Basofiele activeringstest voor allergiediagnose

De basofiele activeringstest is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties die nuttig zijn gebleken voor reacties geïnduceerd door geneesmiddelen, voedsel of inhalatiemiddelen, evenals in sommige vormen van chronische urticaria. Deze test is gebaseerd op het bepalen van basofiele respons op een allergeen of geneesmiddel dat IgE-activering kruislings koppelt door de meting van activeringsmarkers door flowcytometrie. De basofiele activeringstest kan een nuttig en gratis hulpmiddel zijn om gecontroleerde provocatietests te vermijden om de allergiediagnose te bevestigen, vooral bij proefpersonen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren.

Bovendien heeft deze test het voordeel dat het de respons tegen elk medicijn of allergeen kan analyseren in vergelijking met andere in vitro methoden die alleen beschikbaar zijn voor een paar geneesmiddelen en allergenen. De belangrijkste beperkingen van de test zijn gerelateerd aan niet-optimale gevoeligheid, vooral bij medicijnallergie. De noodzaak om de test niet langer dan 24 uur na monsterextractie uit te voeren en het gebrek aan standaardisatie tussen laboratoria en diagnostische algoritmen.

Begin met het verzamelen van perifeer bloed in negen milliliter gehepariniseerde buizen en plaats de monsters in een rotor om ze op kamertemperatuur te houden totdat ze nodig zijn voor het experimentele protocol. Label twee cytometerbuizen van vijf milliliter elk voor negatieve controle en positieve controle. Label ook elk één buis voor de verschillende allergenen- of medicijnconcentraties die worden getest.

Plaats de buizen vervolgens in een rek zodat de buizen perfect passen zonder uit te glijden. Bereid voor de eerste positieve controle een vier micromolaire oplossing van N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine of fMLP in 0,05% PBS-T Om de kwaliteit van basofielen te bevestigen. Voor de tweede positieve controle, bereid een 0,05 milligram per milliliter anti-IgE-oplossing met behulp van PBS-T.

Bereid de kleuringsmix voor door één microliter ccr3-apc-, cd203c-pe- en cd63-fitc-antilichamen toe te voegen per 20 microliter van de stimulatiebuffer. Voeg vervolgens 23 microliter van deze kleuringsmix toe aan elke tube. Voeg 100 microliter PBS-T toe aan de negatieve controlebuizen.

Voeg 100 microliter fMLP toe aan een van de positieve controlebuizen en voeg 100 microliter anti-IgE E toe aan de andere aan de rest van de buizen. Voeg 100 microliter van de verschillende allergenen- of medicijnconcentraties toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie voorzichtig 100 microliter bloed toe aan elke buis om hemolyse te voorkomen.

Draai vervolgens de buizen voorzichtig vortex en incubeer ze gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius in het thermostatische bad met gemiddelde agitatie. Houd de buisjes minstens vijf minuten op vier graden Celsius om de degranulatie te stoppen. Voeg aan elke buis twee milliliter lysingbuffer toe om de erytrocyten te lyseren.

Vortex elke buis en incubeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buizen bij 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens het rek in de gootsteen om het supernatant te decanteren terwijl de cellen aan de onderkant van de buizen blijven.

Voeg drie milliliter PBS-T toe aan elke buis om de cellen te wassen en de buizen te vortexen. Voer een tweede centrifugatieronde uit met dezelfde set parameters en decanteer het supernatant door het rek in de gootsteen te kantelen. Houd de monsters vervolgens op vier graden Celsius beschermd tegen licht tot flowcytometrie.

Sluit de flowcytometer aan op de computersoftware en wacht tot de cytometer klaar is. Laad de sjabloon- en instrumentinstellingen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Start het proces van monsterverwerving.

Om geactiveerde basofielen te selecteren, moet u eerst de lymfocyten van de Side Scatter-Forward Scatter-plot afzetten. Vervolgens poort de basofielen uit de lymfocytenpopulatie als CCR3 + CD203c + cellen en verwerven ten minste 500 basofielen per buis. Stel de CD63-drempel in op ongeveer 2,5% met behulp van de negatieve controlebuizen en analyseer de monsters.

IgE-afhankelijke overgevoeligheidsreacties werden onderzocht door een basofiele activeringstest of BAT uit te voeren met allergenen en geneesmiddelen. Basofiele gevoeligheid werd geanalyseerd door de reactiviteit te meten bij meerdere afnemende allergeenconcentraties die helpen bij het bepalen van de allergische concentratie die de respons van 50% basofielen of EC50 induceert. Eerst werden lymfocyten afgesloten van de zijverstrooiings-voorwaartse spreidingsgrafiek.

Vervolgens werden basofielen uit de lymfocytenpopulatie verwijderd als CCR3 + CD203c + -cellen. Vervolgens werd een CCR3-CD63-plot gebruikt om basofiele activering te analyseren met behulp van CD63 als activeringsmarker voor twee geneesmiddelen en verschillende concentraties van een allergeen. De test wordt uitgevoerd met vers volbloed en mag niet langer dan 24 uur na bloedextractie worden uitgevoerd.

De stimulus die in de test wordt gebruikt, mag geen hulpstoffen bevatten en de chemische kenmerken van de geneesmiddelen moeten worden overwogen. Andere aanvullende in vitro methoden voor de diagnose van IgE-gemedieerde allergische reacties, of de bepaling van sIgE, of de histamineafgiftetest.