Chromosoomscreening van menselijke pre-implantatie-embryo's met behulp van gebruikt kweekmedium: monsterafname en chromosomale ploïdieanalyse

Het protocol is om de verzameling van gekweekte media en de chromosomale ploïdieanalyse te normaliseren op basis van niet-invasieve chromosoomscreening NICS van menselijke pre-implantatie-embryo's. Het belangrijkste voordeel van NICS is dat het eenvoudig te bedienen is in plaats van TiDieR-micromanipulatie, tijdbesparend is en het verlies van invasieve biopsiemonsters effectief vermindert. De bemonsteringsmethode is zeer flexibel.

Hier bieden we u twee verschillende opties, een voor routinematige sequentiële embryokweek en een andere voor één stap. Dit zijn de belangrijkste collega's van ons team, Dr.Yaxin Yao en Dr.Xiaohui Zhu zijn voornamelijk verantwoordelijk voor de voorbereiding van de bibliotheek en de NICS-regeneratiesequencing. Dr. Jialin Jia en ik voltooien embryologisch werk en monsterverzameling.

Professor Liu is de leider van onze groep. Zij is ook de corresponderende auteur van dit artikel. Bereid om te beginnen de reagentia en gereedschappen voor.

Verwarm en equilibreer 20 tot 30 microliter kweekmedium en hyaluronidase voor gebruik. Plaats vervolgens het kweekmedium en de hyaluronidase op een werkoppervlak in een zuurkast. Breng de verteerde OCCC's snel over in de kweekschaal voor eicelbehandeling en bedek ze in elk putje met minerale olie.

Zuig de eicellen voorzichtig op en laat ze vijf tot tien keer los om resterende granulosacellen rond de eicellen te verwijderen. Herhaal deze stap in de resterende drie putjes om de granulosacellen volledig te verwijderen. Evalueer de volledigheid van granulosacelverwijdering met behulp van een microscoop.

Voer vervolgens intracytoplasmatische sperma-injectie uit, ook wel ICSI genoemd en breng het embryo over naar het kweekmedium. Bereid voor elk embryo 20 tot 30 microliter van het blastocystkweekmedium microdruppeltjes voor. Bedek de embryo's op dag twee met minerale olie in een weefselkweekschaaltje en broed ze uit bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 5% zuurstof.

Nadat u het embryo van de derde dag in de wasmicrodruppel hebt teruggebracht, zuigt u het embryo voorzichtig op en laat u het in de microdruppel in de drie druppeltjes serieel los met behulp van de pipetten. Breng het embryo vervolgens over naar het blastocystkweekmedium. Bereid de wasmicrodruppels en kweekmicrodruppels voor.

Breng het embryo in de middag van de vierde dag over in voorverwarmde microdruppeltjes kweekmedium en was elk embryo voorzichtig serieel in drie microdruppels met de pipetten. Breng elk embryo over in een unieke voorverwarmde enkele microdruppel kweekmedium voor monsterafname. Kweek het blastocystembryo vóór cryopreservatie.

Voor het uitvoeren van de vitrificatie vóór cryopreservatie van het embryo, bereidt u de kweekmicrodruppels voor en brengt u het embryo over in voorverwarmde microdruppels van 10 tot 15 microliter kweekmedium. En was elk embryo voorzichtig serieel in drie microdruppels door te pipetteren op de ochtend van de vijfde dag. Zoals eerder is aangetoond, brengt u elk embryo over in een unieke voorverwarmde enkele microdruppel kweekmedium voor monsterafname.

En kweek het blastocystembryo bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide vóór cryopreservatie. Pas vervolgens de ICM voorzichtig aan op een aanzienlijke afstand van het beoogde punt van de laserstraal die zich richt op de celovergang van het trophectoderm om een klein gaatje in het trophectoderm te genereren om de vloeistof uit de blastocoelholte vrij te maken. Om het monster te verzamelen, ontdooit u de buffer in de kit bij kamertemperatuur en centrifugeert u kort.

Breng vervolgens het kweekmedium van elk gekweekt embryo over in een RNase-DNase-vrije PCR-buis met vijf microliter van de cellysebuffer. Bereid de reagentia en gereedschappen voor. Na kwantificering van het genomische DNA verdund tot een concentratie van 50 picogram per microliter met het kweekmedium.

Centrifugeer de buis na grondig mengen kort gedurende vijf seconden op 200 G. Na het centrifugeren van het kweekmedium in een microcentrifuge gedurende 30 tot 60 seconden, pipetteer u 10 microliter kweekmedium vanaf de bodem van de buis verdunde positieve controle en vers kweekmedium in een nieuwe PCR-buis van 0,2 milliliter. Voeg een microliter MT-enzymmix toe en meng grondig door te pipetteren.

Centrifugeer vervolgens onmiddellijk gedurende twee tot drie seconden. Plaats de PCR-buis in een voorverwarmd voorbereidingsstation voor gemengde monsters en voer het lysisprogramma uit. Zodra de pre-lib-buffer is ontdooid en gemengd, centrifugeert u deze onmiddellijk gedurende twee tot drie seconden op 200 G. Bereid een mastermix voor de pre-bibliotheekreactie voor door twee microliter pre-bibliotheekenzymmix toe te voegen aan 60 microliter pre-bibliotheekbuffer.

Meng de reactie grondig en centrifugeer kort. Voeg 60 microliter pre-library reactiemengsel toe aan het voorbehandelde mediummonster. Nadat u het grondig hebt gemengd door te pipetteren, centrifugeert u onmiddellijk gedurende twee tot drie seconden op 200 G.Plaats het PCR-buisje in het voorverwarmde monstervoorbereidingsstation.

Voer het pre-bibliotheekprogramma uit en houd het op vier graden Celsius. Bereid een mastermix voor de bibliotheekreactie door 1,6 microliter bibliotheekenzymmix toe te voegen aan 60 microliter bibliotheekbuffer. Meng de reactie grondig en centrifugeer zoals eerder gedemonstreerd.

Voeg 60 microliter van de bibliotheekreactiemix en twee microliter van de barcodeprimer toe aan elk pre-bibliotheekproduct. Meng vervolgens de reactie grondig en centrifugeer zoals aangetoond. Plaats na het centrifugeren de PCR-buis in de thermische cycler.

Voer het bibliotheekvoorbereidingsprogramma uit en houd het vervolgens op vier graden Celsius. Bereid de reagentia en gereedschappen voor. Voeg de geprepareerde 1X geprepareerde megakralen toe aan het bibliotheekmonster.

Kwantificeer de gezuiverde bibliotheken zoals beschreven in het tekstmanuscript en gebruik 10 nanogram van elk bibliotheekmonster voor pooling. Raadpleeg de gebruikershandleiding voor sequencing en voer een gegevensanalyse uit nadat de sequencing is voltooid. Voer de gebruikersnaam en het wachtwoord van de gebruiker in op de inlogpagina voor gegevensanalyse in ChromGo.

Nadat u bent ingelogd, klikt u op Inzending maken onder het tabblad NICS. Kies vervolgens NGS voor het platform, Illumina voor Corporation en NICSInst voor het reagens. Voer de projectgegevens in het vak onder Project-ID in.Stel de analysevoorkeuren in en upload de bestanden.

Zodra alle sequentiebestanden zijn geüpload, klikt u op Verzenden om de analyse te starten. De ingediende projecten worden weergegeven onder het tabblad Inzendingen bekijken. Klik op de knop Weergeven in het veld Rapport om de overzichtstabel van de NICS-analyse weer te geven.

Klik op de knop Rapport exporteren om de rapporten op te slaan. Er werden zes blastocysten verkregen van patiënten en NICS werd uitgevoerd op alle zes embryo's van dag vier tot dag vijf medium. De chromosoomafwijkingen veroorzaakt door de gebalanceerde translocatie van de ouders werden gedetecteerd in vijf van de chromosomen met behulp van de NICS-test en daarom werden ze niet gebruikt voor overdracht.

De NICS-resultaten van de twee embryo's toonden hetzelfde karyotype 45 XN en chromosoom 18-deletie waren beide chromosoom 18-deleties. De karyotype 46 XN korte arm van de chromosoom één regio deletie was alleen de korte arm van de chromosoom regio deletie. De NICS-resultaten toonden karyotype 46 XN met de lange arm van chromosoom 18-regiodeletie en de korte arm van chromosoom één regioduplicatie.

Hoewel de karyotypes duplicaties van chromosoom vijf waren en acht mozaïekverschillen vertoonden, kon de NICS-test alle 24 chromosomen screenen op aneuploïdie. Dit proces biedt een nieuwe methode voor het overbrengen van enkelvoudige normale karyotype blastocysten. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om de cumulaire cellen volledig te verwijderen om besmetting van maternale oorsprong te voorkomen en het kweekmedium en het uiteengezette blastocyststadium te verzamelen wanneer het DNA-gehalte voldoende is voor amplificatie.

Door gebruik te maken van NICS-technologie stroomlijnde de huidige studie de voorbereidingsstappen van de WGA- en WGS-bibliotheek in ongeveer drie uur en opt-in CCS-resultaat niet-invasief in ongeveer negen uur. Na de ontwikkeling ervan bood de techniek clinicus in ART een nieuwe manier om morfologische beoordeling te combineren met NICS om een aploïdie-embryo met een goede morfologie in de baarmoeder over te brengen, wat de lopende zwangerschapspercentages en levendgeborenen zou kunnen verbeteren.