Name: Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Leer bioluminescentiebeeldvorming voor longitudinaal onderzoek naar urineweginfecties bij muizen. Deze methode biedt real-time inzicht in infectieverloop en vermindert het aantal benodigde dieren aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO Vlaanderen; G0A6113N), de Onderzoeksraad van de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. en W.E.) en de VIB (naar T.V.). W.E. is senior klinisch onderzoeker van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO Vlaanderen). De soort UTI89-lux was een gulle gift van prof. seed's laboratorium13.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Gemeenschapsraad en werden goedgekeurd door de Commissie Voor Dierethiek van de KU Leuven (P158/2018).
1. Kweken van bacteriën (aangepast van7,13,14)
<ol><li>Voorbereiding<ol>
<li>Kies een luminescerende UPEC-soort die het beste past bij de experimentele behoeften. OPMERKING: Hier werd het klinische cystitis-isolaat, UTI89 (E. coli), geselecteerd vanwege zijn uropathogene capaciteit bij zowel mensen als knaagdieren, en het algemene gebruik ervan in muizen UTI-modellen5,7,15. De bioluminescente isogene stam die het volledige lux operon (luxCDABE) draagt, wordt verder aangeduid als UTI89-lux. Deze operon draagt ook kanamycinesulfaat (Km) resistentiegenen. Daarom kan Km worden gebruikt om bioluminescente kolonies te selecteren13.</li>
		<li>Maak een correlatiecurve voor de kve en optische dichtheid bij 600 nanometer (OD 600 nm) voor de gekozen bacteriestam7.<ol>
<li>Om dit te doen, kweken bacteriën (met behulp van het onderstaande protocol) en maken 8 verschillende verdunningen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Meet de OD bij 600 nm voor al deze verdunningen en plaats ze op Luria-Bertani (LB) platen om de CFU te bepalen.</li>
			<li>Zet de OD 600 nm-waarden en de KVE-waarden uit om de correlatie te bepalen en een standaardcurve te verkrijgen. OPMERKING: Meet voor toekomstige experimenten de OD bij 600 nm en gebruik deze standaardcurve om een onmiddellijke schatting van de kve in een bacteriële oplossing te krijgen. LET OP: UPEC zijn pathogene bacteriën, zorg ervoor dat kamers goed zijn uitgerust en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Drie dagen voor de instillatie<ol>
<li>Verkrijg enkele kolonies door de glycerolvoorraad bacteriën uit te streep, met behulp van een inentingslus, op LB-platen aangevuld met 50 μg / ml km en 's nachts te kweken bij 37 ° C. Sluit deze platen af met een paraffinefilm om tot 1 week bij 4 °C te bewaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Twee dagen voor de instillatie<ol>
<li>Vul een steriele 14 ml polystyreen ronde onderbuis met dubbele positie snap caps met 5 ml LB bouillon aangevuld met 50 μg / ml Km. Kies een enkele bacteriekolonie met een inentingslus en voeg dit toe aan de LB-bouillon. Vortex voor 10 s om een goede menging te garanderen.</li>
		<li>Cultuur statisch met de klikdop in de open positie bij 37 °C gedurende de nacht. OPMERKING: Statische groei van E. coli bevordert de expressie van type 1-pili, die van cruciaal belang zijn voor de hechting aan en invasie van urine-epitheelcellen.</li>
		<li>Bereid een steriele Erlenmeyer of kweekkolf.</li>
	</ol></li>
	<li>Een dag voor de instillatie<ol>
<li>Na de incubatie vortex de buis gedurende 10 s om een goede homogenisatie van de bacteriecultuur te garanderen. Maak een subcultuur in de Erlenmeyer door 25 μL van de bacteriële suspensie toe te voegen aan 25 ml vers LB-medium zonder antibiotica.</li>
		<li>Sluit de Erlenmeyer en kweek statisch bij 37 °C 's nachts.</li>
	</ol></li>
	<li>Op de dag van instillatie<ol>
<li>Vortex de Erlenmeyer gedurende 10 s om een goede menging te garanderen.</li>
		<li>Giet de cultuur van de Erlenmeyer in een kweekbuis van 50 ml en centrifugeer bij 3.000 x g en 4 °C gedurende 5 minuten. Decanteer het supernatant en resuspend de bacteriële pellet in 10 ml steriel PBS en vortex opnieuw gedurende 10 s.</li>
		<li>Kies de experimentele concentratie van het entmateriaal (CFU) en gebruik de standaardcurve verkregen in stap 1.1.2 om de overeenkomstige OD 600 nm te bepalen.</li>
		<li>Voeg 1 ml van de geresuspendeerde bacteriecultuur toe aan 9 ml steriel PBS en controleer de OD bij 600 nm. Pas verder aan door steriele PBS of geconcentreerde bacteriële oplossing toe te voegen, totdat de gewenste OD 600 nm is bereikt7. OPMERKING: Pas bijvoorbeeld voor UTI89-lux de cultuur aan door PBS toe te voegen totdat de OD 600 nm 0,45 bereikt, wat overeenkomt met 2 x 107 CFU / 50 μL. Om het aantal levensvatbare CFU's te verifiëren, maakt u 10-voudige seriële verdunningen en plaat 50 μL van de vijfde en zesde 10-voudige verdunningen op LB-platen in drievoud om minder dan 300 kolonies te verkrijgen. Tel de verkregen kolonies de volgende dag na nachtelijke incubatie bij 37 °C. OD 600 nm geeft een onmiddellijke uitlezing, maar gebruik CFU als kwaliteitscontrole.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inenting van de dieren (aangepast van7,16)
<ol><li>Voorbereiding van de dieren<ol>
<li>Kies de gewenste muizenstam(en) afhankelijk van de onderzoeksvraag en beschikbaarheid van knock-outlijnen, experimentele details en verschillen in UTI-gevoeligheid5,17. Houd er rekening mee dat transurethrale katheterisatie gemakkelijker is bij vrouwelijke muizen. Gebruik geen dieren jonger dan 8 weken, omdat ze immunologisch onvolwassen zijn. Hier werden 12 weken oude vrouwelijke C57Bl/6J muizen gebruikt.</li>
		<li>Bestel dieren ruim van tevoren en laat ze acclimatiseren, idealiter voor 7 dagen. Groepshuisdieren in individueel geventileerde kooien, onder standaard 12 uur licht/donker omstandigheden.</li>
		<li>Scheer het abdominale gebied van de dieren om het signaalverlies te beperken. Gebruik geen ontharingscrème, omdat dit de huid van de dieren snel kan verbranden. Houd het dier in bedwang door het nekvel en de achterpoten stevig vast te houden met de niet-dominante hand terwijl je scheert met de dominante hand. Als alternatief, scheer onder isofluraan anesthesie. OPMERKING: Dieren werden 2 dagen voorafgaand aan de beeldvorming geschoren, aangezien de dieren het geschoren gebied nog verder zullen verzorgen.</li>
		<li>Zorg voor water en standaard voedsel ad libitum gedurende het hele experiment. Beroof dieren echter 2 uur voorafgaand aan indruppeling van water om het blaasvolume tijdens het indruppelen te minimaliseren.</li>
		<li>Monteer een steriele 24 G angiocatheter tip op een spuit van 100 μL en vul de spuit met de bacteriële oplossing bereid in stap 1.5.3. OPMERKING: Om de achtergrondluminantie te bepalen, moet u voorafgaand aan de instillatie een basislijnbeeld verkrijgen (zie stap 3 hieronder).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instillatie van de dieren<ol>
<li>Plaats de dieren in een inductiekamer en verdoof ze met inademing van isofluraan met zuivere zuurstof als dragergas (inductie bij 3% en onderhoud bij 1,5%).</li>
		<li>Plaats één dier op een werkoppervlak in rugligging en zorg voor een stabiele isofluraan-anesthesie met behulp van een neuskegel tijdens de instillatie. Breng de oogzalf aan.</li>
		<li>Verdrijft de resterende urine door zachte compressie toe te passen en cirkelvormige bewegingen te maken op het suprapubische gebied. Reinig de onderbuik met 70% ethanol voorafgaand aan het indruppelen.</li>
		<li>Smeer de kathetertip in met een normale zoutoplossing. Leg de wijsvinger van de niet-dominante hand op de buik en duw deze zachtjes omhoog. Start de katheterisatie van de urethra in een hoek van 90° (verticaal) en zodra weerstand wordt ondervonden, kantelt u deze horizontaal voordat u deze verder inbrengt (0,5 cm). OPMERKING: Duw nooit krachtig op de katheter, omdat dit schade aan de urethra zal veroorzaken. Zachte draaibewegingen kunnen nuttig zijn bij het inbrengen van katheters. Aan de andere kant duidt een gebrek aan weerstand meestal op een verkeerde inbrenging in de vagina.</li>
		<li>Voer een langzame (5 μL/s) instillatie uit van 50 μL van het bacteriële entmateriaal (2 x 107 KVE). OPMERKING: Hogere volumes of snellere instillatie kunnen reflux naar de nieren veroorzaken. Tijdens het oefenen van de techniek kan blauwe inkt worden gebruikt om reflux te evalueren.</li>
		<li>Houd na de instillatie de spuit en katheter nog een paar seconden op zijn plaats en trek dan langzaam terug om lekkage te voorkomen. Registreer eventuele onregelmatigheden zoals een hoge mate van lekkage of een bloederige meatus en sluit dieren uit, indien nodig.</li>
		<li>Plaats het dier in rugligging bij de neuskegel van de beeldvormingskamer en herhaal de voorgaande stappen 2.1.1-2.1.6 voor alle resterende dieren. Gebruik één katheter per experimentele groep. Zorg ervoor dat de anesthesie wordt voortgezet en minimaliseer de tijd tussen het eerste en het laatste dier.</li>
		<li>Dien indien nodig antibiotica of experimentele geneesmiddelen toe, voorafgaand aan of na de beeldvorming (stap 3). Om bijvoorbeeld enrofloxacine toe te dienen, voegt u 40 μL van de enrofloxacine (100 mg / ml) oplossing toe aan 3,96 ml fysiologische zoutoplossing om een 1/100 verdunning te verkrijgen. Injecteer 100 μL/10 g subcutaan om 9.00 uur en 17.00 uur om tweemaal daags 10 mg/kg enrofloxacine toe te dienen gedurende 3 dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Beeldvorming van bioluminescentie
<ol><li>Voorbereiding en selectie van beeldvormingsparameters<ol>
<li>Open de BLI-acquisitiesoftware (zie Materiaaltabel)en klik op Initialiseren in het beeldverwerkingsapparaat (zie Materiaaltabel) om de camera en het podiumcontrollersysteem te testen en de CCD-camera te koelen tot -90 °C. OPMERKING: Tijdens dit proces wordt de deur vergrendeld en kan de voortgang van de initialisatie worden gevolgd op het bedieningspaneel. Een groen lampje geeft aan dat de temperatuur van -90 °C is bereikt. Er verschijnt een waarschuwing als er een poging wordt gedaan om de initialisatie te laten zien voordat de initialisatie is voltooid.</li>
		<li>Zorg ervoor dat gegevens automatisch worden opgeslagen: Klik op acquisitie Automatisch opslaan in en selecteer de juiste map.</li>
		<li>Selecteer Luminescentie en Foto . Controleer de standaard luminescentie-instellingen: Stel excitatiefilter in op Blokkeren en emissiefilter op Openen.</li>
		<li>Stel de belichtingstijd in op Automatisch bij het maken van de eerste opname, vooral wanneer u een zwak signaal verwacht om een voldoende aantal fotonen te garanderen. Voor in vivo metingen en heldere signalen stelt u de belichtingstijd in op ~30 s. Als de afbeelding verzadigd is, verschijnt er een waarschuwing. Als dit gebeurt, verkort dan de belichtingstijd.</li>
		<li>Selecteer het medium Binning, F/stop 1 en kies het juiste gezichtsveld(FOV)(D voor 5 dieren).</li>
		<li>Stel de hoogte van het onderwerp in op 1 cm bij het afbeelden van muizen.</li>
		<li>Klik drie keer op Toevoegen in het Configuratiescherm acquisitie om een reeks van drie afbeeldingen te verkrijgen, terwijl de technische replicaties worden uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldvorming<ol>
<li>Plaats muizen in de beeldvormingskamer in rugligging en gebruik de spruitstuk neuskegel om de anesthesie (isofluraan 1,5%) gedurende het hele experiment te handhaven. Stel maximaal 5 muizen tegelijk in beeld en scheid de dieren met behulp van de lichtbaffle om reflectie te voorkomen.</li>
		<li>Sluit de deur en klik op Verwerven om de beeldvormingssequentie te starten.</li>
		<li>Vul gedetailleerde informatie in over het experiment (wildtype en knock-out dieren, behandelingen, dag van beeldvorming, enz.). De beeldvormende instellingen, zoals belichtingstijd, worden automatisch opgeslagen.</li>
		<li>Verwijder muizen uit de beeldvormingskamer en breng ze terug naar hun kooi. Controleer op het volledige herstel na anesthesie. Binnen enkele minuten moeten de dieren volledig wakker en exploratief zijn. Geef geen analgesie omdat dit de UTI-cursus kan verstoren18.</li>
		<li>Breng de kooien terug naar de geventileerde rekken tot de volgende beeldvormingscyclus. Euthanaseer de dieren na voltooiing van het experiment door CO 2-verstikking of cervicale dislocatie. Doe dit vóór het herstel van isofluraan-anesthesie om angst te minimaliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse van de beelden<ol>
<li>Start de beeldvormingssoftware en laad het experimentele bestand door op Bladerente klikken .</li>
		<li>Gebruik het gereedschapspalet om de kleurenschaal van de afbeelding aan te passen. Standaardiseer het visuele aspect van de resultaten door dezelfde instellingen te gebruiken voor alle afbeeldingen, d.w.z. gebruik een logaritmische schaal met een minimum van 104 tot een maximum van 107 fotonen. Deze aanpassingen hebben geen invloed op de ruwe gegevens, maar alleen op de grafische presentatie.</li>
		<li>Gebruik de ROI-tools om een interessegebied (ROI) op de afbeelding te tekenen. Zorg ervoor dat de ROI groot genoeg is om het volledige gebied te bestrijken en gebruik dezelfde afmetingen voor alle afbeeldingen. Hier werd een vierkante ROI van 3,5 cm x 4,5 cm over de onderbuik geplaatst.</li>
		<li>Klik op ROI-meting om de lichtintensiteit (tellingen of totale fotonenflux) te kwantificeren. Exporteer deze gegevens en gebruik het gemiddelde van de technische replicaties. OPMERKING: Tellingen vertegenwoordigen het aantal fotonen dat door de camera wordt gedetecteerd en mogen alleen worden gebruikt voor de beeldkwaliteitscontrole. Als u gegevens wilt rapporteren, gebruikt u de totale fotonenflux. De totale fotonenflux is fysiologisch relevanter omdat het het licht vertegenwoordigt dat door het oppervlak wordt uitgezonden en het een gekalibreerde eenheid is, die wordt gecorrigeerd voor de belichtingstijd (per seconde).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+urinary+tract+infections%3A+incidence%2C+morbidity%2C+and+economic+costs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li>
<li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128(2016).</li>
<li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li>
<li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease%3A+Practicalities%2C+implications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Crititical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li>
<li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li>
<li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li>
<li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257(2018).</li>
<li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li>
<li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+for+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798(1998).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women%3A+A+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Microbes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li>
<li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123(2019).</li>
<li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%3A+looking+beyond+the+light%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li>
<li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements%2C+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li>
<li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li>
<li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239(2015).</li>
<li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Voordelen van BLI ten opzichte van CFU-tellingen Longitudinale gegevens Een groot nadeel van de traditionele methode voor het tellen van KVE om microbiële belasting te kwantificeren, is de vereiste van postmortemorganogenaten, die slechts één transversaal gegevenspunt per dier opleveren. Omgekeerd maakt BLI niet-invasieve longitudinale follow-up van geïnfecteerde dieren mogelijk. De dieren kunnen 2 tot 3 keer per dag in beeld worden gebracht, waardoor gedetailleerd inzicht wordt verkregen ...

Urineweginfecties (UTI) behoren tot de meest voorkomende bacteriële infecties bij de mens. Bijna de helft van alle vrouwen zal tijdens hun leven een symptomatische urineweginfectie ervaren1. Infecties beperkt tot de blaas kunnen aanleiding geven tot urinewegsymptomen zoals toename van de urinefrequentie, urgentie, hematurie, incontinentie en pijn. Wanneer de infectie opstijgt naar de bovenste urinewegen, ontwikkelen patiënten pyelonefritis, met malaise, koorts, koude rillingen en rugpijn. Bovendien lijdt tot 20% van de patiënten met urineweginfecties aan terugkerende infecties, wat resulteert in een dramatische afname van de gevoeligheid voor antibiotica2,3,4. In de afgelopen jaren is er een groeiende belangstelling voor nieuwe therapieën voor de behandeling en preventie van terugkerende urineweginfecties. Ondanks een beter begrip van de aangeboren en adaptieve immuniteit van de lagere urinewegen en van de bacteriële virulentiefactoren die nodig zijn voor invasie en kolonisatie, zijn er geen radicale veranderingen in het behandelingsregime vertaald naar de dagelijkse urologische praktijk2. Om UTI pathogenese en gevoeligheid in vivo te bestuderen,is een reproduceerbare en niet-invasieve test onmisbaar.
Er zijn meerdere dierlijke UTI-modellen beschreven, variërend van nematoden tot primaten, maar het muizenmodel wordt voornamelijk gebruikt5,6. Dit model bestaat uit transurethrale katheterisatie van (vrouwelijke) muizen en daaropvolgende instillatie van een bacteriële suspensie, meestal uropathogene Escherichia coli (UPEC), rechtstreeks in het blaaslumen7. Na inenting wordt de bacteriële belasting traditioneel gekwantificeerd door kolonievormende eenheden (CFU) te bepalen. Deze techniek vereist het offeren van dieren om postmortemorgaanhomogenaten en seriële verdunningen te verkrijgen, waardoor de gegevensuitvoer en reproduceerbaarheid worden beperkt. Bovendien is longitudinale follow-up van de bacteriële belasting bij individuele dieren niet mogelijk met deze techniek.
In 1995 suggereerden Contag etal. het gebruik van bioluminescent-gelabelde pathogenen om ziekteprocessen bij levende dieren te volgen8,9. Sindsdien is bioluminescentiebeeldvorming (BLI) toegepast op tal van infectiemodellen zoals meningitis, endocarditis, osteomyelitis, huid- en wekedeleninfecties, enz.10,11,12. In het murine UTI-model kan een UPEC-stam met de complete lux operon (luxCDABE) van Photorhabdus luminescens worden gebruikt13. Een enzymatische reactie wordt gekatalyseerd door het bacteriële luciferase dat afhankelijk is van de oxidatie van langeketenaldehyden die reageren met gereduceerd flavine mononucleotide in aanwezigheid van zuurstof, wat het geoxideerde flavine, een lange-keten vetzuur en lichtoplevert 12. Het lux operon codeert voor de luciferase en andere enzymen die nodig zijn voor de synthese van de substraten. Daarom zullen alle metabolisch actieve bacteriën continu blauwgroen (490 nm) licht uitzenden zonder dat de injectie van een exogene substraat nodig is12. Fotonen die worden uitgezonden door lux-gelabeldebacteriën kunnen worden vastgelegd met behulp van zeer gevoelige, gekoelde CCD-camera's (Charge Coupled Device).
Het gebruik van bioluminescente bacteriën in een model voor UTI maakt de longitudinale, niet-invasieve kwantificering van de bacteriële belasting mogelijk, waardoor de noodzaak om dieren op vaste tijdstippen op te offeren tijdens de follow-up voor CFU-bepaling wordt weggelaten. Ondanks het brede scala aan mogelijkheden, het verzamelen van bewijs voor de robuustheid van deze BLI-techniek op andere gebieden en de voordelen ervan ten opzichte van klassieke modellen van UTI, is het niet op grote schaal geïmplementeerd in het UTI-onderzoek. Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde stapsgewijze handleiding en belicht de voordelen van BLI voor al het toekomstige UTI-onderzoek.

<table><tbody><tr><td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td><td>Corning</td><td>3925</td><td>voor in vitro beeldvorming</td></tr><tr><td>Aesculap ISIS</td><td>Aesculap</td><td>GT421</td><td>haartrimmer, met GT608 cap</td></tr><tr><td>Anesthesia vaporizer</td><td>Harvard apparatus limited</td><td>N/A</td><td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td></tr><tr><td>Baytril 100 mg/mL</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td>Enrofloxacine</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td><td>BD</td><td>382912</td><td>Gele angiocatheter, gebruik steriele plastic tip voor instillatie</td></tr><tr><td>C57Bl/6J muizen</td><td>Janvier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628146</td><td></td></tr><tr><td>Dropsense 16</td><td>Unchained Labs</td><td>Trinean</td><td>om OD 600nm te meten</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REF 14040-083</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70% gedenatureerd 5L</td><td>VWR international</td><td>85825360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14ml ronde bodem Polystyrene Tube, Snap-Cap</td><td>Corning</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50ml cellstart</td><td>Greiner</td><td>227285</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton GASTIGHT spuit, PTFE luer lock, 100 &micro;L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26203</td><td>om langzame bacteriële instillatie van 50 &micro;L te waarborgen</td></tr><tr><td>Inoculatie lus</td><td>Roth</td><td>6174.1</td><td>houder: Art. Nr. 6189.1</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>Dechra Veterinary products</td><td>N/A</td><td>Isofluraan</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>REF 124262</td><td>beeldvormingsapparaat</td></tr><tr><td>Kanamycine oplossing 50 mg/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging Software</td><td>PerkinElmer</td><td>N/A</td><td>BLI acquisitie software, versie 4.7.3</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>REF L3022</td><td>kan ook worden gemaakt</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth met agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>REF L2897</td><td>kan ook worden gemaakt</td></tr><tr><td>Petrischaal Sterilin 90mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>om te vullen met LB agar gesupplementeerd met Km</td></tr><tr><td>Pyrex Cultuurkolf 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLW1141/08-20EA</td><td></td></tr><tr><td>Slide 200 Trinean</td><td>Unchained Labs</td><td>701-2007</td><td>om OD 600nm te meten</td></tr><tr><td>UTI89-lux</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Genereus geschenk van Prof. Seed</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR international</td><td>444-1372</td><td></td></tr></tbody></table>

longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Urineweginfecties (UTI) behoren tot de meest voorkomende bacteriële infecties bij mensen en worden routinematig behandeld met empirische antibiotica. Door toenemende microbiële resistentie is de werkzaamheid van de meest gebruikte antibiotica echter afgenomen. Om alternatieve behandelingsopties te vinden, is er een grote behoefte aan een beter begrip van de pathogenese van UTI en de mechanismen die de gevoeligheid voor UTI bepalen. Om dit in een diermodel te onderzoeken, is een reproduceerbare, niet-invasieve test om het beloop van urineweginfecties te bestuderen onmisbaar.
Jarenlang was de gouden standaard voor het opsommen van bacteriële belasting de bepaling van Colony Forming Units (CFU) voor een bepaald monstervolume. Deze techniek vereist postmortale orgaanhomogenaten en seriële verdunningen, waardoor de gegevensuitvoer en reproduceerbaarheid worden beperkt. Als alternatief wint bioluminescentiebeeldvorming (BLI) aan populariteit om de bacteriële belasting te bepalen. Het labelen van pathogenen met een lux operon maakt de gevoelige detectie en kwantificering op een niet-invasieve manier mogelijk, waardoor longitudinale follow-up mogelijk wordt. Tot nu toe blijft de adoptie van BLI in UTI-onderzoek beperkt.
Dit manuscript beschrijft de praktische implementatie van BLI in een muis urineweginfectie model. Hier wordt een stapsgewijze handleiding gegeven voor het kweken van bacteriën, intravesicale instillatie en beeldvorming. De in vivo correlatie met CFU wordt onderzocht en een proof-of-concept wordt geleverd door de bacteriële belasting van onbehandelde geïnfecteerde dieren te vergelijken met met antibiotica behandelde dieren. Verder worden de voordelen, beperkingen en overwegingen die specifiek zijn voor de implementatie van BLI in een in vivo UTI-model besproken. De implementatie van BLI in het UTI-onderzoeksveld zal het onderzoek naar de pathogenese van UTI en de ontdekking van nieuwe manieren om UTI te voorkomen en te behandelen aanzienlijk vergemakkelijken.

In vivo BLI correleert met CFU van het entmateriaal op het moment van instillatie. Om de detectiegrens van BLI in vivo en de correlatie met CFU van het entmateriaal te evalueren, werden muizen geïnfecteerd met verschillende concentraties UTI89-lux en PBS als negatieve controle. Vóór instillatie werden niet-geïnfecteerde dieren gescand om de achtergrondluminescentie te bepalen. Latere beelden werden onmiddellijk na instillatie verkregen(...

Dit manuscript beschrijft de intravesicale toediening van uropathogene bacteriën met een lux operon om een urineweginfectie bij muizen te induceren en de daaropvolgende longitudinale in vivo analyse van de bacteriële belasting met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

De opsomming van kolonievormende eenheden beperkte de reproduceerbaarheid van onderzoek op het gebied van UTI. Bioluminescentie beeldvorming zal in vivo UTI-onderzoek naar blaasfysiologie, UTI pathogenese en gevoeligheid bevorderen. Bioluminescentie beeldvorming maakt longitudinale follow-up mogelijk met real-time inzicht in de evolutie van de infectie.Bovendien vermindert het drastisch het aantal dieren dat nodig is. Bioluminescentie beeldvorming vergemakkelijkt onderzoek naar terugkerende of chronische infecties, die vaak voorkomen bij mensen. Bovendien kunnen onderzoekers oplopende infecties of verspreiding naar het bloed identificeren met behulp van bioluminescentiebeeldvorming.Verkrijg enkele kolonies door de glycerolvoorraad bacteriën uit te streep met een inentingslus op LB-platen aangevuld met kanamycinesulfaat en 's nachts te kweken bij 37 graden Celsius. Vul een steriele 14 milliliter polystyreen ronde onderbuis, met snap caps met dubbele positie met vijf milliliter LB bouillon aangevuld met kanamycinesulfaat. Kies een enkele bacteriekolonie met een inentingslus en voeg dit toe aan de LB-bouillon.Vortex gedurende 10 seconden om een goede menging te garanderen. Cultuur sta

longitudinal-follow-up-urinary-tract-infections-their-treatment-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video zal aantonen methoden om transurethrally veroorzaken muis infecties van de urinewegen en kwantificeren van de omvang van de resulterende infecties.

Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Source: Valentine, M. E., et al. Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of bioluminescence to visualize and compare the in vivo behavior of virulent and attenuated bacterial strains in mice. It outlines the preparation of bioluminescent bacterial suspensions and their intraperitoneal injection into mice. The virulent strain exhibits...

Tracking Bacterial Infection Dynamics in a Mouse Using Bioluminescence

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Luyts, N., et al. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the induction and tracking of urinary tract infection in a mouse model using bioluminescent E. coli injected into the bladder, where bacterial adhesion, invasion, and intracellular replication occur. The emitted light from the bioluminescent operon serves as a real-time marker of bacterial load during infection...

Visualization of Urinary Tract Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

In this video, we describe the technique for the intravesical administration of uropathogenic bacteria to generate a urinary tract infection model in mice. This model can be used to understand the spread of uropathogenic bacterial infection within the urinary system and the mechanisms that determine UTI susceptibility.

Generating Urinary Tract Infection Model: A Technique to Administer Uropathogenic Bacteria in Mouse to Develop Urinary Tract Infection Model

Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met...

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

De gevestigde model van transuretrale catheterisatie van muizen kan de studie blaas aandoeningen, met inbegrip van infectie van de urinewegen, maar kan alleen worden uitgevoerd bij vrouwtjes. Een nieuw model van mannelijke transuretrale instillation, gepresenteerde, kan onderzoek op een gebied dat gekenmerkt door sterke klinische en epizoötiologische verschillen tussen de geslachten.

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Leer bioluminescentiebeeldvorming voor longitudinaal onderzoek naar urineweginfecties bij muizen. Deze methode biedt real-time inzicht in infectieverloop en vermindert het aantal benodigde dieren aanzienlijk.

Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Meer video's verkennen