Name: Basofiele activeringstest voor allergiediagnose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer de basofiele activeringstest voor allergiediagnose met flowcytometrie. Deze in vitro methode meet IgE-gemedieerde reacties op allergenen en geneesmiddelen zonder provocatietesten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Claudia Corazza voor haar onschatbare Engelse taalondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Instituut voor Gezondheid "Carlos III" (ISCIII) van het MINECO (subsidie medegefinancierd door het EFRO: "Una manera de hacer Europa"; Subsidies nrs. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 en RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Andalusisch Regionaal Ministerie van Volksgezondheid (Subsidie nrs. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID is klinisch onderzoeker (B-0001-2017) en AA heeft een senior postdoctoraal contract (RH-0099-2020), beide ondersteund door het Andalusische regionale ministerie van Volksgezondheid (medegefinancierd door ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

De uitvoering van het protocol werd uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de lokale ethische commissie (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spanje). Alle proefpersonen werden mondeling geïnformeerd over het onderzoek en ondertekenden het bijbehorende geïnformeerde toestemmingsformulier.
OPMERKING: Het huidige protocol beschrijft de BBT-procedure die de auteurs dagelijks gebruiken. Dit is echter geen gestandaardiseerde methode en er bestaan verschillen met procedures die door andere auteurs zijn gepubliceerd. De belangrijkste protocolwijzigingen houden verband met het gebruik van IL-3 in de stimulatiebuffer, incubatietijd met de stimulus, methode voor het stoppen van basofiele degranulatie en flowcytometriestrategieën. Bovendien bevatten verschillende in de handel verkrijgbare kits voor BBT specifieke protocollen die door de fabrikant worden aanbevolen.
1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Verzamel perifeer bloed in heparinized buizen van 9 ml en houd het monster op kamertemperatuur (RT) in een rotor totdat het nodig is voor het experimentele protocol.</li>
	<li>Label 5 ml cytometerbuizen voor negatieve controles (2 buizen), positieve controles (2 buizen) en verschillende concentraties allergeen / geneesmiddel (1 buis per geteste allergeen / medicijnconcentratie). Plaats de buizen in een rek waar buizen perfect passen zonder uit te glijden.</li>
	<li>Bereid de stimulatiebuffer in dubbel gedestilleerd water met 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3,7 mg/L KCl, 7,8 mg/L CaCl2, 3,3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA. Stel de pH in op 7,4 en voeg IL-3 toe bij 2 ng/ml. Bereid gewoonlijk 100 ml en deel in aliquots van 2,5 ml om te worden ingevroren bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid positieve controles voor in PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Positieve controle 1, N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP) (4 μM), om de kwaliteit van basofielen te bevestigen; Positieve controle 2, Anti-IgE (0,05 mg/ml) als een IgE-gemedieerde positieve controle.</li>
	<li>Bereid het allergeen / medicijn in PBS-T op 2x de gewenste eindconcentratie. OPMERKING: Optimale allergenen-/geneesmiddelconcentraties die moeten worden gebruikt, moeten vooraf worden bepaald met behulp van een breed scala aan concentraties, door dosis-responscurven en door cytotoxiciteitsstudies volgens hetzelfde protocol stappen139.</li>
</ol>2. Bereiding van de kleuringsmix
<ol><li>Voeg monoklonale antilichamen gelabeld met fluorochroom toe aan de stimulatiebuffer na de door de fabrikant aanbevolen antilichaamconcentratie of door eerdere antilichaamtitratie. In dit protocol voegen we 1 μL van elk antilichaam toe (CCR3-APC en CD203c-PE voor basofiele identificatie; CD63-FITC voor basofiele activatie)140 per 20 μL stimulatiebuffer. OPMERKING: Bescherm de kleuringsmixvoorbereiding tegen het licht.</li>
	<li>Voeg 23 μL kleuringsmengsel toe aan elke buis.</li>
</ol>3. Bloedstimulatie
<ol><li>Voeg 100 μL PBS-T toe aan buis 1 en 2 (negatieve controle), 100 μL fMLP aan buis 3, 100 μL anti-IgE aan buis 4 en 100 μL van de verschillende allergenen/geneesmiddelconcentraties aan de volgende buisjes. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in een thermostatisch bad met gemiddelde agitatie tot prewarmreagentia.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 100 μL bloed toe aan elke buis om hemolyse te voorkomen. Vortexbuizen voorzichtig en incubeer gedurende 25 minuten bij 37 °C in een thermostatisch bad met medium agitatie.</li>
	<li>Stop de degranulatie en houd de buizen gedurende ten minste 5 minuten op 4 °C. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd bij 4 °C gedurende 30-45 minuten indien nodig 141.142.143.</li>
</ol>4. Erytrocyten die liggen
<ol><li>Voeg 2 ml 1x lysingbuffer toe aan elke buis om erytrocyten te lyseren. Vortex elke buis en incubeer gedurende 5 minuten op RT. OPMERKING: In deze stap worden cellen gefixeerd als gevolg van fixatieve middelen (formaldehyde) in de buffer.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Decanteer het supernatant en gooi het rek om in een gootsteen. Cellen blijven aan de onderkant van de buizen.</li>
	<li>Voeg 3 ml PBS-T toe aan elke buis om cellen te wassen. Vortex elke buis.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Decanteer het supernatant en gooi het rek om in een gootsteen. OPMERKING: Bewaar monsters bij 4 °C, beschermd tegen het licht totdat de flowcytometer is verkregen.</li>
</ol>5. Acquisitie van flowcytometrie
<ol><li>Verkrijg monsters via flowcytometer (bijv. BD FACSCalibur Flow Cytometer). Sluit de flowcytometer aan op de computersoftware en wacht tot de cytometer klaar is. Laad de sjabloon- en instrumentinstellingen (tabel 1).</li>
	<li>Start de monsteracquisitie.</li>
	<li>Gebruik de volgende cytometerstrategieën voor de selectie van geactiveerde basofielen139.<ol><li>Poort de lymfocyten van de Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC) plot.</li>
		<li>Poort de basofielen uit de lymfocytenpopulatie als CCR3 + CD203c + -cellen. Verkrijg ten minste 500 basofielen per buis.</li>
		<li>Toon een CCR3 - CD63-plot om activering te analyseren met CD63 als activeringsmarkering. Stel de CD63-negatieve drempel in op ongeveer 2,5% met behulp van de negatieve controlebuizen.</li>
		<li>Verkrijg alle monsters.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

BBT is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties die nuttig is gebleken bij de diagnose van reacties geïnduceerd door verschillende triggers zoals geneesmiddelen, voedsel of inhalatiemiddelen, evenals bij sommige vormen van chronische urticaria. In het algemeen moeten bbt-prestaties worden overwogen als i) het allergeen/geneesmiddel vals-positieve resultaten in ST oplevert; ii) het allergeen/geneesmiddel is niet beschikbaar om te worden gebruikt voor S...

De diagnose van IgE-gemedieerde allergie is gebaseerd op klinische geschiedenis, huidtests (ST's), kwantificering van serumspecifiek IgE (sIgE) en, indien vereist en geïndiceerd, gecontroleerde provocatietests (CCT's)1,2,3,4,5,6. De klinische geschiedenis kan echter onbetrouwbaar zijn, omdat er een gebrek aan nauwkeurige informatie kan zijn, en ST's en CCT's zijn geen risicovrije procedures die gecontra-indiceerd kunnen zijn bij proefpersonen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren 1,2,3,4,5,6 . Deze kwesties, samen met het feit dat de bepaling van sIgE door gevalideerde en commerciële fluor-enzymimmunoassays slechts beschikbaar is voor enkele allergenen en geneesmiddelen, hebben de belangrijke rol van andere in vitro functionele assays zoals basofiele activeringstest (BBT) benadrukt.
Basofielen zijn belangrijke effectorcellen die betrokken zijn bij IgE-gemedieerde allergische reacties die worden geactiveerd bij cross-linking van aangrenzende sIgE gebonden aan hoge affiniteitsreceptoren (FcεRI) op het celoppervlak na blootstelling aan allergenen / geneesmiddelen. Basofiele activering veroorzaakt celdegranulatie en afgifte van voorgevormde en nieuwe gesynthetiseerde ontstekingsmediatoren in intracytoplasmatische secretiekorrels 7,8,9. BBT is een in vitro methode die de basofielactivatie probeert na te bootsen in aanwezigheid van een stimulus (allergeen of geneesmiddel) en veranderingen in de expressie van basofiele activeringsmarkers bepaalt door middel van flowcytometrie 7,10. Er zijn verschillende strategieën om basofielen te identificeren (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) en om celactivering te meten (voornamelijk upregulatie van CD63 en CD203c) met behulp van combinaties van fluorochroom-gelabelde antilichamen 7,10. CD63, de beste klinisch gevalideerde activeringsmarker 11,12,13,14, is een membraaneiwit verankerd in de secretoire korrels die histamine bevatten en dat, na celactivering en fusie van de korrels met het membraan, tot expressie komt op basofieloppervlak 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c is een oppervlaktemarker die constitutief tot expressie komt op basofielen en wordt geupreguleerd na FcεRI-stimulatie, die ook betrouwbare resultaten heeft laten zien in BBT 15,22,23,24,25. Bovendien lijkt het samen te drukken met CD6326.
In de afgelopen decennia is aangetoond dat BBT nuttig is bij de diagnose van IgE-gemedieerde allergische reacties geïnduceerd door verschillende triggers zoals geneesmiddelen, voedsel of inhalatiemiddelen, evenals bij sommige vormen van chronische urticaria, zoals hieronder beschreven. De positie van deze techniek in de diagnostische algoritmen is echter zeer variabel en niet goed bepaald.
Overgevoeligheid voor geneesmiddelen BAT is nuttig gebleken als een aanvullende test voor geselecteerde geneesmiddelen en patiënten, met name voor degenen die ernstige reacties ervaren vanwege het feit dat de diagnostische waarde van ST niet goed is vastgesteld voor de meeste geneesmiddelen, omdat ze zijn gevalideerd en gestandaardiseerd voor een beperkt aantal geneesmiddelen 27,28,29,30. Bovendien is kwantificering van sIgE alleen beschikbaar voor een beperkt aantal geneesmiddelen, met een lagere gevoeligheid dan ST 27,28,29,30,31,32. Daarom is de diagnose van overgevoeligheid voor geneesmiddelen meestal afhankelijk van een provocatietest voor geneesmiddelen, die kan worden gecontra-indiceerd bij personen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren33.
Veelbelovende resultaten zijn gemeld voor het gebruik van BBT bij geselecteerde patiënten die onmiddellijke overgevoeligheidsreacties op verschillende geneesmiddelen zoals betalactams (BLs)20,34,35,36,37,38,39, neuromusculaire blokkers (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolonen (FQ's)46,47,48,49, pyrazolonen 50,51,52, radiocontrast media (RCM)53,54,55,56, en platinaverbindingen 57,58,59 . Van BBT is gemeld dat het een sensitiviteit en specificiteit heeft tussen respectievelijk 51,7-66,9% en 89,2-97,8%; en positieve en negatieve voorspellende waarden worden beschreven tussen 93,4% en 66,3%, respectievelijk27,31. Bovendien is BAT voorgesteld als een voorspellende biomarker voor doorbraakreacties tijdens desensibilisatie met platinaverbindingen, aangezien de CD203c-expressie verhoogd is in vergelijking met CD63 bij patiënten met een hoog risico op bijwerkingen tijdens desensibilisatie van geneesmiddelen57.
Het is van belang dat BBT alleen nuttig is bij overgevoeligheid van geneesmiddelen wanneer de reactie basofiele degranulatie omvat; daarom is het niet nuttig bij reacties als gevolg van enzymatische remming van cyclooxygenase 142.
Voedselallergie BBT is naar voren gekomen als een potentieel diagnostisch instrument voor voedselallergie omdat de bepaling van serum-sIgE voor het gehele allergeenextract of afzonderlijke allergenen vaak dubbelzinnig is, waardoor orale voedseluitdaging nodig is om de diagnose te bevestigen, wat, net als overgevoeligheid van geneesmiddelen, een kostbare en niet risicovrije procedure is60. Verschillende studies hebben relevante resultaten aangetoond met koemelk61,62, ei61,63, tarwe 64,65,66,67,68, pinda 63,69,70,71,72, hazelnoot 73,74,75,76 ,77, schaaldieren78, perzik 79,80,81, appel 21, selderij en wortel82,83.
De belangrijkste toegevoegde waarde van BBT bij de diagnose van voedselallergie in vergelijking met ST's en sIgE in serum is dat het een hogere specificiteit en vergelijkbare gevoeligheid vertoont. BAT is dus een nuttig hulpmiddel om klinisch allergische patiënten te onderscheiden van gesensibiliseerde, maar tolerante proefpersonen met zowel een hoge specificiteit (75-100%) als gevoeligheid (77-98%)63,69,84. Gevoeligheids- en specificiteitswaarden zijn afhankelijk van het allergeen en andere factoren zoals fenotypen (bijv. Oraal allergiesyndroom versus anafylaxie), leeftijd en geografie-gerelateerde sensibilisatiepatronen63,85.
BBT met behulp van enkelvoudige allergeencomponenten kan mogelijk de diagnostische nauwkeurigheid voor sommige voedselallergenen verbeteren61,80. Er zijn studies met zaadopslageiwitten (bijv. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 en Ara h 6 van pinda)86; lipide transfereiwitten (bv. Pru p 3 van perzik en Ara h 9 van pinda)80,86; en Bet v 1 homologen (bijv. Ara h 8 van pinda)87. Andere potentiële nutsvoorzieningen zijn gerelateerd aan de identificatie van het boosdoenerallergeen in gevallen van pollen-voedselallergiesyndroom 21,87,88, allergie voor rood vlees89 of voedselafhankelijke inspanningsgeïnduceerde anafylaxie66.
Interessant is dat BBT informatie kan geven over de ernst en de drempel van allergische reacties, aangezien patiënten met ernstigere reacties een groter aandeel geactiveerde basofielen vertonen, zoals waargenomen in studies met pinda- en koemelkallergische patiënten 84,90,91; en patiënten die reageren op sporenhoeveelheden van het allergeen vertonen een grotere basofielengevoeligheid 84,90,92. Deze gegevens suggereren dat BBT nuttig kan zijn om patiënten met een hoog risico op allergische aard te identificeren die nauwere follow-up en intensiever onderwijs nodig hebben93. Bovendien is gemeld dat BBT70,91,92,94 en drempelwaarden van reactiviteit90,95 kan voorspellen om te helpen bepalen wanneer voedsel veilig kan worden (her)geïntroduceerd84. Deze bevindingen zijn echter controversieel in sommige studies 63,96 en meer onderzoek is vereist.
Aan de andere kant is BBT gebruikt om de oplossing van voedselallergie te controleren, hetzij natuurlijk of onder immunomodulerende behandelingen, in de loop van de tijd, die tot nu toe alleen werd beoordeeld door orale voedseluitdaging, met de bijbehorende risico's en kosten 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107.108. Bovendien is het ook gebruikt om het effect van omalizumab in voedselallergie te monitoren, aangezien basofiele activering afneemt tijdens de behandeling met omalizumab, maar het neemt toe na het staken van de behandeling109.
Inhalatieallergie BBT is zelden gunstig bij inhalatieallergie, omdat de diagnose routinematig kan worden vastgesteld door sIgE-kwantificering en ST. In gevallen van lokale allergische rhinitis (niet-detecteerbare niveaus van sIgE en negatieve ST's met positieve nasale provocatietests) heeft BAT echter in 50% van de gevallen de diagnose mogelijk gemaakt110. Er is verder een correlatie gemeld tussen basofiele gevoeligheid en respons op nasale / bronchiale provocatietests, evenals tussen de ernst van astma en de werkzaamheid van de behandeling met omalizumab111.112.
BBT is ook gebruikt om allergeenimmunotherapie voor huisstofmijt en pollen te controleren, aangezien de gevoeligheid voor basofielen afneemt tijdens immunotherapie, waarschijnlijk als gevolg van interferentie van blokkerende IgG-antilichamen 113.114.115.116.117.
Hymenopteragifallergie Diagnose van hymenoptera gifallergie is routinematig gebaseerd op ST en serum sIgE. BAT heeft een hoge sensitiviteit (85-100%) en specificiteit (83-100%) aangetoond en er is gemeld dat het nuttig is in gevallen die dubbelzinnige resultaten opleveren of bij patiënten met een suggestieve klinische geschiedenis van gifallergie maar niet-detecteerbare sIgE en negatieve ST118.119. BBT lijkt echter niet voorspellend te zijn voor de ernst van deze reacties120.121.
Tot 60% van de patiënten vertoont sIgE voor zowel wesp- als bijengif, en de identificatie van dominant allergeen is cruciaal voor een adequate immunotherapiebehandeling. In deze gevallen is gemeld dat BBT nuttig is bij de identificatie van het dominante allergeen 119.122.123.124. Hoewel sIgE voor de belangrijkste allergenen van bijen- en wespengif het nut van BBT kan verminderen bij patiënten met dubbele positiviteit voor beide gifstoffen, biedt het nuttige informatie, voornamelijk bij proefpersonen met negatieve resultaten in sIgE-bepalingen123.
Sommige studies suggereren dat BBT nuttig kan zijn als een voorspellende biomarker voor bijwerkingen tijdens de opbouwfase van gifimmunotherapie, omdat van deze behandelingsoptie is gemeld dat het de basofiele gevoeligheid vermindert. De reactiviteit neemt echter niet af en dit BAT-hulpprogramma is tegenwoordig controversieel 13.120.125.126.127.128.129.130.
Urticaria en angio-oedeem Een subgroep van chronische urticariapatiënten heeft een auto-immuun pathofysiologie, als gevolg van IgE-autoantilichamen voor autoallergenen en IgG-autoantilichamen die zich richten op FcεRI- of IgE-FcεRI-complexen die aanwezig zijn op het mestceloppervlak131.132. In de klinische praktijk is de diagnose van dit type chronische urticaria gebaseerd op positief autoloog serum ST, dat het risico op accidentele infectie heeft. BAT is voorgesteld als een in vitro test voor het diagnosticeren en monitoren van patiënten met vermoedelijke chronische urticaria. Zowel CD63- als CD203c-expressie op het oppervlak van basofielen is gemeld dat ze verhoogd zijn na stimulatie met sera van chronische urticariapatiënten, wat de detectie van actieve auto-antilichamen 133.134.135.136.137 aantoont. Onlangs is gemeld dat patiënten met een positieve BAT vaak de meest actieve ziektetoestand ervaren, beoordeeld op basis van de urticaria-activiteitsscore, en hogere doses antihistaminica nodig hebben samen met derdelijnsbehandelingen (ciclosporine A of omalizumab), vergeleken met die met negatieve BBT138.

<table><tbody><tr><td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>310708</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-human CD63 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>353006</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Solution 10x concentrated</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>324606</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td><td>BD Biosciences</td><td>555857</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>Sheath Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455084</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

basofiele activeringstest voor allergiediagnose

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

De basofiele activeringstest (BAT) is een aanvullende in vitro diagnostische test die kan worden gebruikt naast klinische geschiedenis, huidtest (ST) en specifieke IgE (sIgE) bepaling bij de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties op voedsel, insectengif, geneesmiddelen en sommige vormen van chronische urticaria. De rol van deze techniek in de diagnostische algoritmen is echter zeer variabel en niet goed bepaald.
Bbt is gebaseerd op de bepaling van basofiele respons op allergeen/geneesmiddel cross-linking IgE-activering door de meting van activeringsmarkers (zoals CD63, CD203c) door middel van flowcytometrie. Deze test kan een nuttig en complementair hulpmiddel zijn om gecontroleerde provocatietests te vermijden om de diagnose allergie te bevestigen, vooral bij proefpersonen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren. In het algemeen moet de prestatie van BBT worden overwogen als i) het allergeen/geneesmiddel vals-positieve resultaten in ST oplevert; ii) er is geen allergeen-/geneesmiddelbron om te gebruiken voor ST- of sIgE-bepaling; iii) er is discrepantie tussen de geschiedenis van de patiënt en ST- of sIgE-bepaling; iv) symptomen suggereren dat ST kan leiden tot systemische respons; v) voordat u een CCT overweegt om het boosdoener allergeen / medicijn te bevestigen. De belangrijkste beperkingen van de test houden verband met niet-optimale gevoeligheid, vooral bij medicijnallergie, de noodzaak om de test niet langer dan 24 uur na monsterextractie uit te voeren en het gebrek aan standaardisatie tussen laboratoria in termen van procedures, concentraties en celmarkers.

BBT uitgevoerd met allergenen of geneesmiddelen maakt onderzoek van IgE-afhankelijke overgevoeligheidsreacties mogelijk. Basofiele reactiviteit moet worden gemeten in ten minste twee optimale concentraties om de beste resultaten te verkrijgen34 en activering wordt gevisualiseerd door de upregulatie van CD63 op het celoppervlak. In het geval van allergenen moet bovendien, om de basofiele reactiviteit te bevestigen, de basofiele gevoeligheid worden geanalyseerd door de reactiviteit te meten bij meer...

De basofiele activeringstest is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties op basis van de detectie van basofiele activering in aanwezigheid van een specifieke stimulus door de meting van activeringsmarkers door flowcytometrie.

Basofiele activeringstest voor allergiediagnose

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

De basofiele activeringstest is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties die nuttig zijn gebleken voor reacties geïnduceerd door geneesmiddelen, voedsel of inhalatiemiddelen, evenals in sommige vormen van chronische urticaria. Deze test is gebaseerd op het bepalen van basofiele respons op een allergeen of geneesmiddel dat IgE-activering kruislings koppelt door de meting van activeringsmarkers door flowcytometrie. De basofiele activeringstest kan een nuttig en gratis hulpmiddel zijn om gecontroleerde provocatietests te vermijden om de allergiediagnose te bevestigen, vooral bij proefpersonen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren.Bovendien heeft deze test het voordeel dat het de respons tegen elk medicijn of allergeen kan analyseren in vergelijking met andere in vitro methoden die alleen beschikbaar zijn voor een paar geneesmiddelen en allergenen. De belangrijkste beperkingen van de test zijn gerelateerd aan niet-optimale gevoeligheid, vooral bij medicijnallergie. De noodzaak om de test niet langer dan 24 uur na monsterextractie uit te voeren en het gebrek aan standaardisatie tussen laboratoria en diagnostische algoritmen.Begin met het verzamelen van perifeer bloed in negen milliliter gehepariniseerde buizen en plaats de monsters in een rotor om ze op kamertemperatuur te houden totdat ze nodig zijn voor het experimentele protocol. Label twee cytometerbuizen van vijf milliliter elk voor negatieve controle en positieve controle. Label ook elk één buis voor de verschillende allergenen- of medicijnconcentraties die worden getest.Plaats de buizen vervolgens in een rek zodat de buizen perfect passen zonder uit te glijden. Bereid voor de eerste positieve controle een vier micromolaire oplossing van N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine of fMLP in 0,05% PBS-T Om de kwaliteit van basofielen te bevestigen. Voor de tweede positieve controle, bereid een 0,05 milligram per milliliter anti-IgE-oplossing met behulp van PBS-T.Bereid de kleuringsmix voor door één microliter ccr3-apc-, cd203c-pe- en cd63-fitc-antilichamen toe te voegen per 20 microliter van de stimulatiebuffer. Voeg vervolgens 23 microliter van deze kleuringsmix toe aan elke tube. Voeg 100 microliter PBS-T toe aan de negatieve controlebuizen.Voeg 100 microliter fMLP toe aan een van de positieve controlebuizen en voeg 100 microliter anti-IgE E toe aan de andere aan de rest van de buizen. Voeg 100 microliter van de verschillende allergenen- of medicijnconcentraties toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie voorzichtig 100 microliter bloed toe aan elke buis om hemolyse te voorkomen.Draai vervolgens de buizen voorzichtig vortex en incubeer ze gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius in het thermostatische bad met gemiddelde agitatie. Houd de buisjes minstens vijf minuten op vier graden Celsius om de degranulatie te stoppen. Voeg aan elke buis twee milliliter lysingbuffer toe om de erytrocyten te lyseren.Vortex elke buis en incubeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buizen bij 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens het rek in de gootsteen om het supernatant te decanteren terwijl de cellen aan de onderkant van de buizen blijven.Voeg drie milliliter PBS-T toe aan elke buis om de cellen te wassen en de buizen te vortexen. Voer een tweede centrifugatieronde uit met dezelfde set parameters en decanteer het supernatant door het rek in de gootsteen te kantelen. Houd de monsters vervolgens op vier graden Celsius beschermd tegen licht tot flowcytometrie.Sluit de flowcytometer aan op de computersoftware en wacht tot de cytometer klaar is. Laad de sjabloon- en instrumentinstellingen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Start het proces van monsterverwerving.Om geactiveerde basofielen te selecteren, moet u eerst de lymfocyten van de Side Scatter-Forward Scatter-plot afzetten. Vervolgens poort de basofielen uit de lymfocytenpopulatie als CCR3 + CD203c + cellen en verwerven ten minste 500 basofielen per buis. Stel de CD63-drempel in op ongeveer 2,5% met behulp van de negatieve controlebuizen en analyseer de monsters.IgE-afhankelijke overgevoeligheidsreacties werden onderzocht door een basofiele activeringstest of BAT uit te voeren met allergenen en geneesmiddelen. Basofiele gevoeligheid werd geanalyseerd door de reactiviteit te meten bij meerdere afnemende allergeenconcentraties die helpen bij het bepalen van de allergische concentratie die de respons van 50% basofielen of EC50 induceert. Eerst werden lymfocyten afgesloten van de zijverstrooiings-voorwaartse spreidingsgrafiek.Vervolgens werden basofielen uit de lymfocytenpopulatie verwijderd als CCR3 + CD203c + -cellen. Vervolgens werd een CCR3-CD63-plot gebruikt om basofiele activering te analyseren met behulp van CD63 als activeringsmarker voor twee geneesmiddelen en verschillende concentraties van een allergeen. De test wordt uitgevoerd met vers volbloed en mag niet langer dan 24 uur na bloedextractie worden uitgevoerd.De stimulus die in de test wordt gebruikt, mag geen hulpstoffen bevatten en de chemische kenmerken van de geneesmiddelen moeten worden overwogen. Andere aanvullende in vitro methoden voor de diagnose van IgE-gemedieerde allergische reacties, of de bepaling van sIgE, of de histamineafgiftetest.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Basofielen activatie test is een krachtig instrument voor de detectie van IgE-afhankelijke...

Basofiel activatie test voor Onderzoek van IgE-gemedieerde mechanismen in Drug Overgevoeligheid

Experimentele muismodellen van allergische astma bieden nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de ziekte van pathogenese en het ontwikkelen van nieuwe therapeutica. Deze modellen zijn zeer geschikt voor het meten factoren die de allergische immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen pathofysiologie.

Muizenmodel van Allergen Induced Astma

In this video, we describe an in vitro method to evaluate the allergic potential of an antigen to induce basophil degranulation. β-hexosaminidase is used as an index of chemical mediator release, and the enzyme activity of β-hexosaminidase is measured using a fluorogenic substrate.

Humanized Mediator Enzyme Release Assay: An Immunochemical Method to Screen Allergic Potential of Test Antigen by Monitoring Basophil Degranulation Response In Vitro

In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

This video demonstrates a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system. Serum IgEs interact with distinct allergens immobilized in the reaction zone of the cartridge, which are subsequently detected with peroxidase-conjugated anti-IgE antibodies and a chemiluminescent substrate, allowing simultaneous detection of multiple allergen-specific IgEs.

A Microfluidic Cartridge-Based Detection System for Allergen-Specific Immunoglobulin E

Hier presenteren we een protocol-allergeen geladen deeltjes kwantificeren flowcytometrie. Zwevende deeltjes deeltjes kunnen fungeren als dragers geadsorbeerd allergenen. We tonen hier dat flowcytometrie, een werkwijze op grote schaal gebruikt op gesuspendeerde stoffen te karakteriseren&gt; 0,5 pm in diameter, kan worden gebruikt om deze allergeen geladen deeltjes te verrichten.

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Dit werk beschrijft een protocol dat gebruik maakt van een component-opgeloste aanpak om sensibilisatie te bestuderen bij grasspollenallergene in een cohort van patiënten uit zuidelijk China met allergische rhinitis en / of astma.

Een component-opgeloste diagnostische aanpak voor een studie over grap pollen allergenen in Chinese zuidelijke landen met allergische rhinitis en / of astma

Dit document stelt een protocol voor het opsporen van serum specifieke immunoglobuline met een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic en de evaluatie van het nut ervan in allergie diagnoses.

Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)

Hier presenteren we de mediator release assay, met behulp van een rat basofiele leukemie cellijn getransfecteerd met de menselijke IgE receptor, om de degranulatie van effectorcellen te simuleren die typisch worden waargenomen bij type 1 allergische reacties. Deze methode onderzoekt de biologische activiteit van allergenen op een zeer gevoelige, reproduceerbare en aanpasbare manier.

Gestandaardiseerde Mediator Release Assay als een uitlezing voor allergeen potentie

Een protocol voor het uitvoeren van een uitdaging in een allergeenblootstellingskamer (AEC) -faciliteit wordt gepresenteerd. AEC's hebben bewezen veilige en effectieve hulpmiddelen te zijn voor de inductie van allergische symptomen of als eindpunt bij het testen van de werkzaamheid van allergeenimmunotherapie vanwege hun vermogen om stabiele deeltjesconcentraties en omgevingsomstandigheden te handhaven.

Symptoombeoordeling van patiënten met allergische rhinitis met behulp van een allergeenblootstellingskamer

Leer de basofiele activeringstest voor allergiediagnose met flowcytometrie. Deze in vitro methode meet IgE-gemedieerde reacties op allergenen en geneesmiddelen zonder provocatietesten.

Basofiele activeringstest voor allergiediagnose

Meer video's verkennen