Multifactoriële beoordeling van motorisch gedrag bij ratten na unilaterale ischias zenuw crush letsel

Het algemene doel van dit protocol is om de procedures te beschrijven die betrokken zijn bij het uitvoeren van onherproduceerbare ischiaszenuwverplettering en om een protocol te bieden voor de beoordeling van motorisch gedrag na perifeer trauma. De selectie van een krachtige en betrouwbare gedragstestbatterij is essentieel om een breed scala aan gedragsaspecten te dekken en hangt af van het gebruikte diermodel en de vraag naar wetenschappelijk onderzoek. Dit protocol beschrijft in detail hoe een heupzenuwverpletteringsletsel moet worden uitgevoerd en biedt een gedragstestbatterij voor de beoordeling van motorische tekorten bij ratten, waaronder de open veldtest, de CatWalk-ganganalyse, de balklooptaak en de ladderlooptaak.

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de toepasselijke nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren. Zorg voor een steriele omgeving tijdens de hele chirurgische ingreep. Stel de operatietafel in met de benodigde apparatuur.

Verdoof de rat diep in een gesloten kast met isofluraan en scheer een uitgebreid deel van de rechter achterpoot. Plaats vervolgens de rat in het anesthesiemasker en ga door met diepe anesthesie met isofluraan. Bevestig de romp en beide achterpoten van de rat met tape.

Plaats beide achterpoten in een symmetrische en uitgestrekte positie en draai elke poot plat op de operatietafel. Desinfecteer de huid van het geschoren gebied met een geschikt antisepticum. Zoek naar de ischias inkeping van het ileum.

Maak een huidincisie van de ischias in de richting van de poot met een scalpel. Als de achterpoten zijn bevestigd en de huidincisie correct wordt uitgevoerd, is een holte in het fasciale vlak tussen de gluteus maximusspier en biceps femoris-spier te zien die lijkt op een witte lijn. Steek gesloten superfijne hemostatische tang in de holte en spreid de tang uit.

Het fasciale vlak moet zich openen zonder spierweefsel te verwonden. Plaats de rubberen band oprolmechanismen onder de spieren om de huidincisie open te houden. Verwijder voorzichtig omliggend weefsel en bloedvaten van de heupzenuw totdat de zenuw volledig is blootgesteld.

Het is belangrijk om de zenuw niet uit te rekken of te trekken tijdens de hele procedure. Verpletter de heupzenuw met een niet-gekartelde klem met constante en snelle bruikbare druk. Open hiervoor de klem, plaats de zenuw op de onderkaak van de klem en sluit de klem door deze 3 x 10 seconden in de eerste positie te vergrendelen.

Na het verbrijzelingsletsel moet u de klem voorzichtig opnieuw openen. de verbrijzelingsplaats van de heupzenuw lijkt doorschijnend. Verwijder de oprolmechanismen van de elastiek.

Sluit de fasciale vlakincisie met een resorbeerbare hechtdraad. Sluit de huidincisie met nietjes van de lichaamshuid. De motorische activiteit, evenals de gedragsactiviteit van ratten kunnen worden geanalyseerd door een open veldtest.

De opstelling van het open veld, dat zich in een donkere en rustige omgeving moet bevinden, bestaat uit het geautomatiseerde videovolgsysteem EthoVision XT en een arena met een krasbestendig, reinigbaar zwart oppervlak. Plaats de arena en de camera in de juiste positie en stel de EthoVision XT-software in. Plaats de rat voorzichtig in het midden van de testarena.

Tijdens de opname moet de experimenteerder uit de buurt blijven van het open veld dat is opgezet, om te voorkomen dat de rat wordt afgeleid. Ga voor de gegevensanalyse van de open veldtest naar de analysesectie in de linker zijbalk en kies Visualisatie bijhouden"onder het tabblad Resultaten". Exporteer vervolgens de benodigde parameters naar XL.Kies in de software een aantal variabelen uit verschillende categorieën voor gegevensanalyse.

Een ganganalyse door het CatWalk XT-systeem kan helpen om veel verschillende parameters te beoordelen met betrekking tot de voetafdrukken, houding en gang van diermodellen. Een glazen loopbrug wordt verlicht met groen licht en het licht dat wordt verspreid door de voetafdrukken van de dieren wordt vastgelegd met een high speed videocamera, die zich onder de loopbrug bevindt. De signalen kunnen worden geanalyseerd met de CatWalk XT-software.

Het experiment moet onder donkere omstandigheden worden uitgevoerd. Begin met het instellen van het CatWalk XT-systeem. Kies de experimentele instellingen.

Plaats de camera in positie en stel de scherpstelling in. Stel de detectie-instellingen in. Stel de gangwanden van het CatWalk-systeem in en zorg ervoor dat de wanden parallel aan de loopbrug blijven.

Definieer de lengte van de loopbrug en kalibreer de loopbrug. Maak vervolgens een achtergrondafbeelding. Voor de achtergrondafbeelding is een schone en lege loopbrug nodig.

De rat moet de loopbrug zonder onderbreking oversteken. Volgens de gedefinieerde run-criteria zijn drie conforme runs per rat nodig voor gegevensanalyse. Train dieren minstens acht dagen voordat je begint met het eigenlijke experiment.

De CatWalk moet minstens één keer per week worden uitgevoerd, met 6 tot 10 runs om een continue taakprestatie te garanderen. Evalueer voor gegevens analyse alleen de compatibele uitvoeringen. Classificeer pootafdrukken automatisch met de CatWalk XT-software.

Controleer de etiketten van de pootafdruk handmatig. Corrigeer verkeerde pootafdruklabels, voeg labels van niet-gedetecteerde pootafdrukken toe en verwijder eventuele ruis en verkeerde labels. De numerieke resultaten worden weergegeven in een XL-blad met een aantal basisparameters.

Voor meer gedetailleerde informatie over elke voetafdruk, classificeer de tenen van de achterpoten. Voor deze analyse is de interactieve module voetafdrukmetingen vereist. Stel de markeringen voor de voetafdrukanalyse handmatig in.

Analyseer elke achterpootafdruk in alle drie de conforme runs. Teken een lijn van het midden van de eerste teen naar het midden van de vijfde teen om de teenspreiding te meten. Teken een lijn van het midden van de tweede teen naar het midden van de vierde teen om de tussenliggende teenspreiding te meten.

Teken een lijn van het midden van de derde teen naar de hiel van de achterpoot om de handmatige afdruklengte te meten. Bekijk de numerieke resultaten van de interactieve voetafdrukmetingen die in een afzonderlijk blad worden weergegeven. Gangtekorten kunnen worden bepaald door de balkwandeling.

De focus van de balkwandeltaak in dit specifieke onderzoeksonderwerp zal liggen op de analyse van motorische coördinatie en niet op de beoordeling van de motorische balans. Voor de balkwandeling zijn een balk, afstandsbalk, tafel, uniforme achtergrond en een camcorder nodig. Gebruik een houten balk van 90 centimeter lang, 1,7 centimeter breed en 2 centimeter hoog.

Train de dieren zeven dagen. Plaats de rat op het startplatform van de balk. De rat moet de balk drie keer zonder onderbreking oversteken.

Zelfs als de rat binnen de eerste drie runs drie conforme runs bereikt, moeten er minimaal 6 tot 10 runs worden uitgevoerd voor continue taakprestaties. Selecteer de videosequenties van drie compatibele uitvoeringen van de opname. Definieer het begin-tijd punt en het eind tijd punt van de geselecteerde drie compatibele uitvoeringen.

Hier wordt het begintijdpunt gelabeld door een zwarte lijn op de balk en wordt de plaatsing van de eerste achterpoot achter de zwarte lijn gedefinieerd als het begintijdpunt van de run. De plaatsing van de eerste achterpoot op het platform aan het einde van de balk bepaalt het eindpunt. Bereken vervolgens de tijd die nodig is om de rat te dwarsliggeren.

Scoor het aantal stappen en fouten van drie compatibele runs voor beide achterpoten afzonderlijk, met behulp van de zoom- en slow motion-functie van de software. Fouten zijn onder meer totale voetslips en halve voetslips. Een totale voetslip wordt gedefinieerd als een voetplaatsing die wordt gevolgd door een diepe slip, waardoor het contact van de aangetaste poot met de balk verloren gaat.

Een halve slip wordt gedefinieerd als de poot die van de zijwand van de balk glijdt zonder volledig contact te verliezen. Bereken het percentage voetslips in verhouding tot het aantal stappen dat de balk moet oversteken. De ladderlooptaak kan de motorische functie, de plaatsing van zowel de voorste ledematen als de achterpoten en de coördinatie tussen de ledematen beoordelen.

Een ladder rung apparaat, spacer, tafel, uniforme achtergrond, en camcorder zijn nodig voor deze gedragstest. Het horizontale letter rung apparaat bestaat uit metalen sporten en heldere polycarbonaat zijwanden. Train de dieren acht dagen.

Plaats de rat op de startzone van de ladderloopoperators. De rat moet de 100 centimeter loopbrug van het ladderloopapparaat drie keer zonder onderbreking oversteken, om als een conforme run te kwalificeren. Selecteer de videosequenties van drie compatibele uitvoeringen van de opname.

Definieer het begin-tijd punt en het eind tijd punt van de geselecteerde drie compatibele uitvoeringen. De plaatsing van de achterpoot achter de eerste zwarte lijn op de zijwand van het apparaat bepaalt het begintijdpunt van de run. De plaatsing van de eerste voorste ledemaat achter de tweede zwarte lijn op de zijwand van het apparaat bepaalt het eindtijdpunt van de run.

Bereken vervolgens de duur van de run over de loopbrug. Scoor de drie compatibele runs met de schaal van 7 categorieën van Mets en collega's met behulp van de slow motion of de frame-by-frame-functie van de software. Bepaal het aantal stappen en het aantal fouten in overeenstemming met de categorieën van de schaal voor elk ledemaat afzonderlijk.

De schaal maakt onderscheid tussen de volgende categorieën. Totale misser. Diepe slip.

Lichte uitglijder. Replacement.Correction. Gedeeltelijke plaatsing. En juiste plaatsing.

Bereken vervolgens de fouten per stap. De representatieve resultaten van de vijf minuten durende open veldtest tonen aan dat de zenuwverpletteringsblessure, vijf weken na de operatie, geen effect heeft op de motorische activiteit. Ganganalyse met het CatWalk XT-systeem genereert veel verschillende parameters.

Significante veranderingen konden worden gedetecteerd voor de gemiddelde loopsnelheid, de paslengte en het afdrukgebied van de zenuwgewonde rechterachterpoot. Zenuwgewonde wilde type ratten vertoonden een aanzienlijk verhoogde latentietijd om de straal over te steken, vergeleken met wilde type naïeve ratten vijf weken na de verwonding. Als een extra uitlezing van de balkwandeltaak werden volledige uitglijders en halve slips van de zenuwgewonde achterpoot geteld en beschouwd als een fout voor statistische analyse.

Het percentage fouten per stap van de zenuwgewonde rechterachterpoot was aanzienlijk verhoogd bij zenuwgewonde wilde type ratten, vergeleken met wilde type naïeve ratten. Representatieve gegevens van de ladderlooptaak tonen geen significante veranderingen in de latentietijd om de loopbrug van het ladderloopapparaat over te steken, of in het percentage fouten per stap van de zenuwgewonde rechterachterpoot. De analyse van het foutpercentage per stap van de zenuwgewonde achterpoot beschouwde alleen de score van 0 tot 2 van de schaal van 7 categorieën van Mets en collega's.

Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u een ischiaszenuwverpletteringsletsel kunt uitvoeren en hoe u een multifactoriële beoordeling van motorisch gedrag bij ratten na eenzijdige ischiaszenuwverplettering kunt implementeren. Om consistente, reproduceerbare en vergelijkbare resultaten te bereiken na een ischias zenuwverpletteringsletsel, is een gestandaardiseerde methode voor het induceren van de zenuwverplettering essentieel, evenals een gestandaardiseerde fenotypische karakterisering. Een goede training voor specifieke gedragstest biedt de voordelen van tijdsbesparing tijdens de experimentbeoordeling en het behalen van betere resultaten.