten om het SARS-CoV-2 frameshifting RNA-element (figuur 2A) te bestuderen met de trans-acterende factor de korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit (ZAP), dat de vertaling van het virale RNA van een alternatief leesframe verandert43. Bovendien is aangetoond dat fluorescentie-gelabelde ribosomen kunnen worden gebruikt in deze OT confocale assay, wat nuttig zou zijn om de processiviteit en snelheid van de vertaalmachinerie te controleren. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om snel het effect van verschillende buffers, liganden of andere cellulaire componenten te testen om verschillende aspecten van translatie te bestuderen. Tot slot worden veelvoorkomende experimentele valkuilen besproken en hoe deze op te lossen. Hieronder worden enkele cruciale punten in experimenteel ontwerp geschetst.
Ontwerp construeren In principe zijn er twee gangbare benaderingen om een OT-compatibel RNA-construct te maken. De eerste benadering maakt gebruik van een lang RNA-molecuul dat is gehybridiseerd met complementaire DNA-handvatten, waardoor een construct ontstaat dat bestaat uit twee RNA / DNA-hybride regio's die een enkelstrengs RNA-sequentie in het midden flankeren (figuur 2B). Deze aanpak wordt gebruikt in de meeste OT RNA-experimenten33,44,45.
De tweede benadering maakt gebruik van dsDNA-handgrepen met korte (ongeveer 20 nt) overhangen15,17. Deze overhangen worden vervolgens gehybridiseerd met het RNA-molecuul. Hoewel ingewikkelder in ontwerp, overwint het gebruik van dsDNA-handles enkele beperkingen van het DNA / RNA-hybride systeem. In principe kunnen zelfs zeer lange handgrepen (>10kb) worden geïmplementeerd, wat handiger is voor confocale metingen. Bovendien kan het RNA-molecuul worden geligeerd aan DNA-handvatten om de stabiliteit van de tether te vergroten.
End-labeling strategie Het construct moet via een sterke moleculaire interactie aan kralen worden vastgemaakt. Hoewel er benaderingen beschikbaar zijn voor covalente binding van handvatten aan kralen46, worden sterke maar niet-covalente interacties zoals streptavidin-biotine en digoxigenine-antilichaam vaak gebruikt in OT-experimenten15,33,35,45. In het beschreven protocol wordt het construct gelabeld met biotine of digoxigenine en zijn de kralen gecoat met respectievelijk streptavidin of antilichamen tegen digoxigenine (figuur 1A). Deze aanpak zou geschikt zijn voor het toepassen van krachten tot ongeveer 60 pN (per tether)47. Bovendien maakt het gebruik van verschillende 5'- en 3'-etiketteringsstrategieën het mogelijk om de oriëntatie van de tussen de kralen gevormde ketting te bepalen17.
Eiwitetikettering voor fluorescentiemetingen Voor de confocale beeldvorming zijn er verschillende veelgebruikte benaderingen voor fluorescentie-etikettering. Fluoroforen kunnen bijvoorbeeld covalent worden gehecht aan aminozuurresiduen die inheems in eiwitten worden aangetroffen of door plaatsgerichte mutagenese via een reactieve organische groep worden geïntroduceerd. Thiol of amine-reactieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het etiketteren van respectievelijk cysteïne- en lysineresiduen. Er zijn verschillende omkeerbare beschermingsmethoden om de specificiteit van etikettering te vergroten48,49, maar inheemse eiwitten worden meestal gelabeld op meerdere residuen. Hoewel de kleine omvang van de fluorofoor een voordeel kan bieden, kan niet-specifieke etikettering de eiwitactiviteit verstoren en dus de signaalintensiteit variëren49. Afhankelijk van de etikettering kan de intensiteit van het efficiëntiesignaal ook verschillen tussen verschillende experimenten. Daarom moet voorafgaand aan het experiment een activiteitencontrole worden uitgevoerd.
In het geval dat het eiwit van belang een N- of C-terminale tag bevat, zoals een His-tag of streptokokkentag, vertegenwoordigt specifieke etikettering van deze tags een andere populaire benadering. Bovendien vermindert tag-gerichte etikettering de kans dat de fluorofoor de eiwitactiviteit verstoort en kan de oplosbaarheid verbeteren49. Tag-specifieke etikettering levert echter meestal mono-fluorofoor gelabelde eiwitten op, die een uitdaging kunnen zijn om te detecteren. Een andere manier van specifieke etikettering kan worden bereikt door antilichamen te gebruiken.
Microfluïdica-installatie De combinatie van OT met een microfluïdicasysteem maakt een snelle overgang tussen verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Bovendien maken de huidige systemen gebruik van het behoud van de laminaire stroming in de stroomcel, waardoor het mengen van vloeistoffen uit andere kanalen in de loodrechte richting ten opzichte van de stroomrichting wordt uitgesloten. Daarom is laminaire stroming bijzonder voordelig voor het experimentele ontwerp. Momenteel worden vaak flowcellen met maximaal 5 kanalen gebruikt (figuur 3).

<table><tbody><tr><td>Bacteriestammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HB101</td><td>lab collectie</td><td>N/A</td><td>klonen van de vectoren</td></tr><tr><td>Chemie en enzymen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>Biotinylering</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Zuurstof opvangsysteem</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>DNAse I uit bovien pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814320001</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>Zuurstof opvangsysteem</td></tr><tr><td>Glucose-oxidase</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Zuurstof opvangsysteem</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN78.3</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Phusion DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Gibson-assemblage, klonen</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Merck</td><td>529552-1KG</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Pyrofosfatase, thermostabiel, anorganisch</td><td>NEB</td><td>M0296L</td><td>in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Molox</td><td>1000379515</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>life technologies</td><td>R0481</td><td>in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>Natriumthiosulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>Bleek deactivering</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>confocale metingen</td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>Biotinylering</td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Gibson-assemblage, klonen</td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Geproduceerd in-house</td><td>N/A</td><td>in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq ligase</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Gibson-assemblage, klonen</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2e Generatie (Amine Reactief)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-L011</td><td>Gebruikt voor ribosome labeling</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>Ribosomen gebruikt voor de labeling</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' handle T7 voorwaarts</td><td>Microsynth</td><td>op bestelling</td><td>5&rsquo; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3&rsquo;, gebruikt om OT in vitro transcriptie template in PCR 1 te genereren</td></tr><tr><td>3&rsquo; handle achterwaarts</td><td>Microsynth</td><td>op bestelling</td><td>5' -&nbsp; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', gebruikt om OT in vitro transcriptie template in PCR 1 te genereren</td></tr><tr><td>5' handle voorwaarts</td><td>Microsynth</td><td>op bestelling</td><td>5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3', gebruikt om 5' handle in PCR 2 te genereren</td></tr><tr><td>5&rsquo; handle achterwaarts</td><td>Microsynth</td><td>op bestelling</td><td>5&rsquo; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&rsquo;, gebruikt om 5' handle in PCR 2 te genereren</td></tr><tr><td>3&rsquo; handle voorwaarts</td><td>Microsynth</td><td>op bestelling</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', gebruikt om 3' handle in PCR 3 te genereren</td></tr><tr><td>3&rsquo; handle achterwaarts 5&rsquo;gelabeld met digoxigenine</td><td>Microsynth</td><td>op bestelling</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', gebruikt om 3' handle in PCR 3 te genereren</td></tr><tr><td>DNA vectoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMZ_OT</td><td>geproduceerd in-house</td><td>N/A</td><td>verdere beschrijving in "Structurele studies van Cardiovirus 2A proteïne onthullen de moleculaire basis voor RNA herkenning en translationele controle" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>Software en Algoritmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>POTATO</td><td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNAstructure</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spyder</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine Gecoate Polystyreen Deeltjes, 1,5-1,9 &micro;m, 5 ml, 1,0% w/v</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigenine Gecoate Polystyreen Deeltjes, 2,0-2,4 &micro;m, 2 ml, 0,1% w/v</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Spuiten</td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>Apparaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>

optisch pincet om rna-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA neemt verschillende structurele plooien aan, die essentieel zijn voor zijn functies en daardoor verschillende processen in de cel kunnen beïnvloeden. Bovendien kan de structuur en functie van een RNA worden gemoduleerd door verschillende trans-acterende factoren, zoals eiwitten, metabolieten of andere RNA's. Frameshifting RNA-moleculen zijn bijvoorbeeld regulerende RNA's in coderende regio's, die het vertalen van ribosomen naar een alternatief open leeskader sturen en daardoor fungeren als genschakelaars. Ze kunnen ook verschillende plooien aannemen na binding aan eiwitten of andere transfactoren. Om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om het samenspel en de mechanische kenmerken van deze RNA-eiwitcomplexen tegelijkertijd te bestuderen. Dit werk illustreert hoe single-molecule-fluorescentie-gekoppelde optische pincetten kunnen worden gebruikt om het conformationele en thermodynamische landschap van RNA-eiwitcomplexen met een hoge resolutie te verkennen. Als voorbeeld wordt de interactie van het SARS-CoV-2 geprogrammeerde ribosomale frameshifting element met de trans-acterende factor korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit uitgewerkt. Bovendien werden fluorescentie-gelabelde ribosomen gecontroleerd met behulp van de confocale eenheid, die uiteindelijk de studie van translatie-elongatie mogelijk zou maken. De fluorescentie gekoppelde OT-test kan op grote schaal worden toegepast om diverse RNA-eiwitcomplexen of trans-acterende factoren die de translatie reguleren te onderzoeken en zou studies van op RNA gebaseerde genregulatie kunnen vergemakkelijken.

In deze sectie wordt voornamelijk aandacht besteed aan metingen van RNA-eiwit/ligand interacties door het fluorescentie optische pincet. Voor een beschrijving van algemene RNA optische pincet experimenten en bijbehorende representatieve resultaten, zie32. Voor meer gedetailleerde bespreking van de RNA/DNA-eiwit interacties, zie ook1,2,26,59,60.<sup class="xref...

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Het algemene doel van het volgende methodeartikel is om een protocol aan te tonen dat nuttig is om RNA-interacties met eiwitten of andere factoren te bestuderen met behulp van optische pincetten in combinatie met confocale microscopie. In het afgelopen decennium zijn verschillende geavanceerde technieken ontwikkeld om de eigenschappen van afzonderlijke macromoleculen te onderzoeken. Een van deze technieken is een enkel molecuul optisch pincet.Met het nieuwe fluorescentieondersteunde optische pincet kunnen niet alleen de krachten die nodig zijn voor het ontvouwen van RNA-moleculen, maar ook bindingsgebeurtenissen tijdens de translatie in detail worden gevolgd. Hier richten we ons op metingen waarbij RNA-moleculen worden uitgerekt met en zonder transactiefactoren die de translatie reguleren. We illustreren ook hoe de techniek kan worden toegepast om de vertaling te controleren met behulp van gelabelde ribosomen.Het protocol zal worden gedemonstreerd door twee afgestudeerde studenten in mijn groep, Lukas Pekarek en Stefan Park. In deze video gaan we je begeleiden bij het instellen en uitvoeren van een optisch pincetexperiment. We schetsen ook de eenvoudige workflow voor gegevensanalyse.Het voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig en robuust is. Een molecuul wordt vastgebonden tussen twee kralen, vastgebonden in de focus van laserstralen, en verandering en kracht bij verplaatsing kunnen nauwkeurig worden gemeten in zogenaamde force-ramp experimenten. Secundaire structuren in een tether ontvouwen zich met een bepaalde kracht, afhankelijk van de interne energie van het molecuul.Deze dynamische overgang tussen meerdere structuren kan verder worden onderzocht met constante krachtmetingen. Bovendien kan het parallelle gebruik van fluorescerende beeldvorming worden gebruikt om bindingsgebeurtenissen in realtime te visualiseren. Een duidelijk kracht-afstandsprofiel van een tether kan variëren na binding van potentiële transactiefactoren die de stabiliteit ervan beïnvloeden.Eerst moet het betreffende RNA worden gekloond tot een DNA-vector. Stroomopwaarts en stroomafwaarts van deze sequentie zijn extra onderdelen, de handvatten nodig om het uiteindelijke DNA-RNA-construct tussen de kralen te binden. Na succesvol klonen en versterken van het plasmide worden drie verschillende PCR-reacties uitgevoerd.Meng voor elke PCR-reactie de reagentia volgens tabel één in het protocol. Voer de PCR uit in aliquots van 50 microliter in een geschikte thermische cycler. De eerste resulteert in een dubbelstrengs DNA van het hele construct met de T7-promotor voor daaropvolgende in-vitro transcriptie.De tweede PCR produceert de vijf prime handgrepen. Terwijl de laatste reactie resulteert in de drie priemgrepen. Zowel 5 priem- als 3 priemgrepen moeten worden gelabeld volgens de gebruikte kralen.De drie prime handles worden tijdens de PCR gelabeld met behulp van een digoxigenine gelabelde reverse primer, en de vijf prime handles moeten in een extra stap worden geëtiketteerd door middel van biotinylatie. De drie primaire biotinylatie van de vijf priemgrepen wordt uitgevoerd met behulp van T 40 en een polymerase. De reactie wordt gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur uitgevoerd.Voer vervolgens de in-vitro transcriptie uit met behulp van T7-polymerase. Incubeer de reactie bij 37 graden gedurende twee tot vier uur, afhankelijk van de lengte van het RNA. In een laatste stap worden de handvatten gegloeid met het RNA uit de in-vitro transcriptie om het uiteindelijke DNA-RNA-construct te verkrijgen met het enkelstrengs interessegebied tussen de dubbelstrengs handgrepen.Om de gewenste RNA-DNA hybride te gloeien, mengt u de handvatten en het RNA in gloeibuffer. Verwarm het gloeimengsel tot 85 graden gedurende 10 minuten en koel het monster vervolgens langzaam af tot vier graden. Meng het gegloeide monster met 1/10e van het volume van drie molair natriumacetaat en drie volumes ijskoude ethanol en incubeer min 80 graden gedurende ten minste een uur.Centrifugeer de monsters bij 15.000 xg gedurende 30 minuten bij vier graden. Gooi het bovennatuurlijk middel weg en droog de pellet onder vacuüm. Kleine aliquots van de geresuspendeerde pellet worden bevroren in vloeibare stikstof en op min 80 graden gehouden totdat ze worden gebruikt.Verwijder eerst het bleekmiddel uit de spuiten en vul een ml RNase-vrij water in. Voeg 50 microliter 0,5 molair natriumthiosulfaat toe en was het systeem met één staaf. Pas op dat het microfluïdische systeem nooit droogvalt om luchtbellen in het systeem te voorkomen.Gooi vervolgens de resterende natriumthiosulfaatoplossing weg en vervang de spuiten door nieuwe. Daarna opnieuw wassen met minimaal 0,5 ml RNase-vrij water. Om het optische systeem van de machine in te stellen, plaatst u twee druppels dompelolie op het doel.Plaats de stroomcel op zijn plaats en verhoog het doel totdat de vloeistof de stroomcel raakt. Leg vervolgens twee druppels dompelolie op de stroomcel. Schakel nu de valbesturing en de vanglaser in.Het objectief wordt aangepast met behulp van de Z-vinder van de diagnosecamera's van de machine. Door aan de microschroef te draaien, wordt de Z-as aangepast aan het midden van de kamer tussen de tweede en de derde reflectie. Waar de brekingsringen het grootst zijn.Schakel de diagnostische camera's naar de maanmodus en verlaag de vanglaser tot ongeveer 50% Verlaag vervolgens de condensor en pas de positie aan zodat u ongeveer 10 lichtbanden ziet. De meetkamer heeft vijf kanalen en vóór het experiment moeten verschillende instelmogelijkheden worden overwogen. Voor een eenvoudig force-ramp experiment is beads-buffer-beads een handige kanaalopstelling.Voor metingen met de vierde verbinding, zoals fluorescerende ribosomen of transacterende factoren, is de kralen-kralen-bufferfactor een betere opstelling, maar het maakt het moeilijker om kralen te vangen. Een aliquot van de gegloeide constructie wordt geïncubeerd met drie microliter AD-kralsuspensie, één microliter RNase-remmers en acht microliter van de testbuffer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 20 minuten. Vervolgens wordt het monster verdund in een testbuffer van 500 microliter en in het betreffende kanaal geplaatst.Voor de tweede soort kralen wordt 0,8 microliter assaykralen gemengd met één ml testbuffer en toegediend in het overeenkomstige kanaal. De kanalen worden geopend en gewassen met lage druk. Schakel nu de vanglaser in.Om kralen te vangen, worden de lasers uit elkaar verplaatst en wordt een AD-kraal gevangen in val één. Vervolgens wordt de fase verplaatst naar het SA-kralenkanaal en wordt een kraal gevangen in val twee. Om te voorkomen dat de kralen verloren gaan, of om een tweede in dezelfde val te vangen, wordt het podium verplaatst naar het bufferkanaal en worden alle kanalen gesloten.In de buffer wordt een overvulkalibratie uitgevoerd. De gevangen kralen moeten worden ingesteld als visuele sjablonen voor latere metingen. En de gelijkenisscore moet tussen de metingen boven de 90% worden gehouden om de vergelijkbaarheid te garanderen.Ten slotte worden de kralen dichter bij elkaar gebracht en kan men beginnen met het vangen van een enkele tether. Dit wordt gedaan door de kralen een paar seconden dicht te bewegen en vervolgens langzaam de kralen weer te verlaten. Een tetherformatie resulteert in een toename van de gemeten kracht bij het van elkaar wegtrekken van de twee kralen.Het aantal en de kwaliteit van de tethers kan worden gecontroleerd door het overrekkingsplateau te vinden en het traject te vergelijken met het vrij samengevoegde ketting- of wormachtige kettingmodel. Het overrekkingsplateau moet tussen de 50 en 60 piconewton zijn voor een enkele tether. Om de fluorescentiemetingen uit te voeren, schakelt u de confocale lasers in en stelt u fotonen op de eenheid en het optische pincet.Schakel daarna de excitatielaser van de gewenste golflengte en de software-interface in en stel het vermogen van de laser in op 5% of hoger, afhankelijk van de fluorofoor. Nu kan beeldvorming worden gestart met behulp van de beeld- of kymograaffuncties van de software. Om goed gefocuste beelden te krijgen, moet u ervoor zorgen dat het brandpuntsvlak van de confocale microscoop en de optische vallen zijn uitgelijnd.Hiervoor kan autofluorescentie van de polystyreenparels in het blauwe laserkanaal worden gebruikt. Beweeg op en neer met het brandpuntsvlak van de optische vallen totdat de autofluorescentie van de kralen de hoogste diameter bereikt. Op deze positie kunnen de fluorescentiesignalen die plaatsvinden bij het vastgebonden molecuul worden gedetecteerd.Voor beide functies is het belangrijk om de juiste interessante regio's te selecteren. Gedurende de meetbuffer kan de samenstelling eenvoudig worden gewijzigd door de kralen naar verschillende kanalen te verplaatsen of door de buffer in het microfluïdische systeem te veranderen. Om fotobleken te voorkomen, schakelt u de excitatielaser altijd uit wanneer u niet meet.De ruwe gegevensuitvoer van het apparaat bevat vaak veel ruis. Daarom, om verspreide gegevens verder te analyseren, moet men ze eerst vooraf verwerken. De eerste stap is om de gegevens te bemonsteren en te filteren met het Butterworth-filter met lage doorlaat, er werden goede resultaten verkregen.Voor force-ramp experimenten moeten de zich ontvouwende gebeurtenissen worden gemarkeerd op de overeenkomstige gevouwen en uitgevouwen gebieden van de eerste afstandscurve die kunnen worden gemonteerd met behulp van wormachtige ketting- of vrijgevoegde kettingmodellen. Voor de constante krachtgegevens kan de afstand in de tijd worden uitgezet en het is nuttig om een histogram te genereren om de overheersende conformatie bij een bepaalde kracht te kwantificeren. Hier wordt aangetoond dat de filterparameters cruciaal zijn om verschillende vouwtoestanden te onderscheiden.Om beter te begrijpen wat er met deze techniek bereikt kan worden, worden enkele representatieve resultaten getoond. Zo ziet een standaard force-distance curve van een force-ramp experiment eruit. In dit geval bestudeerden we het SARS-coronavirus-2 frameverschuivingselement.We zagen de ontvouwing zich in meerdere stappen rond 15 piconewton. Wanneer de richting wordt omgedraaid en de kralen weer dichterbij komen, vouwt de tether zich met iets lagere kracht terug. Toen we hetzelfde RNA maten in aanwezigheid van het zinkvinger antivirale eiwit ZAP, werd een vergelijkbaar patroon van ontvouwen waargenomen.Maar de secundaire structuur van het RNA hervouwde niet. Dit is een goed voorbeeld om te laten zien welke grote invloed eiwitbinding kan hebben op de RNA-kinetiek. Kijkend naar constante krachtgegevens kan de zich ontvouwende kinetiek verder worden onderzocht.De afstand in de tijd wordt uitgezet voor verschillende krachten en het histogram van de verschillende waargenomen toestanden wordt aan de rechterkant toegevoegd. Bij 10 piconewton is het RNA volledig in gevouwen toestand. Bij 11,5 piconewton wisselt het tussen toestanden en bij 13 piconewton bevindt het RNA zich permanent in een uitgevouwen toestand.Toen het SARS-coronavirus-2 frameverschuivingselement echter samen met ZAP werd gemeten, was het RNA volledig in een uitgevouwen toestand bij 11 piconewton en vertoonde het zelfs heel weinig overgang naar een gevouwen toestand bij 10 piconewton. Dit geeft aan dat ZAP bindt aan het enkelstrengs frameverschuivingselement en de vorming van een secundaire structuur voorkomt. Ten slotte zullen we kijken naar enkele optische pincetgegevens in combinatie met confocale microscopie.In dit experiment werd een fluorescerende kleurstof gebruikt die dubbelstrengs nucleïnezuren labelt, niet specifiek met toenemende kracht. De kymograaf laat zien dat naarmate de kralen uit elkaar worden bewogen, de fluorescentie-intensiteit toeneemt en deze volledig verdwijnt zodra de ketting te veel wordt uitgerekt en breekt. In de laatste figuur werden fluorescerend gelabelde ribosomen toegevoegd via kanaal vier.In dit experiment werd specifieke ribosoombinding aan de RNA-tether waargenomen. We hopen dat deze video je inzicht heeft gegeven in optische pincetten en wat er met deze ongelooflijke techniek kan worden uitgevoerd.

optical-tweezers-to-study-rna-protein-interactions-translation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Optische pincetten zijn gebruikt om RNA-vouwing te bestuderen door individuele moleculen uit te rekken vanaf hun 5’ en 3’ uiteinden. Hier worden gebruikelijke procedures beschreven voor het synthetiseren van RNA-moleculen voor tweezing, kalibratie van het instrument en methoden om enkele moleculen te manipuleren.

Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Toeprinting wil het vermogen meten van in vitro Getranscribeerd RNA naar formulier vertaling initiatie complexen met ribosomen onder een aantal voorwaarden. Dit protocol wordt een methode beschreven voor de toeprinting zoogdieren RNA en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de GLB-afhankelijke zowel IRES gestuurde vertaling.

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Dubbele DNA-liniaal assay is ontwikkeld om de mRNA-positie tijdens ribosoom translocatie te bepalen, die afhankelijk is van de dissociatie krachten van de gevormde DNA-mRNA-duplexen. Met single-nucleotide resolutie en mogelijkheid van het bereiken van beide uiteinden van mRNA, het kan mechanistische inzichten bieden voor ribosoom translocatie en sonde andere nucleïnezuur verplaatsingen.

Dubbele DNA-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie

Single molecule fluorescentie energieoverdracht is een methode die de tRNA-dynamiek volgt tijdens ribosomale eiwitsynthese. Door individuele ribosomen te volgen, worden inhomogene populaties geïdentificeerd, die licht werpen op mechanismen. Deze methode kan worden gebruikt om biologische conformatieveranderingen in het algemeen te volgen om dynamisch-functierelaties in vele andere complexe biosystemen te onthullen. Single molecule-methoden kunnen niet-snelheidsbeperkende stappen en laagbevolkte...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer optische pincetten om RNA-eiwitinteracties te bestuderen voor vertaalregulatie met behulp van confocale microscopie. Deze methode maakt real-time monitoring van bindingsgebeurtenissen en krachtmetingen mogelijk.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Meer video's verkennen