Immunofluorescente etikettering van plantenvirussen en insectenvectoreiwitten in hemipterandarmen

Dit protocol kan worden gebruikt om verschillende bewegingen in insecten, functies van insecteneiwitten en interacties tussen virus en vectorinsect in vivo te bestuderen. Deze methode is efficiënt en informatief. De structuren van de insectendarm en de hulpcellen worden duidelijk gevisualiseerd wanneer ze worden bekeken met de laserscannende confocale microscopie.

Lu Zhang, PhD van ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen, breng niet-virulifere insecten over van glazen bekers naar vers zuidelijk rijstzwart gestreept dwergvirus, SRBSDV, geïnfecteerde rijstplanten bedekt met een insectenbestendig net voor een toegangsperiode van twee dagen tot virusverwerving. Verzamel vervolgens de insecten in glazen bekers met verse rijstzaailingen.

Verzamel na twee dagen de insecten uit de glazen bekers met behulp van een handmatige aspirator voor dissectie en excisie van de darm. Bereid 0,01 kies PBS, 4% paraformaldehyde en 2% Triton X-100 voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik een pipetter om 100 microliter PBS op een glazen dia te plaatsen en plaats de dia op het podium van een optische microscoop.

Gebruik handmatige aspirator om de SRBSDV-geïnfecteerde volwassenen uit de glazen bekers te verzamelen en plaats ze in een buis van 1,5 milliliter op ijs om de insecten te verlammen. Breng een verlamde volwassene over in de 100 microliter PBS op de glijbaan met de buik omhoog. Gebruik een pincet om het lichaam vast te klemmen en verwijder het hoofd met een ander pincet.

Klem met een pincet de zijkanten van de buik vast en klem de legboor of het copulatorische orgaan van de staart met de andere set vast en trek vervolgens voorzichtig aan het intersegmentale membraan van een buiksegment om de darm in de buik langzaam bloot te leggen. Ga door met het wegscheuren van het membraan en trek geleidelijk de volledige darm uit de buik. Trek voorzichtig de staart af die verbonden is met het uiteinde van de darm om de volledige darm te verwijderen.

Plaats weggesneden ingewanden in een centrifugebuis van 200 microliter. Voeg 200 microliter PBS toe aan de buis en gebruik een pipet om de ingewanden grondig te wassen. Gebruik een pipetter om 100 microliter PBS op een glazen dia te plaatsen en plaats de dia op het podium van een optische microscoop.

Gebruik handmatige aspirator om de SRBSDV-geïnfecteerde nimfen uit glazen bekers te verzamelen en plaats ze in een buis van 1,5 milliliter die op ijs is geplaatst om de insecten te verlammen. Breng een verlamde nimf over in de 100 microliter buffer op de glijbaan met de buik naar boven gericht. Maak de staart van de nimf los, klem vervolgens het insectenlichaam vast om het voorzichtig te fixeren en gebruik het andere paar om het hoofd te klemmen.

Trek het hoofd voorzichtig weg van het lichaam terwijl je nog steeds zijn aanhechting aan de darm behoudt, zodat het hoofd loskomt van het lichaam, maar de darm nog steeds vastzit aan de thorax en de buik. Met het pincet nog steeds klemmend op het lichaam, gebruik je het andere paar om het hoofd voorzichtig te bewegen en geleidelijk de darm eruit te trekken. Maak de darm los van het hoofd om een intacte darm te verkrijgen zonder het lichaam te beschadigen.

Plaats de weggesneden ingewanden in een buis. Voeg PBS toe aan de buis en zuig zachtjes de oplossing los met een pipet om de ingewanden grondig te wassen. Bereid de antilichamen en het montagemedium voor zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Plaats de vers uitgesneden en PBS gewassen WBPH-darmen in 100 microliter 4% paraformaldehyde in een centrifugebuis van 200 microliter bij kamertemperatuur. Vervang na twee uur de paraformaldehyde-oplossing door 200 microliter PBS. Verwijder na 10 minuten de PBS om paraformaldehyde te verwijderen en herhaal de PBS-wasstap twee keer.

Voeg na twee PBS-wasbeurten 200 microliter niet-ionisch wasmiddel Triton X-100 toe om de monsters bij kamertemperatuur te permeabiliseren. Verwijder na 30 minuten de Triton X-100 en was het resterende wasmiddel weg met drie wasbeurten van 10 minuten met PBS. Verdun de gelabelde antilichamen één tot 50 met 50 microliter bull serum albumine.

Voeg de verdunde antilichamen toe aan de buis en incubeer de monsters 's nachts bij vier graden Celsius. Spoel op de ochtend na het verwijderen van het antilichaam het resterende antilichaamverdunningsmiddel weg met drie wasbeurten van 10 minuten met PBS. Verdun een microliter DyLight 633-falloidine met 50 microliter PBS en voeg 50 microliter verdund falloïdine toe aan de buis voor een incubatie van twee uur bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van falloïdine, spoel de resterende falloidine grondig weg met drie wasbeurten van 10 minuten met PBS. Plaats een druppel montagemedium met DAPI op een microscoopglaasje. Breng de ingewanden over op het medium en plaats het afdekglas voorzichtig over het monster zonder bubbels te creëren.

De representatieve laserscanning confocale micrografie van weggesneden WBPH-darmen van volwassenen na etikettering met falloidine toonde drie secties: het foregut, midgut en hindgut. Onder deze, midgut is de initiële infectie plaats van SRBSDV. De monolaagse epitheelcelstructuur van de darm vergemakkelijkt de studie van de cellulaire lokalisatie van insecteneiwitten en colocalisatie van virale en insecteneiwitten.

Weggesneden WBPH-darmen met DyLight 488 gelabeld anti-VAMP-7 en SRBSDV-virionen met DyLight 549 gelabeld anti-SRBSDV-antilichaam worden hier getoond. VAMP-7- en SRBSDV-virionen bleken samen te lokaliseren in het cytoplasma, wat suggereert dat VAMP-7 een rol kan spelen bij virusoverdracht in vivo. Permeabilized darmen moeten grondig worden gereinigd na incubatie met luciferine geconjugeerde antilichamen om de achtergrond en niet-specifieke binding te verminderen.

Dit is een betrouwbare methode om de lokalisatie van virussen, andere pathogenen en insecteneiwitten in insecten te bekijken. Het biedt de basis voor verdere studies van de relatie tussen pathogenen en insecten.