Activering en conjugatie van oplosbare polysacchariden met behulp van 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat (CDAP)

Polysacchariden zijn slecht immunogeen, tenzij gekoppeld aan eiwit en moeten worden geactiveerd voor derivatisatie of conjugatie aan eiwitten. Bij deze methode wordt CDAP gebruikt als zandslangingsreagens. De CDAP activeert polysaccharidehydroxylen voor derivatisatie of om te worden gekoppeld aan eiwitten voor gebruik in vaccins of diagnostische reagentia.

CDAP heeft cyanogeenbromide grotendeels vervangen als een polysaccharide zand lading reagens. CDAP is eenvoudiger te gebruiken, efficiënter en kan worden gebruikt bij een lagere pH dan cyanogeenbromide. Het is een veel beter activerend reagens.

CDAP kan worden gebruikt met de meeste polysacchariden, in tegenstelling tot bijvoorbeeld reductieve aminatie, waarvoor vicinale hydroxylen nodig zijn. De chemie kan worden gebruikt om zowel direct als indirect te conjugeren aan eiwitten, en het kan worden gebruikt om diagnostische reagentia te maken. De CDAP-activeringsreactie, zoals oorspronkelijk beschreven, was zeer snel en moeilijk te controleren.

Het protocol dat hier wordt gegeven, maakt de chemie veel gemakkelijker uit te voeren en veel reproduceerbaarder. Voordat u met het experiment begint, moet u de pH van de polysaccharide-oplossing aanpassen aan 9 door tijdens het roeren 200 microliter dimethylaminopyridine-stamoplossing druppelsgewijs toe te voegen. Houd de reactie gekoeld in een ijswaterbad gedurende het hele activeringsproces.

Ga verder met cyano-dimethylaminopyridine-tetrafluoroboraat of CDAP-activering door 100 microliter CDAP onder het roeren over te brengen naar de polysaccharide-oplossing. Start de timer en controleer de pH-verandering gedurende de gehele activering gedurende 15 minuten. Handhaaf de reactie op de beoogde pH door onmiddellijk stappen van 10 microliter van 0,1 molair natriumhydroxide toe te voegen.

Wanneer de optimale activeringstijd is bereikt, voegt u twee milliliter 0,5 molaire adipic dihydrazide in één keer toe aan de geactiveerde polysaccharide. Controleer of de pH binnen het vereiste bereik ligt voor hydroxidefunctionalisatie. Breng na continu roeren van het reactiemengsel gedurende ten minste één uur het reactiemengsel over in vier graden Celsius.

Om de ADH-concentratie van het product te verminderen, dialyseer de ruwe gederivatiseerde polysaccharide-oplossing met behulp van het dialyseapparaat. Herstel de gederivatiseerde polysaccharide uit dialyse en bepaal de concentratie van de polysacchariden en hydrazide om de hydrazide-polysaccharideverhouding te berekenen. Bereid een milligram per milliliter ongewijzigde polysaccharide-oplossing voor gebruik als standaard.

Verwarm het verwarmingsblok minimaal een uur voor op 140 graden Celsius om een stabiele uniforme temperatuur te bereiken. Gebruik een beschermende pad onder en rond het verwarmingsblok in geval van zuur morsen. Voeg verschillende volumes van één milligram per milliliter koolhydraatstandaard toe aan de gelabelde 13 bij 100 borosilicaat reageerbuizen in drievoud en vul het volume aan tot 100 microliter met water om de gewenste standaardconcentraties te bereiken.

Stel op dezelfde manier monstertests in door een volume met vijf microgram van de gederivatiseerde polysaccharide toe te voegen aan drie monsterbuizen. Voeg 100 microliter vers bereide zes milligram per milliliter resorcinol toe aan elke buis. Voeg met behulp van een herhaalde pipetter 300 microliter van het bereide 75% zwavelzuur toe aan elke buis, draai de buizen krachtig, wijs de buis weg, plaats vervolgens alle buizen in een kachelblok in een gestaag tempo in opeenvolgende volgorde en stel de timer onmiddellijk in op drie minuten.

Verwijder na drie minuten de buizen in dezelfde volgorde en plaats ze direct in een rek in een ijswaterbad. Verwijder de ijskoude buisjes om ze vijf minuten op kamertemperatuur te laten balanceren. Lees de absorptie van alle buizen op een UV-Vis spectrofotometer op 430 nanometer met behulp van een 10 millimeter padlengte cuvette.

Om testreacties op te zetten, sorteert en rangschikt u de gelabelde standaardbuizen in het buizenrek in volgorde van toenemende concentratie. Voeg met behulp van een gekalibreerde micropipette 100 microliter van de standaarden toe aan elke overeenkomstige buis. Gebruik voor de nulstandaard 100 microliter van de monsterbuffer.

Bereid op dezelfde manier de monsterbuizen voor en schik deze. Voeg vervolgens met behulp van een gekalibreerde micropipette van 1.000 microliter 875 microliter testbuffer toe aan alle testbuizen. Om de testreactie te starten, voegt u binnen vijf minuten 25 microliter 1% trinitrobenzeensulfonzuur toe aan elke testbuis in de vooraf bepaalde volgorde.

Vortex de testbuizen gedurende twee seconden met hoge snelheid en zorg ervoor dat de vloeistof tot een hoogte van een halve centimeter van de buisopening wervelt. Noteer de starttijd van de test en stel de timer in op twee uur. Plaats vervolgens het assaybuisrek gedurende twee uur in het donker bij kamertemperatuur.

Wanneer de tijd voorbij is, vortex de buizen en ga verder met het verzamelen van gegevens. De ADH-dextran werd getest op dextran met behulp van de resorcinol zwavelzuurtest. Een typische standaardbuis met glucose als suikerstandaard werd uitgezet.

Het hydrazidegehalte in gederivatiseerde polysaccharide of dextran werd bepaald met behulp van de TNBS-test. Het niveau van derivatisatie werd berekend als hydroogden per 100 kilodalton dextran om de vergelijking tussen polymeren met verschillende gemiddelde molecuulgewichten te vergemakkelijken. Het hier beschreven protocol moet mogelijk worden aangepast voor een specifieke polysacharide.

CDAP-chemie kan worden gebruikt om polysacchariden te functionaliseren voor gebruik met een breed scala aan conjugatiereagentia. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om polysacchariden te biotinyleren voor gebruik in ELISA's. Eiwitten kunnen direct worden gekoppeld aan CDAP-geactiveerde polysacchariden, maar dit vereist meestal enige optimalisatie voor een specifieke polysaccharide.

De conjugatieopbrengst kan meer dan 75% zijn Het gebruik van CDAP-chemie heeft goedkope geconjugeerde vaccins mogelijk gemaakt, zoals die bijvoorbeeld door het Serum Institute of India zijn gemaakt.