Monstervoorbereiding tot bio-informatica analyse van DNA-methylatie: associatiestrategie voor obesitas en gerelateerde eigenschappenstudies

Grootschalige omics-technologieën worden steeds meer gebruikt in studies gericht op obesitas. Epigenetica kan een verband zijn tussen de blootstelling en gezondheidsresultaten. Dit type onderzoek genereert een enorme hoeveelheid gegevens.

Daarom is het belangrijk om de protocollen te standaardiseren om de gegevens technisch vergelijkbaar te maken. In deze studie gaan we een pijplijn voorstellen om DNA-methylatiegegevens te verkrijgen en te analyseren. Hetzelfde protocol kan worden toegepast voor zowel 400K- als epic-versies.

Dag één: Bisulfiet behandeling. Begin met het denatureren van genomisch DNA en voeg vervolgens de conversiereagentia toe. Het is noodzakelijk om de aanbevelingen van de kit te volgen.

En behandel het denaturerende DNA met bisfosfaat. Incubeer vervolgens de monsters in een thermische cycler. Voer de wasstappen uit met behulp van de wasbuffer.

Dag twee: Amplificatie volgens de methylatietest, handmatig protocol. Verwarm de hybridisatieoven voor op 37 graden Celsius en laat de temperatuur in evenwicht brengen. Disperseer 20 microliter MA1 in de putjes van de plaat.

Breng vier microliter van het DNA over naar de overeenkomstige putjes op de plaat. Dispergeer vier microliter natriumhydroxideoplossing in de plaatputten. Sluit de plaat af met een plastic afdichting.

Vortex de plaat om de reagentia met monsters te mengen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dispergeer 68 microliter RPM in elke put en vervolgens 75 microliter MSM zonder de eerder opgeloste oplossing te verwijderen.

Gebruik een nieuwe afdichting om de plaat te bedekken. Vortex de plaat gedurende één minuut. Incubeer in de hybridisatieoven gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius.

Dag drie: Hybridisatie volgens de methylatietest, handmatig protocol. Verwarm het blok voor door de plaat op 37 graden Celsius in te brengen. Verwijder de plaat voorzichtig uit de hybridisatieoven.

Pulseer de plaat. Verwijder de verzegeling van de plaat. Voeg 50 microliter FMS toe aan elke monstercontainer.

Vortex de plaat gedurende één minuut. Centrifugeer de plaat nodig. Leg vervolgens de verzegelde plaat een uur op het verwarmingsblok bij 37 graden Celsius.

Voeg 100 microliter PM1 toe aan elke put met monsters. Sluit de plaat opnieuw af. Vortex de plaat gedurende één minuut.

Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Pulseer vervolgens gedurende één minuut in de centrifuge en voeg vervolgens 300 microliter 100% 2-propanol toe aan elke put met monster. Sluit de plaat opnieuw af.

Meng alle inhoud door de plaat minstens 10 keer om te keren. Incubeer bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de verzegeling van de plaat.

Keer de plaat snel om op een geschikte plaats en gooi het supernatant weg. Tik meerdere keren stevig totdat je merkt dat alle putjes vrij zijn van vloeistof. Laat bij kamertemperatuur de plaat ondersteboven en een uur onbedekt.

Na het drogen van alle vloeistof, is het noodzakelijk om blauwe pallets op de bodem van de putten te zien. Voeg vervolgens 46 microliter RA1 toe aan elke put. Breng de heat seal aan op de plaat.

Houd stevig vast om de afdichting gelijkmatig uit te voeren. Zet de plaat een uur in de hybridisatieoven op 48 graden Celsius en draai vervolgens een minuut. Pulseer in de centrifuge en verwarm de plaat gedurende een uur op 95 graden Celsius.

Bereid de BeadChip Hyb Chambers samen voor. Dispergeer in deze volgende stap 400 microliter PB2 in de reservoirs in de Hyb-kamers. Na het vullen van de Hyb Chamber reservoirs met PB2, doe het deksel er onmiddellijk op.

Laad elk monster van de plaat voorzichtig in de monsterinvoer van de microarray. Laad de Hyb Chamber-inzetstukken met de microarrays in de Hyb-kamer. Sluit de Hyb-kamer kruislings om mogelijke verschuiving van de Hyb-kamer te voorkomen.

Dag vier:Kleuring volgens de methylatietest, handmatig protocol. Verwijder na de nachtelijke incubatie alle microarrays uit de inserts. En was de microarrays langzaam en licht, in totaal 10 keer, op en neer.

Verplaats de microarrays naar PB1-container nummer twee en herhaal dit 10 keer, omhoog en omlaag. Plaats de frames van de Flow Chamber in de juiste positie en vervolgens elke microarray. Gebruik een transparante afstandhouder aan de bovenkant van elke afstandhouder.

De uitlijnbalk moet op het uitlijnaccessoire worden geplaatst. Een glazen achterplaat moet bovenop de afstandhouder worden geplaatst. Bevestig vervolgens metalen klemmen aan de Flow Chambers.

Gebruik een schaar om de uiteinden van de Flow Chamber-afstandhouders bij te knippen. Plaats de Flow Chamber met de microarray in het kamerrek. Pipet 150 microliter RA1.

Incubeer gedurende 30 minuten en herhaal dit vijf keer. Pipetteer 450 microliter XC1 en incubeer gedurende 10 minuten. Pipetteer 450 microliter XC2 en incubeer gedurende 10 minuten.

Pipet 200 microliter TEM. Incubeer gedurende 15 minuten. Pipetteer 450 microliter van 95% formamide.

Incubeer gedurende één minuut en herhaal dit twee keer. Incubeer gedurende vijf minuten. Pipet 450 microliter XC3.

Incubeer gedurende één minuut en herhaal. In deze stap worden de volgende reagentia afgegeven, 250 microliter STM, 450 microliter XC3 en 250 microliter ATM. Voer het volgende herhalingsschema uit.

Plaats na alle herhalingen en incubaties de microarrays op een staand rek en dompel ze in de wasbak. Langzaam en licht bewegen met op en neer gaande bewegingen, 10 keer. Droog de microarrays met behulp van de vacuümsiccator gedurende 50 tot 55 minuten.

Zodra de microarrays zijn gedroogd, gaat u verder met het in beeld brengen van de microarray met de scan. In deze afbeelding zien we alle gebruikte protocollen, van het kiezen van de deelnemers tot het verwerken van de IDAT-bestanden die zijn verkregen op de laatste dag van het methylatie-experiment. De bestanden werden overgebracht naar de computer waar de bioinformatische analyse werd uitgevoerd.

De analyse werd verwerkt met behulp van R Studio en het Bioconductor ChAMP-pakket. Zorg ervoor dat u ten minste acht gigabyte RAM op uw computer hebt. Andere bioinformatische analyses, zoals genverrijking, werden uitgevoerd om de gegevens beter aan de lezer te presenteren.

In deze tabel kunnen we de twee groepen observeren die in deze studie worden gebruikt, zwaarlijvig en niet-zwaarlijvig. Er was een verschil tussen groepen voor variabelen, body mass index, abdominale omtrek, vetmassa in kilogrammen en vetmassa in procenten. Door het schema in deze figuur te observeren, konden we begrijpen dat het voorgestelde protocol geschikt was voor onze gegevens.

En na de bioinformatische analyse werden in totaal 409.887 sondes gepresenteerd nadat het filter was uitgevoerd. De dichtheidsgrafiek onthulde dat alle monsters vergelijkbare dichtheden van bètaverdeling hadden. Op basis van deze analyse werden geen monsters uitgesloten.

De enkelvoudige waardedecompositieanalyse van de genormaliseerde gegevens onthulde dat BMI, dubbele C en FM de variabiliteit van DNA-methylatiegegevens aanzienlijk beïnvloedden. Schatting van het celtype onthulde dat zowel natural killer-cellen, NK- als B-cellen hoger waren bij zwaarlijvige vrouwen. DNA-methylatieniveaus tussen zwaarlijvige en niet-zwaarlijvige vrouwen waren verschillend voor en na celtypecorrectie.

Vóór de correctie werden 43.463 verschillende methylatieposities waargenomen. En daarna bleven er 3.329 CLB's over. Een totaal van 162 CLB's werden gehypomethyleerd en 576 werden gehypermethyleerd in zwaarlijvige in vergelijking met niet-zwaarlijvige.

De gegevens zijn beschikbaar in de GEO-database onder registratiecode GSE166611. We presenteren de CPG-locaties die geassocieerd waren met de specifieke kenmerken van de deelnemers die werden waargenomen in SVD. Voor vetmassa werden 13.222 CPG-locaties gevonden.

Er waren 6.159 vetmassa-gerelateerde CLB's in de promotorregio. 470 gehypomethyleerd en 94 gehypermethyleerd. De respectievelijke genen van de geassocieerde sites werden verrijkt en worden nu getoond.

We hebben vastgesteld dat het voorgestelde protocol in staat is om binnen uw methylatiepatronen te identificeren, en het is goed om binnen uw methylaties te relateren. Ons resultaat bevestigt dat een obesogene levensstijl epigenetische veranderingen in het menselijk DNA kan bevorderen.