Het gebruik van de patch-clamp-techniek om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen

Dit protocol beschrijft hoe de patchklemtechniek kan worden gebruikt om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen door mitochondriaal protonlek direct te meten over het binnenste mitochondriale membraan. De directe meting van de protonstroom door het binnenste mitochondriale membraan helpt bij het identificeren en nauwkeurig karakteriseren van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitochondriale thermogenese. Deze techniek maakt het niet alleen mogelijk om de protonstroom over het binnenste mitochondriale membraan te meten, maar ook om andere geleidingen te bestuderen die belangrijk zijn voor de mitochondriale functie, zoals calcium of metabolieten zoals adeninenucleotiden.

Plaats de geëuthanaseerde muis op zijn rug en spuit alcohol om het haar schoon te maken en nat te maken. Maak vervolgens een incisie van twee centimeter op de thorax. Nadat u de huid met een pincet hebt vastgepakt, ontleedt u het hart uit de borst van het dier en spoelt u het om al het bloed in een bekerglas van 10 milliliter te verwijderen met vijf milliliter koude isolatieoplossing.

Zodra het hart is ontdaan van bloedsporen, breng het over naar een ander bekerglas van 10 milliliter met vijf milliliter koude isolatiebuffer en hak het in dunne stukjes. Breng het vervolgens over in een ijsgekoelde glazen homogenisator van 10 milliliter. Gebruik een bovengrondse roerder om het voorgesneden weefsel op ijs te homogeniseren met zes zachte slagen met een gecontroleerde snelheid van 275 rotaties per minuut.

Breng het homogenaat over in een ijskoude conische buis van 15 milliliter en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 700 maal G om de kernen en ongebroken cellen te pelleteren. Verzamel het supernatant in een verse buis van 15 milliliter en leg het op ijs. Centrifugeer het supernatant op 8, 500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om een pellet te verkrijgen die de mitochondriën bevat.

Resuspend de mitochondriale pellet in 3,8 milliliter ijskoude hypertone mannitolbuffer en incubeer de mitochondriale suspensie op ijs gedurende 10 tot 15 minuten. Vul de mitochondriale hypertone mannitolsuspensie in een gekoelde minidrukcel van de Franse pers. Plaats vervolgens de cel op de Franse pers.

Selecteer vervolgens de lage modus van de Franse pers en comprimeer de suspensie door de minidrukcel op 110 op de wijzerplaat voor de bruinvette mitochondriën en op 140 voor de hart mitochondriën, zodat de suspensie uit de minidrukcel komt met een snelheid van ongeveer één druppel per seconde. Verzamel de druppels in een 15-milliliter ijsgekoelde conische buis. Centrifugeer de suspensie op 10, 500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Resuspend de mitoplastenkorrel in 0,5 tot 2 milliliter ijskoude hypertone kaliumchloridebuffer en sla de suspensie op ijs op. Trek de filamenten van borosilicaatglas op de dag van opname met behulp van een micropipette-trekker en stel een programma in op de trekker die wordt gebruikt voor het genereren van pipetten met een hoge mate van reproduceerbaarheid. Plaats een glazen gloeidraad in de trekker en trek om bijna twee identieke patchpipeten uit één borosilicaatfilament te verkrijgen.

Pas het programma aan wanneer pipetten inconsistent worden tussen trekcycli als gevolg van veroudering van de gloeidraad van de verwarmingsdoos van de trekker. Plaats de pipet in de pipetpolijstmachine en plaats de punt in de buurt van de gloeidraad onder 100X vergroting om deze schoon te polijsten. Druk meerdere keren op het voetpedaal om de gloeidraad te verwarmen zonder de tipcurve te verstoppen of te beschadigen.

Polijsten totdat de pipetten een weerstand tussen 25 en 35 megaohms hebben, worden verkregen wanneer ze worden gevuld met een pipetoplossing op basis van TMA. Pre-incubeer afdekslipjes met 0,1% gelatine om de adhesie van mitoplast te verminderen en spoel ze af met de kaliumchloride badoplossing voordat de mitoplast-suspensie wordt afgezet. Bereid een ruwe verdunning door ongeveer 35 microliter van de geconcentreerde mitoplastsuspensie te mengen met 500 microliter van de kaliumchloridebadoplossing en plaats deze op de afdekslipjes die eerder in een put van een vier-putplaat zijn geplaatst.

Incubeer op ijs gedurende 15 tot 20 minuten voor mitoplasten om langs de afdekslip te bezinken. Vul de badkamer volledig met ongeveer 50 microliter van de kaliumchloride badoplossing en breng een afdekslip met mitoplasten in de kamer over met een dun microdissectiepincet met een gebogen punt. Plaats de afdekslip aan de onderkant van de kamer zonder de kamer te perfuseren om de mitoplasten stabiel op de afdekslip te houden.

Kies een individuele niet-klevende mitoplast door de afdekstrook onder de microscoop te scannen met een 60X objectief. Laad de pipet met de pipetoplossing en plaats deze in de pipethouder. Breng de pipet met een micromanipulator in de badoplossing en beweeg deze net boven de geselecteerde mitoplast om dicht bij de IMM te komen.

Houd de membraanpotentiaal op nul millivolt en pas 10 millivolt-pulsen toe met behulp van het membraantestcommando in het versterkerprogramma. Oefen een lichte onderdruk uit om snel een gigaseal te maken met de IMM. Til de pipet op met de mitoplast eraan om ze uit de buurt van de afdekselslip te houden om te voorkomen dat de afdichting breekt als gevolg van pipetdrift tijdens het experiment.

Compenseer de verdwaalde capaciteitstransiënten met het membraantestcommando in het versterkerprogramma voordat u de hele mitoplastconfiguratie test om een correcte capaciteitsmeting voor het mitoplastmembraan na de inbraak te verkrijgen. Pas kortdurende spanningspulsen toe met het versterkerprogramma om de membraanpleister onder de glazen pipet te scheuren en de whole-mitoplast-configuratie te bereiken. Pas na de inbraak de capaciteitstransiënten aan met de membraantestoptie van het versterkerprogramma om de membraancapaciteit en de toegangsweerstand te beoordelen.

Vervang onmiddellijk na de inbraak de kaliumchloridebadoplossing door een HEPES-badoplossing via perfusie. Pas een rampprotocol van 850 milliseconden toe met het versterkerprogramma. Toepassing van het voltage ramp protocol induceert een grote amplitude protonstroom over de IMM van bruin vet zonder de toevoeging van exogene vetzuren, de vereiste activatoren van UCP's.

Na perfusie door UCP1-remmer guanosinedifosfaat of 10-millimolair methyl bèta-cyclodextrine voor de endogene membraanvetzuurextractie, wordt de reststroom gebruikt om de amplitude van de UCP1-stromen te bepalen, die volledig verdwijnt in de IMM van UCP1-deficiënte muizen. In tegenstelling tot bruin vet ontwikkelt de IMM van niet-vetweefsels, zoals skeletspieren en hart, niet direct na de inbraak een meetbare protonstroom. Om een meetbare protonstroom via AAC te induceren, is het essentieel om de HEPES-badoplossing toe te passen die één tot twee micromolair exogene vetzuren bevat.

Om te bevestigen dat de gemeten protonstroom wordt gedragen door AAC, is het belangrijk om specifieke remmers toe te passen, carboxyatractyloside, die de protonstroom die wordt getoond in de IMM van AAC1-deficiënte muizen bijna volledig remmen. Een constante maar nooit volledige remming van protonlekkage wordt alleen bereikt wanneer ADP aan beide zijden van het membraan aanwezig is om een actieve nucleotide-uitwisseling via AAC te genereren. De kwaliteit van het mitoplastpreparaat zal het slagingspercentage beïnvloeden bij het bereiken van de whole-mitoplast configuratie.

Het is essentieel om het te optimaliseren. Zodra het moleculaire mechanisme van mitochondriale thermogenese is ontleed met de patchklemtechniek, zal meting van mitochondriaal zuurstofverbruik het belang van protonstroom en thermogenese in intacte mitochondriën aantonen. Deze techniek opent de weg voor onderzoekers om allerlei geleidingen, ionen en metabolieten te onderzoeken die belangrijk zijn voor het functioneren van mitochondriën.