Name: Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Leer een ex vivo hersenschijfmodel om borstkankerhersenmetastasen te bestuderen en te targeten. Deze methode maakt snelle testen van geneesmiddelen en bestraling mogelijk in een fysiologisch relevante omgeving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Julia Farnan, Kayla Green en Tiziana DeAngelis bedanken voor hun technische assistentie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) en W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Dit protocol is goedgekeurd en volgt de richtlijnen voor dierverzorging door het Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Nu / Nu athymische vrouwelijke muizen (6-8 weken oud) werden gebruikt in deze studie.
1. Intracraniële injectie van tumorcellen
<ol><li>Steriliseer alle apparatuur (pincet, schaar, hechtschaar, handboor) onder een droge cyclus van een autoclaaf gedurende maximaal 45 minuten in sterilisatiezakjes, inclusief een sterilisatie-indicator. Als u operaties uitvoert bij meerdere dieren, steriliseer dan gereedschappen tussen dieren met behulp van een verwarmde kraalsterilisator (tot 3x).</li>
	<li>Anesthetiseer de muizen volgens het dierverzorgingsprotocol van de gebruikers (bijv. isofluraan (4% voor inductie, 1-2% onderhoud) en dien analgesie toe (subcutaan, 0,1 ml van 0,1 mg / kg buprenorfine SR-LAB) voorafgaand aan het begin van de operatie. Zorg voor een optimale anesthesiediepte met een teenknijper.</li>
	<li>Plaats de muizen in een stereotaxisch frame en immobiliseer het hoofd met behulp van standaard oorstaven (figuur 1A). Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen.</li>
	<li>Steriliseer het oppervlak van het hoofd door herhaalde, afwisselende toepassing (3x) van jodiumdoekjes en 70% ethanol voorafgaand aan de incisie.</li>
	<li>Gebruik een chirurgisch scalpel om een middellijnincisie van 1 cm door de huid te maken in een enigszins diagonale hoek ten opzichte van de denkbeeldige lijn die de hersenen van de muis in twee symmetrische helften verdeelt om de schedel bloot te leggen. Veeg al het bloed af met een wattenstaafje.</li>
	<li>Buig de huid zijdelings af om de injectieplaats bloot te leggen: 2 mm rechts, 1 mm naar voren ten opzichte van de bregma (+2 mediolateraal (+2ML), +1 rostral/caudaal (+1RC).</li>
	<li>Gebruik een bur bit (0,73 mm) om de schedel binnen te dringen +2ML, +1RC tot de bregma en boor een gat met lichte druk en draaiende beweging.</li>
	<li>Gebruik een herseninjectiespuit om 5 μL van een 100.000 MDA-MB-231BR (stabiel tot expressie brengende GFP-Luciferase) cellen/μL oplossing in steriele 1x PBS te injecteren door de spuit in eerste instantie 3,5 mm diep in de hersenen in te brengen.</li>
	<li>Laat de spuit 2 minuten bezinken. Trek het ongeveer 1 mm omhoog en injecteer na 2 minuten langzaam de eerste helft van het volume.</li>
	<li>Wacht nog eens 2 minuten voordat u de rest injecteert en trek de spuit vervolgens langzaam 3 minuten na de laatste injectie. OPMERKING: Langzame injectie is empirisch in het toestaan van het volume om goed te worden geabsorbeerd door het hersenweefsel en geen lekkage te creëren na het trekken van de spuit, wat kan leiden tot kankercellen die buiten de beoogde plaats groeien.</li>
	<li>Breng botwas aan op de injectieplaats op de schedel en gebruik vervolgens polypropyleen hechtingen om het weefsel te hechten. Muizen zullen binnen 5 minuten herstellen na verwijdering van de anesthesie.</li>
	<li>Controleer hun gedrag direct na de operatie gedurende ongeveer 10 minuten, 3 uur later en de volgende dag om te bepalen of een speciale behandeling, waaronder zoutoplossinginjectie, zacht voedsel, enz., Nodig is om snel herstel te helpen.</li>
	<li>Monitor de tumorgroei via bioluminescentie beeldvorming op het beeldvormingssysteem.<ol>
<li>Schakel hiervoor eerst de zuurstof en het isofluraan op het beeldvormingssysteem in. Laat beide worden verdeeld naar de aparte kamer buiten de beeldvormingsdoos.</li>
		<li>Schakel vervolgens de software in, initialiseer het instrument en kies de juiste optie voor het visualiseren en vastleggen van het hele muislichaam.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de muizen in de aparte kamer met isofluraan en zorg voor een optimale anesthesiediepte met een teenknijper. Injecteer de muizen intraperitoneaal met 200 μL 30 mg/ml luciferine.</li>
	<li>Breng de maag van de muis over naar de neus van de beeldvormingskamer die wordt voorzien van zuurstof en isofluraan. Vergrendel de kamer en kies 2 minuten tijdsblootstelling om de beeldvorming te starten.</li>
	<li>Gebruik de ROI-tool (region of interest) van de software om het bioluminescente signaal van de tumor te kwantificeren.</li>
	<li>Om de tumorgrootte te analyseren, kiest u het cirkelvormgereedschap en past u het rond de tumorvorm en -grootte. Meet de ROI en rapporteer de totale metingen.</li>
	<li>Laat solide tumorgroei gedurende 12-14 dagen (of totdat luciferase ongeveer 7,0 x 106 eenheden bereikt) (figuur 1B) voordat hersenplakken worden gegenereerd. OPMERKING: Het verhogen van het aantal te injecteren cellen zal leiden tot snellere tumorgroei; daarom kan de generatie van hersenplakken eerder dan 12 dagen optreden. Aan de andere kant zal een grotere tumor leiden tot meer GFP + -plakjes als ze gedurende 14 dagen mogen groeien. Na 14 dagen begint de gezondheid van muizen snel te verslechteren; daarom moet de controle op de diergezondheid worden verhoogd tot eenmaal daags na het tijdstip van 10 dagen en moeten muizen die tekenen van pijn en / of ongemak vertonen, worden gebruikt voor het genereren van de plakjes.</li>
</ol>2. Genereer hersenplakken
OPMERKING: Voer de stappen na hersenisolatie uit in een steriele laminaire stroomkap. Het is doorgaans mogelijk om 35-40 individuele plakjes met tumorcellen (luciferasesignaal) te genereren uit één muis die is geïnjecteerd met MDA-MB-231BR-cellen (figuur 1C).
<ol><li>Steriliseer alle chirurgische hulpmiddelen in een autoclaaf. Plaats de weefselsnijder in de steriele laminaire flowkap en reinig alle gereedschappen en instrumenten met 70% ethanol.</li>
	<li>Na 12-14 dagen na intracraniale MDA-MB-231BR celinjectie, verdoven de muizen volgens het dierverzorgingsprotocol van de gebruikers zoals beschreven in 1.2. Zorg voor een optimale anesthesiediepte met een teenknijper.</li>
	<li>Verwijder en plaats hun hersenen snel (binnen 45 s) in ijskoude (4 °C) sucrose-ACSF bestaande uit: 280 mM sucrose, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM glucose, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-ascorbaat, 3 mM thiourea, 2 mM Na+, 29 mM pyruvaat; pH=7,3.</li>
	<li>Snijd met behulp van een scherp, steriel scalpel of scheermesje overtollige delen van de hersenen weg die van alle kanten geen tumor bevatten, inclusief het onderste deel van de hersenen.</li>
	<li>Breng de vorm van de hersenen naar een niet-perfecte kubus om plat op het ACSF bevochtigde filterpapier op een 60 mm schoteldeksel te zitten om het snijden te vergemakkelijken. OPMERKING: Extra weefsel van de hersenen waar de tumor waarschijnlijk niet is gegroeid, wordt voorafgaand aan het snijden verwijderd om het genereren van meestal GFP + -plakjes mogelijk te maken en een vorm van de hersenen te creëren die stabiel is op het oppervlak van het instrument en niet zal worden verstoord door de trillingen veroorzaakt door het snijden.</li>
	<li>Plaats enkele vellen voorvochtig (met ACSF) filterpapiercirkels op het snijplatform en plaats het geblokkeerde tissue hierop.</li>
	<li>Stel de snijgrootte op het instrument in op 2 of 2,5 eenheden op de meegeleverde liniaal om het weefsel in secties van 200-250 μm te snijden. OPMERKING: Plakjes tot 350 μm of zo dun als 100 μm zijn levensvatbaar. Gebruik voor plakjes <200 μm een vibratome of compresstome.</li>
	<li>Gebruik een penseel (sable) om hersenplakken over te brengen in een schaal met sucrose ACSF en scheid de plakjes onder een lichtmicroscoop met behulp van 27 G-naalden.</li>
	<li>Identificeer GFP-positieve plakjes onder de fluorescerende microscoop en breng ze over naar een nieuwe 60 mm schaal met 2-3 ml volwassen plakmedia (neurobasaal medium A, 2% B12-supplement, 1% N2-supplement, 1% glutamine, 0,5% glucose, 10 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine) met behulp van een steriele 1 ml afgebroken pipet (brede opening). OPMERKING: De hersenplakken die tumorcellen bevatten die over het hersenoppervlak groeien (misschien als gevolg van lekkage van injectiecellen, enz.) zijn uitgesloten.</li>
	<li>Breng 3-5 plakjes over op elke 30 mm, 0,4 μm poriegrootte weefselkweekinbrenging in 6-well platen op een afstand die het niet mogelijk maakt om in elkaar te groeien.</li>
	<li>Verwijder het overtollige medium van het oppervlak van de insert met behulp van een P1000-pipet, voeg 1 ml volwassen muisschijfmedium toe onder elke insert en breng de media in de incubator in evenwicht voordat u gaat snijden.</li>
	<li>Incubeer de weefsels bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 24 uur vóór beeldvorming.</li>
</ol>3. IVIS-beeldvorming van plakjes
OPMERKING: Voer luciferase- en inhibitortoevoegingsstappen uit in een steriele laminaire stroomkap.
<ol><li>Pipetteer 5 μL van 30 mg/ml luciferine-oplossing in het medium onder de inzetstukken door het inzetstuk met een tang op te tillen en terug in de put te plaatsen na toevoeging van luciferine aan de media in de put.</li>
	<li>Plaats de 6-putplaat met het deksel in de beeldvormingskamer van het instrument onder de stationaire camera en vergrendel de kamerdeur.</li>
	<li>Open de software en initialiseer het instrument.</li>
	<li>Kies camera-instellingen waarmee u slechts één put per afbeelding kunt visualiseren en vastleggen. Verplaats het podium omhoog (FOV van 5 cm) en plaats de put die moet worden afgebeeld direct onder de camera.</li>
	<li>Stel de beeldvormingstijd in op het meest geschikt, afhankelijk van de intensiteit van het luciferase dat de tumor zal uitzenden, die kan variëren van 10 s tot 5 minuten. Begin met het instellen op 10 s en verhoog vervolgens als het signaal laag is, maar houd het consistent voor alle tijdstippen en omstandigheden tot het einde van het experiment (figuur 1D).</li>
	<li>Gebruik de ROI-tool (cirkelvormtool), pas deze aan rond de tumorvorm en -grootte, meet de ROI en rapporteer de totale metingen om het bioluminescente signaal van elke tumor op de plak te kwantificeren.</li>
	<li>Breng de plaat terug naar de steriele laminaire flowkap, gebruik een tang om het inzetstuk iets uit de put te tillen.</li>
	<li>Zuig het medium op, vervang het door 1 ml vers medium en plaats het inzetstuk terug in de put.</li>
	<li>Voor experimenten waarbij de plakjes worden behandeld met verschillende verbindingen zoals remmers, metabolieten, enz., Bereidt u de juiste concentratie van het reagens in 1,2 ml hersenschijfmedia in een buis van 1,5 ml en brengt u vervolgens 1 ml over naar de put die de plak bevat.</li>
	<li>Herhaal dit proces elke 48 uur voor de duur van het onderzoek.</li>
</ol>4. Live beeldvorming van tumorgroei in ex vivo hersenplakken
OPMERKING: Voer inserts met voldoende medium (1,5 ml) om de duur van het experiment mee te gaan, omdat het niet mogelijk is om extra medium toe te voegen tijdens de live beeldvorming.
<ol><li>Plaats de 6-well plaat op de geautomatiseerde microscoopplaathouder in de incubator (37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid).</li>
	<li>Open de software, schakel brightfield in op het eerste kwadrant om de belichting aan te passen die nodig is om de segmenten te bekijken. Om de positie (coördinaten "xy") van het segment te vinden, navigeert u met "xy" in het tweede kwadrant om de coördinaten "xyz" van de microscoop te regelen.</li>
	<li>Selecteer 6-well plate als de labware die voor dit experiment wordt gebruikt. Selecteer de ROI-kaarteditor en registreer die positie door een nieuwe ROI te selecteren, voeg die ROI toe en sla deze op.</li>
	<li>Herhaal dezelfde stappen voor alle andere regio's van belang in andere putten. Nadat u alle ROI's hebt toegevoegd, slaat u alle ROI's op.</li>
	<li>Selecteer onder Protocol de optie Bestaande wissen en selecteer Time-Lapse onder Acquisitie, gevolgd door het selecteren van de interessante kanalen (in dit geval GFP).</li>
	<li>Schakel Autofocus uit in de focusinstelling en pas deze handmatig aan op de juiste scherpstelling voor alle segmenten. Pas ten slotte de Brightfield-intensiteit en fluorescentiekanaalexcitatie en belichtingstijd aan op het juiste niveau.</li>
	<li>Stel het protocol in om elke 15 minuten gedurende 48 uur beelden te verkrijgen.</li>
	<li>Sla het protocol op en voer het uit. Aan het einde van het experiment bevat het opgeslagen bestand zowel de brightfield- als de GFP-afbeeldingen die voor elke ROI zijn vastgelegd.</li>
	<li>Om de afbeeldingen in een video te combineren, hernoemt u alle interessante afbeeldingen met dezelfde naam gevolgd door een binair nummer om ze te organiseren in de volgorde waarin ze zijn vastgelegd (bijv. ROI1 (1), RO1 (2) ...)</li>
	<li>Open ImageJ en importeer de afbeeldingen door op Bestand > importeren > afbeeldingsreeks te klikken. Selecteer de bestandsnamen die in een lijst worden weergegeven en schrijf de inhoud van de naam van de bestanden in het vak Bestandsnaam bevat dat wordt weergegeven om de bestanden te identificeren die voor de video zijn geselecteerd.</li>
	<li>Sla de gecombineerde afbeeldingen op onder Bestand > Opslaan als > AVI.</li>
</ol>5. MTS-test en immunohistochemie van ex vivo hersenweefsel
<ol><li>MTS-TEST<ol>
<li>Snijd de plakjes door het weefselkweekmembraan onder elke plak langs de randen van het weefsel te snijden en breng het weefsel, dat nog steeds aan het membraan is bevestigd, over in een 96-well plaat.</li>
		<li>Voeg het MTS-reagens gemengd in een verhouding van 1:5 met kweekmedia en 0,01% triton (1x) toe om penetratie van de oplossing in het weefsel mogelijk te maken, in een totaal volume van 120 μL in elke put.</li>
		<li>Gebruik 4% paraformaldehyde (PFA) als een middel om hersenplakken levensvatbaar te maken, en dus een positieve controle voor dit experiment. Dompel het hersensegment van belang onder in 4% PFA gedurende 1 uur bij RT (kamertemperatuur) of 's nachts bij 4 °C voordat u doorgaat met de MTS-test.</li>
		<li>Laat het MTS-reagens gedurende 4 uur op de plakjes reageren, verwijder de plakjes uit de putjes en meet de absorptie bij 490 nm voor alle omstandigheden, inclusief een lege put zonder plak als referentie.</li>
		<li>Rapporteer de metingen als een functie van het plakgebied van het weefsel, gemeten met een digitale remklauwliniaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunohistochemische voorbereiding<ol>
<li>Dompel de hersenplakken die aan het membraaninzetoppervlak zijn bevestigd 's nachts bij 4 °C onder in 10% formaline.</li>
		<li>Voer inbedding, verwerking, blokkering en genereer onbevlekte dia's van het weefsel. Gebruik standaard immunohistochemisch kleuringsprotocol om te kleuren voor H & E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Bestraling van tumor in ex vivo hersenplakken
<ol><li>Bestraal de tumor met 6 Gy (310 kVp röntgenfoto's). OPMERKING: De eenheden die zijn ingevoerd om de totale dosis van 6 Gy te krijgen, zijn 3522 eenheden na het overwegen van R-eenheden (gemeten met Victoreen-elektrometer) en correcties voor de vingerhoed, luchtdichtheid en cGy / R zoals eerder beschreven18. De belichtingstijd is 130,9 s.</li>
	<li>Gebruik 0,25 mm Cu +1 mm Al toegevoegde filtratie, 50 cm SSD, 125 cGy per min.</li>
	<li>Voer dosimetrie uit door een ionisatiekamer in de bundel die is gekalibreerd volgens een primaire standaard.</li>
	<li>Corrigeer dagelijks de luchtvochtigheid, temperatuur en barometerdruk.</li>
</ol>

<ol><li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state%2C+treatment+options+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), Basel. (2021).</li>
<li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype%3A+a+multicenter+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li>
<li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li>
<li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557(2017).</li>
<li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881(2013).</li>
<li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li>
<li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400(2018).</li>
<li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030(2019).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li>
<li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li>
<li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542(2017).</li>
<li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li>
<li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li>
<li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94(2020).</li>
<li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377(2009).</li>
<li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406(2020).</li>
<li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li>
<li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease%3A+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li>
<li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel%27s+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li>
<li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017(2012).</li>
<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastasis+cell+lines+panel%3A+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen financiële conflicten te melden.

Deze studie stelt een nieuwe ex vivo hersenkweekmethode vast voor geëxplanteerde xenograft hersentumoren. We tonen aan dat BCBM-cellen MDA-MB-231BR-cellen die intracranieel in de hersenen van muizen worden geïnjecteerd, kunnen overleven en groeien in ex vivo hersenplakken. De studie testte ook intracraniaal geïnjecteerde U87MG glioblastoom (GBM) cellen en ontdekte ook dat deze kankercellen overleven en groeien in hersenplakken (gegevens niet getoond). Wij geloven dat dit model kan worden uitgebreid van ...

Borstkanker hersenmetastasen (BCBM) ontwikkelen zich wanneer cellen zich verspreiden van de primaire borsttumor naar de hersenen. Borstkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van hersenmetastasen na longkanker, met metastasen die voorkomen bij 10-16% van de patiënten1. Helaas blijven hersenmetastasen ongeneeslijk omdat >80% van de patiënten binnen een jaar na hun diagnose van hersenmetastase sterft en hun kwaliteit van leven is aangetast als gevolg van neurologische disfuncties2. Er is een dringende behoefte om effectievere behandelingsopties te identificeren. Monolaagse tweedimensionale of driedimensionale kweekmodellen zijn de meest gebruikte methoden bij het testen van therapeutische middelen in het laboratorium. Ze bootsen echter niet de complexe BCBM-micro-omgeving na, een belangrijke aanjager van tumorfenotype en groei. Hoewel deze modellen nuttig zijn, vangen ze niet de complexe tumor-stromale interacties, de unieke metabole vereisten en de heterogeniteit van de tumoren3. Om tumor-stromale interacties en micro-omgeving heterogeniteit getrouwer te reconstrueren, zijn onze groep en anderen begonnen met het genereren van organotypische hersenmetastase "slice" -culturen met patiënt-afgeleide tumorcellen (primair of gemetastaseerd) of kankercellijnen 4,5,6. In vergelijking met klassieke in vitro systemen kan dit ex vivo model op korte termijn relevantere voorwaarden bieden voor het screenen van nieuwe therapieën voorafgaand aan preklinische beoordeling in grote diercohorten.
Ex vivo modellen zijn geconstrueerd en met succes gebruikt, voornamelijk voor de identificatie van succesvolle behandelingen van verschillende kankers. Ze vereisen enkele dagen beoordeling en kunnen bovendien worden afgestemd op patiëntspecifieke geneesmiddelenscreening. Bijvoorbeeld, menselijke blaas en prostaatkanker ex vivo weefsels hebben een dosisafhankelijke anti-tumorrespons van docetaxel en gemcitabine7 aangetoond. Vergelijkbare colorectale carcinoom ex vivo weefsels werden ontwikkeld om chemotherapeutische geneesmiddelen Oxaliplatine, Cetuximab en Pembrolizumab 8 tescreenen. Deze toepassing is op grote schaal gebruikt bij alvleesklierkanker, gezien de essentiële interactie tussen de stromale omgeving en de genotypische en fenotypische kenmerken van pancreas ductaal adenocarcinoom 9,10. Bovendien zijn dergelijke organotypische modellen ontwikkeld voor vergelijkbare screenings in hoofd-, nek-, maag- en borsttumoren 11,12.
Hier wordt een ex vivo brain slice model van xeno getransplanteerde borstkanker hersen gemetastaseerde tumorcellen in hun micro-omgeving gegenereerd. Muizen werden intracranieel geïnjecteerd met borstkanker hersen gemetastaseerde hersentrofische MDA-MB-231BR cellen13 in de hersenschors pariëtale kwab - een gemeenschappelijke plaats van TNBC-metastase14,15 en lieten tumoren ontwikkelen. Hersenplakken werden gegenereerd uit deze xenogetransplanteerde dieren en ex vivo onderhouden als organotypische culturen zoals beschreven16,17. Dit nieuwe ex vivo model maakt de analyse van de groei van BCBM-cellen in het hersenparenchym mogelijk en kan worden gebruikt om therapeutische middelen en stralingseffecten op tumorcellen in de micro-omgeving van de hersenen te testen.

<table><tbody><tr><td>1 mL spuit, slip tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 Naalden</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>6-well platen</td><td>Genessee</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Geautomatiseerd microscoop en LUMAVIEW software</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27 (GEM21)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>Kolf 50 mL</td><td>Fisher</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>Blunt sable schilderskwast, Maat #5/0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>Botenwas</td><td>ModoMed</td><td>DYNJBW25</td><td></td></tr><tr><td>Herseninjectiespuit</td><td>Hamilton Company</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td>Gesplitst caspase 3 Antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>14220S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferine Kaliumzout</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>Dubbelzijdig scheermesje</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier (#1), kwantitatieve cirkels, 4.25 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>Fijne sable schilderskwast #2/0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-H2AX antilichaam</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antilichaam</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>GFP antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine (200 mM)</td><td>Corning cellgrow</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;E en KI-67</td><td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handboorset met Micro Mini Twistboorkoppen</td><td>Amazon</td><td>YCQ2851920086082DJ</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, vrije zuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>Just for mice Stereotaxic Frame</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td><td>72-6049, 72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Grote chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231BR cellen</td><td>Vriendelijk verstrekt door Dr. Patricia Steeg</td><td>Ref 14</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Muizen beeldvormingsapparaat</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS 200 systeem</td><td></td></tr><tr><td>Muizen beeldvorming software</td><td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td><td>Living Image Software</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Tecan Spark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Montageoplossing</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>MTS reagens</td><td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td><td>(Cat:G3582)</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nu/Nu athymic muizen</td><td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen Naald</td><td>Medex supply</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-jood Swab sticks</td><td>DME Supply USA</td><td>Cat: 689286X</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelmesje #11 (pk van 100)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelgreep #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spatel/probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>SS Dubbelzijdige ongecoate scheermesjes (American safety razor co (95-0043))</td><td>VWR</td><td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Amresco</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch scalpel</td><td>Exelint International</td><td>D29702</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel Chopper</td><td>Brinkman</td><td>(McIlwain type)</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel kweek inserts</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50 of PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Röntgenapparaat</td><td>Precision 250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten hersen gemetastaseerde tumorgroei

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Hersenmetastase is een ernstig gevolg van borstkanker voor vrouwen, omdat deze tumoren moeilijk te behandelen zijn en geassocieerd zijn met slechte klinische resultaten. Preklinische muismodellen van borstkanker hersen gemetastaseerde (BCBM) groei zijn nuttig, maar zijn duur, en het is moeilijk om levende cellen en tumorcel invasie in de hersenen parenchym te volgen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor ex vivo hersenplakculturen van xenogegrafeerde muizen die intracranieel geïnjecteerde borstkanker hersenzoekende klonale sublijnen bevatten. MDA-MB-231BR luciferase gelabelde cellen werden intracranieel geïnjecteerd in de hersenen van Nu / Nu vrouwelijke muizen, en na tumorvorming werden de hersenen geïsoleerd, gesneden en ex vivo gekweekt. De tumorplakken werden in beeld gebracht om tumorcellen te identificeren die luciferase tot expressie brengen en hun proliferatie en invasie in het hersenparenchym gedurende maximaal 10 dagen te volgen. Verder beschrijft het protocol het gebruik van time-lapse microscopie om de groei en het invasieve gedrag van de tumorcellen in beeld te brengen na behandeling met ioniserende bestraling of chemotherapie. De reactie van tumorcellen op behandelingen kan worden gevisualiseerd door live-imaging microscopie, het meten van de intensiteit van bioluminescentie en het uitvoeren van histologie op de hersenschijf die BCBM-cellen bevat. Dit ex vivo slice-model kan dus een nuttig platform zijn voor het snel testen van nieuwe therapeutische middelen alleen of in combinatie met straling om geneesmiddelen te identificeren die zijn gepersonaliseerd om zich te richten op de met gemetastaseerde groei van de hersenen van een individuele patiënt in de micro-omgeving van de hersenen.

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasecellen werden intracranieel geïnjecteerd in de rechterhersenhelft van 4-6 weken oude Nu/Nu-muizen zoals hierboven uitgelegd (figuur 1A) en mochten gedurende 12-14 dagen groeien, gedurende welke tijd de tumorgroei werd gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming (figuur 1B). We injecteerden 100.000 kankercellen intracranieel zoals gerapporteerd door andere groepen19, maar het is mogelijk om zo laag als 20.000 cel<s...

We introduceren een protocol voor het meten van real-time medicijn- en stralingsrespons van borstkanker hersenmetaster gemetastaseerde cellen in een organotypisch hersenplakmodel. De methoden bieden een kwantitatieve test om de therapeutische effecten van verschillende behandelingen op hersenmetastasen van borstkanker op een ex vivo manier binnen de micro-omgevingsinterface van de hersenen te onderzoeken.

Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Dit protocol maakt de vorming van hersenmetastasische tumorcellen en de generatie van ex vivo hersenplakken mogelijk die het mogelijk maken om snel de werkzaamheid van geneesmiddelen en straling op een voorgevormde tumor te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om snel meerdere geneesmiddelen of behandelingen te testen in een fysiologisch relevante omgeving die de interacties tussen hersenen en tumor en gastheer handhaaft. Deze methode kan helpen begrijpen hoe hersenmetastasische cellen groeien, overleven en het hersenparenchym binnendringen en de rol van de micro-omgeving van de hersentumor in de groei en verspreiding van kanker begrijpen.De procedure wordt gedemonstreerd door Lorela Ciraku en Emily Esquea, beiden promovendi uit mijn laboratorium. Plaats om te beginnen de verdoofde muizen in een stereotaxisch frame en immobiliseer het hoofd met behulp van standaard oorstaven. Steriliseer het oppervlak van het hoofd driemaal door herhaalde afwisselende toepassing van jodiumswabs en 70% ethanol voorafgaand aan de incisie.Maak met behulp van een chirurgisch scalpel een middellijnincisie van één centimeter onder een diagonale hoek met de denkbeeldige as die de hersenen van de muizen in twee symmetrische helften verdeelt om de schedel bloot te leggen. Na het afvegen van het bloed met een wattenstaafje, buigt u de huid zijdelings af om de injectieplaats bloot te leggen. Gebruik een braambit van 0,73 millimeter om de schedel binnen te dringen en boor een gat met lichte druk en draaiende beweging.Om vijf microliter cellen te injecteren die stabiel GFP luciferase tot expressie brengen, plaatst u een uiterst nauwkeurige spuit tot 3,5 millimeter diepte in de hersenen. Laat het twee minuten bezinken en trek de spuit vervolgens ongeveer een millimeter omhoog. Injecteer na twee minuten langzaam het eerste halve volume en wacht nog twee minuten voordat u de rest van het volume injecteert.Trek na drie minuten langzaam aan de spuit. Breng botwas aan op de injectieplaats op de schedel en hecht het weefsel met polypropyleen hechtingen. Controleer het gedrag van de muis direct na de operatie periodiek om te bepalen of een speciale behandeling, waaronder zoutoplossinginjectie en zacht voedsel, nodig is om snel herstel te helpen.Om de tumorgroei te volgen via bioluminescentiebeeldvorming, schakelt u eerst de zuurstof en het isofluraan op het beeldvormingssysteem in en laat u beide worden gedistribueerd naar de afzonderlijke kamer buiten de beeldvormingsdoos. Kies vervolgens, na het inschakelen van de software en het initialiseren van het instrument, de juiste optie voor het visualiseren en vastleggen van het hele muislichaam. Breng vervolgens de muizen over naar de kamer buiten de beeldvormingsdoos die is voorzien van zuurstof en isofluraan.Zodra de muizen onder de narcose-werking zijn, injecteert u de muizen intraperitoneaal met 200 microliter van 30 milligram per milliliter luciferine. Plaats de muizen in de beeldvormingskamer met de maag naar beneden gericht naar de neuslip van de beeldvormingskamers. Vergrendel de kamer, kies twee minuten tijdsbelichting om de beeldvorming te starten en voltooi vervolgens de beeldvorming.Nadat u de weefselsnijmachine in een steriele laminaire flowkap hebt geplaatst, reinigt u alle gereedschappen en instrumenten met 70% ethanol. Na het euthanaseren van de muis, verwijder en plaats de hersenen snel in ijskoude sucrose-ACSF-oplossing. Breng met behulp van een spatel de hersenen over op een ACSF-bevochtigd filterpapier op een 60 millimeter schoteldeksel.Snijd met een scherp, steriel scheermesje de overtollige delen van de hersenen die geen tumor bevatten, inclusief het onderste deel van de hersenen, om de vorm van de hersenen naar een niet-perfecte kubus te brengen. Nadat u verschillende vellen ACSF-bevochtigd filtreerpapier op het snijplatform hebt geplaatst, plaatst u het geblokkeerde tissue op het filterpapier. Om het weefsel in 200 tot 250 micrometer dikke secties te snijden, stelt u de snijgrootte in op 2 of 2,5 eenheden op de liniaal van de provider en begint u met snijden.Gebruik een verfkwast om hersenplakken over te brengen in een schaal met sucrose-ACSF en scheid de plakjes onder een lichtmicroscoop met behulp van 27-gauge naalden. Identificeer de GFP-positieve plakjes onder de fluorescerende microscoop. Breng vervolgens met behulp van een steriele afgebroken pipet van één milliliter met een brede opening geïdentificeerde plakjes over naar een nieuwe schaal van 60 millimeter met twee tot drie milliliter volwassen plakmedia.Breng vervolgens drie tot vijf plakjes over op elke weefselkweekinzet in elke put van een plaat met zes putten op een veilige afstand. Nadat u het overtollige medium van het oppervlak van de insert hebt verwijderd, voegt u onder elke insert een milliliter gebalanceerd plakmedium voor volwassen muizen toe. Incubeer de weefsels bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid gedurende 24 uur vóór beeldvorming.Pipetteer vijf microliter van 30 milligram per milliliter luciferine-oplossing in het medium onder de inzetstukken in een steriele kap. Plaats de zes-putplaat met het deksel in de beeldvormingskamer van het instrument onder de stationaire camera en vergrendel de kamerdeur. Open de software en initialiseer het instrument.Nadat u de camera-instellingen hebt gekozen die visualisatie en opname van slechts één put per beeld mogelijk maken, plaatst u de te fotograferen put direct onder de camera. Gebruik de ROI-tool, pas deze aan rond de vorm en grootte van de tumor, meet de ROI en rapporteer de totale metingen om het bioluminescente signaal van elke tumor op de plak te kwantificeren. Nadat u de plaat terug naar de steriele laminaire flowkap hebt gebracht, gebruikt u een tang om het inzetstuk iets uit de put te tillen.Vervang na het aanzuigen van het medium het medium door één milliliter vers medium en plaats de inzet terug in de put. Voor de experimenten waarbij de plakjes worden behandeld met verschillende verbindingen, zoals remmers en metabolieten, bereidt u de juiste reagensconcentratie in 1,2 milliliter hersenschijfmedia in een buis van 1,5 milliliter en brengt u vervolgens één milliliter reagens over naar de put met de plak. De MDA-MB-231 BR-GFP luciferasecellen werden geïnjecteerd in naakte muizen, tumoren mochten groeien, hersenen met tumoren werden ontleed, gesneden, ex vivo gekweekt en tumorgroei werd gevolgd door bioluminescentie beeldvorming.De H&E-kleuring en GFP-positieve fluorescentie bevestigden de aanwezigheid van een tumor in de hersenschijf. De verhoogde Ki-67 kleuring bevestigde de aanwezigheid van zeer proliferatieve kankercellen. De tumoren in hersenplakken die niet aan bestraling werden blootgesteld, bleven ex vivo groeien, terwijl tumoren die aan bestraling werden blootgesteld een stagnerende groei vertoonden.Hersenplakken met tumoren werden ook gemonitord via live beeldvorming om de tumorgroei na de bestralingsbehandeling te visualiseren. In overeenstemming met de bioluminescente beeldvorming groeiden controlekankercellen snel naarmate de GFP-intensiteit toenam en de cellen het hersenparenchym begonnen binnen te dringen. Daarentegen waren de kankercellen in hersenplakken die met bestraling werden behandeld cytostatisch en bleef de GFP-intensiteit gehandhaafd.Grote multi-nucleated kankercellen en een toename van kleuring van DNA-schade marker in IR-behandelde kankercellen werden gedetecteerd. Ook werd een toename van reactieve astrocyten gedetecteerd. De door de IR-behandeling geïnduceerde apoptose werd niet gedetecteerd in de tumorvrije hersenplakken van muizen.De hersenplakken met tumoren werden behandeld met verschillende concentraties paclitaxel, een chemotherapeutisch geneesmiddel. De behandeling verminderde de grootte van de tumor aanzienlijk na dag 10 van de behandeling. Een toename van apoptose werd gedetecteerd in met paclitaxel behandelde tumorcellen.De remmerbehandeling veranderde de levensvatbaarheid van hersenweefsel niet. Er werd geen toename van apoptose gemeten door gekloofde caspase-3-kleuring in met paclitaxel behandelde tumorvrije hersenschijf van muizen. Wanneer de behandeling met de geneesmiddelen van belang is beëindigd, kunnen plakjes worden geanalyseerd op eiwitexpressie door middel van immunocytochemie, omische studies of eencellige suspensie bereiken die geschikt is voor flowcytometrie.

an-ex-vivo-brain-slice-model-to-study-target-breast-cancer-brain

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Source: Ciraku, L., et. al. An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the imaging of luciferase-expressing tumor cells in an organotypic mouse brain slice. Luciferin is added to the medium, and the plate is placed inside the chamber of the in vivo imaging system. Parameters for image capture are adjusted, and the tumor's shape and size are defined. The bioluminescent signals emitted by the tumor...

Bioluminescence Imaging to Assess Tumor Growth in an Organotypic Mouse Brain Slice

Een borstkanker hersenmetastasen muismodel wordt vastgesteld met echografie-imaging geleide intracardiale injectie van MDA-MB231/Br-GFP cellen. Ontwikkeling van multifocale intracraniële metastasen is longitudinaal gevolgd met behulp van hoge-resolutie 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging-begeleide Intracardiale Injection een muismodel van borstkanker hersenmetastasen Gevolgd door Longitudinale MRI Ontwikkelen

Veel typen menselijke hersentumoren zijn gelokaliseerd in specifieke gebieden in de hersenen en zijn moeilijk te laten groeien in cultuur. Dit protocol behandelt de rol van de tumormicro-omgeving en onderzoekt nieuwe medicamenteuze behandelingen door fluorescerende primaire hersentumorcellen te analyseren die groeien in een organotypische muizenhersensnede.

Een hersentumor / organotypische Slice Co-cultuur voor het bestuderen tumor micro en Gerichte Drug therapieën

Brain metastase is uitgegroeid tot een dringende onvervulde medische noodzaak als de incidentie is toegenomen, terwijl de therapeutische opties palliatieve zijn gebleven. Het creëren van experimentele diermodellen van de hersenen metastase via intracarotid arteriële injectie van kankercellen vergemakkelijkt mechanistische studies van de ziekte biologie en de evaluatie van nieuwe interventies regimes.

Intracarotid Cancer Cell Injection aan muismodellen van Brain metastase Produce

Intracraniale hersenen metastase modellering wordt gecompliceerd door een onvermogen om tumorgrootte en reactie op de behandeling met nauwkeurige en tijdige methoden te controleren. De gepresenteerde methodologie paren intracraniale tumor injectie met magnetische resonantie imaging analyse, die wanneer gecombineerd, cultiveert nauwkeurige en consistente injecties, verbeterde dier monitoring, en nauwkeurige tumor volume metingen.

Modellering van hersenmetastasen door middel van intracraniale injectie en magnetische resonantie beeldvorming

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en kweken van een bloed-hersenbarrière gemetastaseerde tumor micro-omgeving en vervolgens kwantificeren van de toestand met behulp van confocale beeldvorming en kunstmatige intelligentie (machine learning).

Kwantificeren van de Brain Gemetastatische Tumor Micro-Environment met behulp van een Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning en Confocal Tomography

We beschrijven een xenograft muismodel van borstkanker hersenmetastase gegenereerd via staart-ader injectie van een endogene HER2-versterkte inflammatoire borstkankercellijn.

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Hersenmetastase is een oorzaak van ernstige morbiditeit en mortaliteit bij kankerpatiënten. De meeste muismodellen voor hersenmetastasen worden gecompliceerd door systemische metastasen die de analyse van mortaliteit en therapeutische interventie-uitkomsten verstoren. Hier gepresenteerd is een protocol voor interne carotisinjectie van kankercellen dat consistente intracraniale tumoren produceert met minimale systemische tumoren.

Modellering van hersenmetastase door interne halsslagaderinjectie van kankercellen

Kuikenembryo's worden gebruikt voor het bestuderen van menselijke glioblastoom (GBM) hersentumoren in ovo en in ex vivo hersenschijfcoculturen. GBM-celgedrag kan worden geregistreerd door time-lapse-microscopie in ex vivo co-culturen en beide preparaten kunnen op het experimentele eindpunt worden geanalyseerd door gedetailleerde 3D-confocale analyse.

Het kuikenembryobrein gebruiken als model voor in vivo en ex vivo analyses van menselijk glioblastoomcelgedrag

De stereotactische intracraniële injectietechniek maakt precieze en gelokaliseerde implantatie van tumorcellen in de muiscortex mogelijk, waardoor het een krachtig model is voor het bestuderen van metastatische kolonisatie van de hersenen.

Modellering van hersenmetastase: gestandaardiseerde analyse van metastatische kolonisatie en histologische groeipatronen door stereotactische intracorticale injectie

Leer een ex vivo hersenschijfmodel om borstkankerhersenmetastasen te bestuderen en te targeten. Deze methode maakt snelle testen van geneesmiddelen en bestraling mogelijk in een fysiologisch relevante omgeving.

Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei

Meer video's verkennen