Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

Blootstelling aan stress kan eiwitaggregatie veroorzaken en resulteren in significante veranderingen in het fenotypische gedrag van bacteriën. De procedure die in deze video wordt beschreven, maakt de extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na stressbehandeling mogelijk. In tegenstelling tot andere gepubliceerde procedures vereist dit protocol lagere celaantallen en onthoudt het zich van gecompliceerde fysieke verstoringsprocessen, evenals tijdrovende was- en incubatiestappen.

Dit protocol kan worden gebruikt om eiwitaggregatie te bestuderen in een breed scala aan gramnegatieve en grampositieve bacteriën. U kunt ook het effect van gendeleties analyseren of de werkzaamheid van proteotoxische verbindingen vergelijken. Begin met het inenten van een enkele kolonie E.coli-stam MG1655 en uropathogene E.coli-stam CFT073, elk in vijf milliliter lysogenesebouillon, of LB, medium.

Incubeer de twee bouillonculturen bij 37 graden Celsius en 300 rpm gedurende 14 tot 16 uur. Verdun elke stam tot een optische dichtheid van 600 nanometer, of OD600, van 0,1 tot een kolf van 500 milliliter met 70 milliliter MOPS-g medium. Incubeer de kolven bij 37 graden en 300 tpm totdat de middenfase is bereikt.

Breng na de incubatie 20 milliliter van elke cultuur over in drie voorverwarmde kolven van 125 milliliter en incubeer ze bij 37 graden Celsius en 300 tpm gedurende twee minuten. Bereid een antimicrobiële oplossing van twee milligram per milliliter in MOPS-g medium. Voeg deze oplossing toe aan elke cultuur om de gewenste concentraties te bereiken en voeg het vereiste volume MOPS-g-medium toe voor de onbehandelde regeling.

Bepaal de OD600 van elke cultuur na 45 minuten stressbehandeling. Voor elk monster wordt vier milliliter cultuur met een OD600 van één in centrifugebuizen van 15 milliliter opgenomen. Resuspend de celkorrels in 50 microliter ijskoude lysisbuffer.

Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs. Voeg 360 microliter ijskoude buffer A toe aan de monsters en meng voorzichtig door te pipetteren. Breng de monsters over in microcentrifugebuizen van twee milliliter met ongeveer 200 microliter glasparels van 0,5 millimeter.

Incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij acht graden Celsius in een ThermoMixer met schudden bij 1400 tpm. Incubeer de buizen vijf minuten op ijs zonder te schudden om de glaskralen te laten bezinken. Breng vervolgens 200 microliter van het cellysaat over in microcentrifugebuizen van 1,7 milliliter.

Centrifugeer het cellaat gedurende 20 minuten bij 16.000 keer g en vier graden Celsius. Verzamel het supernatant, dat later als oplosbaar eiwitmonster zal worden gebruikt. Gebruik een pipet om de pellet gedurende 20 minuten te resuspenderen in 200 microliter ijskoude buffer A.Centrifuge van de buizen bij 16.000 keer g en vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens voorzichtig het bovennatuurlijke geheel. Gebruik een pipet om de pellet voorzichtig opnieuw op te suspenderen in 200 microliter ijskoude buffer B.Centrifugeer de buizen opnieuw en verwijder voorzichtig het supernatant. Herhaal vervolgens de was met buffer A.Resuspend de pellet in 100 microliter van 1x reducerende SDS-monsterbuffer en kook deze gedurende vijf minuten in een ThermoMixer op 95 graden Celsius.

Meng een volume van 100% TCA met vier volumes van het oplosbare eiwitmonster dat eerder is verzameld en incubeer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius voor eiwitneerslag. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 21.000 maal g en vier graden Celsius om het neerslag te verkrijgen en verwijder het supernatant. Gebruik 200 microliter ijskoude aceton om de pellet te wassen, om cellulair vuil te verwijderen.

Centrifugeer het monster opnieuw om het neerslag te verkrijgen en verwijder het supernatant. Om de resterende aceton uit de pellets te verwijderen, houdt u de microcentrifugebuizen in de ThermoMixer op 37 graden Celsius met hun deksels open. Voeg vervolgens 100 microliter van 1x reducerende SDS-buffer toe om de pellet volledig op te lossen en kook het monster gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius.

Laad het monster onmiddellijk op een SDS-polyacrylamidegel voor scheiding of bewaar het monster bij min 20 graden Celsius om later verder te gaan. Bereid twee scheidende gels zoals beschreven in het teksthandschrift. Giet de gel tussen de glasplaten met behulp van een pipet van één milliliter, zodat de bovenste twee centimeter vrij is van het mengsel.

Voeg 70% ethanol toe aan de scheidingsgel, waardoor een gelijkmatige interface tussen de twee lagen ontstaat. Zodra de scheidingsgels zijn gepolymeriseerd, bereidt u de stapelgels voor met behulp van instructies in het tekstmanuscript. Verwijder vervolgens de ethanol uit de scheidingsgels en voeg de stapelgeloplossing toe.

Plaats voorzichtig een kam met het gewenste aantal zakken zonder luchtbellen in te brengen en laat de gel 20 tot 30 minuten polymeriseren. Laad vier microliter van elk monster, evenals de eiwitladder, in afzonderlijke putten. Laat de gel vervolgens gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in tris-glycine-loopbuffer op 144 volt lopen.

Gebruik voorverwarmde Fairbanks-oplossing A om de gels gedurende 30 minuten op een rocker te beitsen en voorverwarmde Fairbanks-oplossing D om de gels op een rocker te ontkleuren totdat de gewenste achtergrond is bereikt. Er werd een toename waargenomen in de hoeveelheid eiwitaggregatie gevormd wanneer cellen werden behandeld met 175 microgram per milliliter en 200 microgram per milliliter van de antimicrobiële stof, in vergelijking met onbehandelde cellen. De toename van de onoplosbare eiwitfractie was meer uitgesproken in de meer gevoelige MG1655-stam.

Een afname werd waargenomen in de hoeveelheid oplosbare eiwitten wanneer cellen werden behandeld met 175 microgram per milliliter en 200 microgram per milliliter van de antimicrobiële stof, in vergelijking met onbehandelde cellen. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat normalisatie naar de optische dichtheid bij 600 nanometer belangrijk is voor vergelijking van de mate van eiwitaggregatie in de monsters.