Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen
5 juni 2021
De krimp van tandcement tijdens het uitharden verdringt de bodemplaat. Dit protocol minimaliseert het probleem door een eerste fundering van het tandcement te creëren dat ruimte overlaat om de bodemplaat te cementeren. Weken later kan de bodemplaat op deze steiger worden gecementeerd met weinig nieuw cement, waardoor krimp wordt verminderd.
Deze miniscoop kan het krimpprobleem met tandcement tijdens de bodemplaatprocedure verminderen en het slagingspercentage van miniscoopregistraties van fluorescentiesignalen in configuraties met twee lengtes verhogen. Als de fluorescentietransiënt niet kan worden waargenomen tijdens baseplating, controleer dan de expressie van de calciumindicator en de locatie van een relaislens op het hersensegment. Begin met het monteren van de binnenste naald van een 20 gauge intraveneuze katheter met een diameter van één millimeter op de stereotaxische arm.
Laat de katheter in de ventrale maïsammonis 1 in het doelgebied zakken. Laat vervolgens de micro-injectienaald met een snelheid van 100 tot 200 micrometer per minuut in de ventrale cornu ammonis 1 zakken en injecteer 200 nanoliter van de virale vector in het doelgebied met een snelheid van 25 nanoliter per minuut. Nadat u het virus gedurende 10 minuten hebt laten diffunderen, trekt u de micro-injectienaald op met een snelheid van 100 tot 200 micrometer per minuut.
Na het desinfecteren van de relaislens, weekt u de lens in koude pyrogene-vrije zoutoplossing tot implantatie. Gebruik een micro bulldogklem met krimpkous, houd de relaislens vast en plaats deze bovenop het doelgebied met een snelheid van 100 tot 200 micrometer per minuut. Stabiliseer vervolgens de lens met tandcement.
Om een miniscoop in te stellen, bevestigt u de objectieflens aan de onderkant en monteert u de basisplaat op de miniscoop. Wikkel 10 centimeter paraffinefilm rond de buitenkant van de bodemplaat. Gebruik herbruikbare kleefklei om de miniscoop vast te houden met de stereotaxische armsonde.
Lijn de objectieflens uit op de relaislens met zo min mogelijk ruimte tussen de lenzen. Gebruik tandcement om de positionering van de bodemplaat te beveiligen, zodat het cement alleen de paraffinefilm raakt. Wanneer het tandcement is opgedroogd, verwijdert u de paraffinefilm, de basisplaat en de miniscoop, waardoor de tandheelkundige cementbasis hol blijft.
Sluit de relaislens af met vormrubber en bedek het siliconenrubber met een dun laagje tandcement. Ontkoppel de muis van de stereotaxische instrumenten en plaats de muis in een herstelkamer. Snijd voor baseplating de dunne laag van het tandheelkundige cementdak voorzichtig met een botrongeur en verwijder het siliconenrubber.
Reinig het oppervlak van de relaislens met 75% alcohol. Bevestig de stelschroef naast de bodemplaat om deze aan de onderkant van de miniscoop te bevestigen. Pas de scherpstelschuif aan op ongeveer 2,7 tot 3 millimeter van de hoofdbehuizing.
Wanneer de instelling is voltooid, sluit u de miniscoop aan op het data-acquisitiebord en sluit u de miniscoop aan op een USB 3.0-poort op een computer. Voer de data-acquisitiesoftware uit die is ontwikkeld door het UCLA-team. Pas de belichting aan op 255, de versterking op 64x en de excitatie-LED op 5% Om de miniscoop aan te sluiten op de data-acquisitiesoftware, klikt u op de verbindingsknop en bekijkt u de livestream van de data-acquisitiesoftware, rekening houdend met de marge van de relaislens als een oriëntatiepunt.
Zodra de relaislens is gevonden, lijnt u de miniscoopobjectieflens met de hand uit op de relaislens. Door de verschillende hoeken en afstanden van de miniscoop aan te passen, begint u te zoeken naar de fluorescentiesignalen. Houd de miniscoop op de optimale positie, beweeg de stereotaxische arm naar de mini-scope en hecht de miniscoop aan de stereotaxische arm met herbruikbare kleefklei.
Zoek naar de beste weergave door de X-, Y- en Z-armen enigszins aan te passen. Pas de hoek tussen het oppervlak van de objectieflens en de relaislens aan door de oorstang, tandstaaf of herbruikbare kleefklei op de Z-as te draaien. Virale expressie en lensimplantatie zijn succesvol wanneer ten minste één cel fluorescentietransiënten verplaatst tijdens baseplating.
Bevestig de basisplaat stevig met de kleinst mogelijke hoeveelheid tandcement terwijl u het interessante gebied bewaakt om ervoor te zorgen dat de optimale positie niet verandert. In de representatieve studie bleek de procedure van dummy baseplating voordelig omdat het resulteerde in een kleinere verschuiving in de locatie van de bodemplaat dan de oorspronkelijke procedure. De verschuiving van de bodemplaat werd ook beïnvloed door de hoogte van het tandcement.
De bodemplaat die 0,5 centimeter boven de schedel was verankerd, verschoof aanzienlijk minder dan de bodemplaat die een centimeter boven de schedel was bevestigd. In een voorbeeld van succesvolle beeldvorming tijdens de base plating procedure werden fluorescentietransiënten samen met bloedvaten opgemerkt in het verdoofde dier. Fluorescentietransiënten werden vijf dagen na baseplating waargenomen, zelfs wanneer de muis zich vrijelijk gedroeg in zijn thuiskooi met slechts een kleine verschuiving in een positie.
Daaropvolgende calciumbeeldvorming van muizen werd uitgevoerd. In enkele gevallen traden er problemen op tijdens de baseplating-procedure, zoals de afwezigheid van iets anders dan een uniforme achtergrond of zichtbaarheid van witte celmarges. zonder fluorescentietransiënten.
Het is belangrijk om de bodemplaat stevig op het doelgebied te bevestigen met de kleinst mogelijke hoeveelheid tandcement. Met leisteentechniek kunnen onderzoekers longitudinaal neurale activiteit hierover observeren. Met de juiste licentie kan deze procedure ook van toepassing zijn op het observeren van het neurale netwerk in het gezichtsveld.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presente করে een gedetailleerd protocol voor het minimaliseren van uitlijningsproblemen tijdens het bevestigen van de basisplaat bij UCLA V3 miniscopen die worden gebruikt voor in vivo calcium-imaging in muizen. De methode pakt het probleem van krimp van tandheelkundig cement aan, wat de afstand tussen het objectief en de relaislenzen kan veranderen, wat leidt tot een slechte beeldkwaliteit. Door een uitgeharde basis van tandheelkundig cement te creëren voordat de basisplaat definitief wordt bevestigd, verbetert dit protocol de stabiliteit en het succespercentage van miniscoope-opnames, in het bijzonder bij configuraties met twee lenzen voor deep brain imaging.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- In vivo imaging
- Calcium imaging
Achtergrond
- Miniscopen maken de observatie van neuronale activiteit in vrij bewegende dieren mogelijk.
- De UCLA V3 Miniscope is een veelgebruikt open-source apparaat voor fluorescentie-imaging.
- Imaging van diepe hersengebieden vereist een nauwkeurige uitlijning van de objectief- en relaislenzen.
- Krimp van tandcement tijdens het uitharden kan leiden tot misuitlijning en een verslechtering van de beeldkwaliteit.
Doel van de studie
- Om een protocol te bieden dat misuitlijning vermindert die wordt veroorzaakt door krimp van tandcement tijdens het aanbrengen van de basisplaat.
- Om de betrouwbaarheid en kwaliteit van fluorescentie-opnames met een miniscoop bij muizen te verbeteren.
- Om stabiele, longitudinale beeldvorming van neuronale activiteit in diepe hersengebieden mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Injectie van virale vectoren voor expressie van calciumindicatoren in doelgebieden van de hersenen.
- Implantatie van een relaislens in de regio ventral cornu ammonis 1 (CA1).
- Stabilisatie van de relaislens met tandcement en vormrubber van silicone.
- Voorbereiding van een holle basis van tandcement met paraffinefolie om het volume van het nieuwe cement tijdens de definitieve plaatmontage te minimaliseren.
- Uitlijning en fixatie van de basisplaat van de miniscoop met een minimale hoeveelheid tandcement terwijl fluorescentiesignalen worden gemonitord.
- Gebruik van software voor gegevensverwerving voor real-time beeldvorming en verificatie van de uitlijning.
Belangrijkste resultaten
- De dummy-baseplatingprocedure resulteerde in kleinere verschuivingen van de locatie van de basisplaat in vergelijking met de oorspronkelijke methode.
- Basisplaten die dichter bij de schedel waren verankerd (0,5 cm) vertoonden minder positionele verschuiving dan platen die verder weg waren gefixeerd (1 cm).
- Succesvolle beeldvorming toonde duidelijke fluorescentietransiënten en bloedvaten in geanestheseerde en vrij bewegende muizen.
- Stabiele fluorescentiesignalen werden waargenomen tot vijf dagen na baseplating met minimale positionele drift.
- Incidentele problemen omvatten de afwezigheid van fluorescentietransiënten of enkel achtergrondsignalen, wat het belang van nauwkeurige uitlijning en virale expressie benadrukt.
Conclusies
- Het beschreven protocol minimaliseert effectief misuitlijning door krimp van tandheelkundig cement tijdens het plaatsen van de miniscope-basisplaat.
- Het gebruik van een vooraf uitgeharde basis van tandheelkundig cement maakt stabiele, hoogwaardige beeldvorming in diepe hersengebieden mogelijk.
- Deze aanpak ondersteunt longitudinale studies naar neurale activiteit bij vrij bewegende muizen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare in vivo calcium-imaging bij vrij bewegende muizen is essentieel voor translationele neurowetenschappen en ontdekkingspijplijnen in de neurofarmacie. Dit protocol pakt een belangrijke technische bottleneck aan — het minimaliseren van misuitlijning tussen miniscope-lenzen als gevolg van krimp van tandhechtcement — waardoor de datakwaliteit en reproduceerbaarheid in longitudinale studies naar neurale activiteit worden verbeterd. Verhoogde imagingsstabiliteit ondersteunt direct de targetvalidatie en mechanische risicoreductie in preklinische neurobiologische portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt robuuste analyse van de functie van neurale circuits in ziekterelevante modellen mogelijk.
- Vermindert technische artefacten, wat zorgt voor een hogere voorspellende betrouwbaarheid van de uitlezingen van de neuronale activiteit.
- Faciliteert de functionele validatie van targets door stabiele, longitudinale beeldvormingscondities te waarborgen.
Screening en Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde workflow voor het voorbereiden van gevalideerde imagingsystemen in vrij bewegende dieren.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en kwantitatieve betrouwbaarheid van fluorescentiegebaseerde neurale assays.
- Ondersteunt de schaalbare inzet van miniscopes voor compound screening in de neurofarmacologie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door stabiele, herhaalde beeldsessies te ondersteunen.
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door dynamische neurale activiteit vast te leggen in fysiologisch relevante contexten.
- Vermindert het risico op gegevensverlies of verkeerde interpretatie als gevolg van technische misuitlijning.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol bevindt zich op het snijvlak van discovery biology en preklinische modelvalidatie en ondersteunt workflows van vroege hypothesetoetsing tot lead-identificatie in neurofarmaceutische pipelines.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesegestuurde analyse van neurale circuits door beeldingsgetrouwheid te waarborgen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs voor studies naar verbindingen of genetische perturbaties.
- Analytica: Maakt betrouwbare meting van calciumtransiënten mogelijk, wat statistische vergelijking tussen experimentele condities faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Biedt stabiele beeldvorming voor longitudinale biomarkerstudies in vrij bewegende diermodellen.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar, gestandaardiseerd beeldingsplatform voor diverse neurowetenschappelijke R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar neurale activiteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert procedures voor baseplating en imaging, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door technische faalpercentages en datavariabiliteit te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van neurobiologische targets en modellen voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie en in vivo beeldvormingstechnieken.
- Toegang tot miniscopen, software voor gegevensverwerving en precieze instrumenten voor het hanteren van tandcement is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van chirurgische en beeldvormingsprotocollen over teams heen voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse hersengebieden en genetisch gecodeerde indicatoren met protocolspecifieke aanpassingen.
- Afhankelijk van succesvolle virale expressie en precieze plaatsing van de lens voor optimale resultaten.
