Driedimensionaal in vitro biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers

Ons protocol biedt een 3D bio-engineered model dat het oorspronkelijke weefsel nauw beïnvloedt. Dit kan mogelijk worden gebruikt om nieuwe therapieën en biomarkers te ontdekken voor de behandeling en diagnose van neuroblastoom. Het belangrijkste voordeel is dat het meer fysiologisch relevante experimentele omstandigheden creëert om de micro-omgeving van de tumor te bestuderen met behulp van een reproduceerbare techniek die batch-to-batch-consistentie bereikt.

Onze steigermethode kan ten eerste worden gebruikt om nieuwe therapieën voor neuroblastoom te identificeren en ten tweede om van patiënten afgeleide cellen op te nemen voor een betere voorspelling van de individuele respons van de patiënt. Plaats om te beginnen de steiger die in PBS is opgeslagen in de laminaire stroomkap. Gebruik een steriel pincet om de steiger voorzichtig uit de hoek te tillen en druk tegen de zijwand om overtollige PBS te verwijderen.

Plaats vervolgens de steiger met de glanzende laag naar beneden in het midden van de put van een niet-klevende plaat met 24 putjes. Label de plaat met details van de cellijn, zaaidichtheid en tijdstippen. Werk met de cellen met één zaaidichtheid tegelijk en houd de resterende cellen op 37 graden Celsius in de incubator tot ze klaar zijn voor gebruik.

Gebruik voor de celbevestiging in de steiger een P20-pipet met steriele punten om de celsuspensie grondig te mengen en voeg 20 microliter van de relevante celsuspensie toe in het midden van elke steiger, waarbij u ervoor zorgt dat de celsuspensie bovenop de steiger blijft en niet op de zijwand of basis van de put. Laat de cellen zich drie tot vijf uur hechten bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide en 95% luchtvochtigheid. Gebruik aan het einde van de incubatie een P1000-pipet om langzaam één milliliter voorverwarmd groeimedium aan elk putje toe te voegen, waardoor verplaatsing van de steigers wordt voorkomen, en incubeer de plaat een nacht.

Observeer de steigers, in eerste instantie, om de twee tot drie dagen op kleurveranderingen van het groeimedium terwijl de cellen zich in de steiger vermenigvuldigen. Gebruik een pipetpistool van 10 milliliter met de langzame modus om één milliliter van het verbruikte medium uit de put te verwijderen en weg te gooien. Wanneer het geconditioneerde medium voor het experiment wordt gebruikt, verzamelt u het gebruikte medium van de biologische replicaten in een centrifugebuis van 15 milliliter en pelleteert u het celafval door centrifugatie.

Breng het supernatans over in een verse buis en bewaar de buis bij min 80 graden Celsius. Nadat u het pipetpistool op de druppelmodus hebt gezet, voegt u voorzichtig twee milliliter voorverwarmd groeimedium toe aan de steigers. Incubeer de steiger-bevattende plaat en vul het verse medium aan voor de duur van de gewenste groeiperiode, zoals aangetoond.

Steriliseer in de laminaire stromingskap het juiste reagens voor de cellevensvatbaarheidstest door filtratie door een steriel filter van 0,2 micrometer in een centrifugebuis. Verwarm de steriele oplossing, het volledige groeimedium en de steriele PBS voor in het waterbad, op 37 graden Celsius. Gebruik een steriel pincet om de te analyseren steigers over te brengen in een verse plaat met 24 putjes en label de plaat met alle relevante details.

Voeg 900 microliter van het voorverwarmde groeimedium toe aan elk putje. Voeg vervolgens 100 microliter van het reagens voor de levensvatbaarheid van steriele cellen toe aan elk putje. Voeg voor een negatieve controle 900 microliter medium en 100 microliter van het reagens voor de levensvatbaarheid van steriele cellen toe in een putje zonder steiger.

Plaats het deksel terug op de plaat en schud de plaat voorzichtig gedurende ongeveer drie minuten om het verdunde cellevensvatbaarheidsreagens door het putje te verdelen. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 95% luchtvochtigheid. Nadat u de plaat uit de couveuse hebt gehaald, schudt u de plaat een paar seconden voorzichtig en genereert u de drievouden, zoals aangetoond in het tekstmanuscript.

Genereer de technische drievoud door 100 microliter van het geïncubeerde medium en reagens over te brengen van één putje van de plaat met 24 putjes naar één putje van de doorschijnende plaat met 96 putjes, en voer deze stap in totaal drie keer uit voor één putje. Bedek de plaat met 96 putjes met aluminiumfolie om het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel tegen licht te beschermen. Verwijder de resterende 700 microliter medium en reagens van de steigers in de plaat met 24 putjes en gooi deze weg.

Was elke steiger twee keer met één milliliter steriele PBS. Gebruik een microplaatlezer om de absorptie op 570 en 600 nanometer te meten en bereken de procentuele vermindering van de cellevensvatbaarheidsreagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Analyseer statistisch de resultaten van de levensvatbaarheid van de cel, met behulp van geschikte software.

Voer de biologische drievoudige waarden in om foutbalken te produceren en de variabiliteit van de test aan te geven. Voer een eenrichtingsanalyse van de variantietest uit om de veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen gedurende het experimentele tijdsbestek te onderzoeken met behulp van geschikte biostatistische software. Geef significante verschillen aan tussen de tijdstippen op de grafieken, zoals beschreven in het tekstmanuscript.

De levensvatbaarheid van twee neuroblastoomcellijnen, KellyLuc en IMR32, gekweekt op de steigers, werd beoordeeld. De verhoogde celdichtheid resulteerde in meer vermindering van het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel in de loop van de tijd. De celgroei op de steigers werd indirect gemeten door het DNA uit de steigers te kwantificeren en de cellen per monster werden berekend.

De IMR32-cellen vertoonden na verloop van tijd een verhoogde groei, daarna KellyLuc-cellen. De groeimorfologie en verdeling van cellen op de steigers werden visueel beoordeeld door middel van hematoxyline-, eosine- en immunohistochemische kleuring. KellyCis83-cellen groeiden sneller en infiltreerden dieper in beide steigersamenstellingen dan de minder invasieve Kelly-cellijn.

IMR32 gekweekt op nano-hydroxyapatiet vertoonde een contrasterend groeipatroon met grote, dicht opeengepakte clusters, gedurende 14 dagen. De celspecifieke eigenschappen werden gecontroleerd door immunohistochemische kleuring, gevolgd door phalloidine- en DAPI-kleuring, en de overvloed aan actine werd waargenomen in Kelly- en KellyCis83-cellen op collageen-glycosaminoglycaansteigers. Voor de in vitro cellulaire activiteitsbeoordeling werden uitgescheiden niveaus van chromogranine A gemeten, en de cellen gekweekt op collageen-glycosaminoglycaan en collageen nano-hydroxyapatiet steigers produceerden meer chromogranine A in vergelijking met de groei op conventionele 2D-cultuur.

De chemoresistente KellyCis83-cellijn scheidde meer chromogranine A af dan de Kelly-cellijn. Na celhechting kunnen cellen worden behandeld met verschillende therapieën. Dit zou fysiologisch relevantere resultaten opleveren voor de reactie van cellen op medicijnen dan conventionele 2D-kweek.

Deze techniek stelt onderzoekers in staat om beter te onderzoeken hoe kankercellen zich gedragen en reageren op een stimulus binnen de micro-omgeving van de tumor, variërend van respons op therapieën of interacties met andere celtypen.