Reconstrueer humaan retinoblastoom in vitro

Humaan retinoblastoom is de meest voorkomende vorm van intraoculaire kanker in de kindertijd. Klinische monsters zijn moeilijk te verkrijgen en muizenmodellen kunnen het retinoblastoom niet vormen. Daarom is in vitro retinoblastoomgeneratie essentieel voor het observeren van retinoblastoomgenerese, proliferatie en groei, en voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische middelen.

De efficiëntie van dit protocol kan ongeveer 100% bereiken, hoewel de duur voor het genereren van retinoblastoom variabel is van dag 45 tot dag 120. Voor het onderhoud van retinoblastoom één of RB een knock-out menselijke embryonale stamcellen, kweek het gen bewerkte H negen cellen in een zes goed plaat bedekt met groeifactor verminderde keldermembraan matrix en verander het medium elke dag. Om de cellen te passeren, incubeer ze in EDTA-buffer gedurende 3,5 minuten bij 37 graden Celsius of vijf minuten bij kamertemperatuur.

Kweek de cellen totdat ze 80% samenvloeiing bereiken. Om vervolgens retinale celdifferentiatie te starten, verwijdert u het medium en spoelt u de cellen met één milliliter DPBS. Verhoog vervolgens de celkolonies door één milliliter Dispase-buffer toe te voegen en gedurende vijf minuten te broeden bij 37 graden Celsius.

Observeer de celkolonies onder een microscoop. Zodra de randen van de kolonies beginnen uit te rollen, ademt u de Dispase-buffer op en spoelt u de cellen eenmaal voorzichtig af met één milliliter DPBS. Voeg vervolgens een milliliter medium één toe aan de put en gebruik een standaardpipetpunt van 10 microliter en snijd de kolonies in stukken.

Gebruik een celschraper om de resterende cellen in het medium te schrapen. Oogst de cellen door centrifugeren in een buis van 15 milliliter. Laat na centrifugeren ongeveer 50 microliter van het supernatant achter om de cellen in het medium te verspreiden.

Voeg vervolgens 250 microliter groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix toe en meng door voorzichtige agitatie. Plaats na het mengen de buis van 15 milliliter met de gesuspendeerde cellen in een incubator van 37 graden Celsius. Na een incubatie van 20 minuten moeten de cellen en de groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix een gestolde gel vormen.

Voeg vervolgens een milliliter medium één toe aan de buis van 15 milliliter. Pipetteer met een pipet van één milliliter de gestolde gel twee tot drie keer om de klomp te verspreiden. Voeg vervolgens nog eens negen milliliter medium één toe en breng de celsuspensie over in een celkweekschaal van 10 centimeter.

Incubeer het gerecht op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Dit wordt beschouwd als dag nul. Onderzoek op de eerste dag de cellen met een microscoop.

Gemiddeld worden drie tot vier cysten waargenomen in één stuk gel. Verander op dag vijf het medium door het supernatant te verzamelen in een buis van 15 milliliter, waardoor de cysten zich onderaan kunnen nestelen en het supernatant worden vervangen door vers medium. Verspreid de cysten in de buis in twee schotels van 10 centimeter en zorg voor ten minste 300 cysten in elk gerecht.

Op dag zeven verspreiden de meeste cysten die aan het gerecht zijn bevestigd zich en vormen ze aanhangende kolonies. Vervang op dag 10 het medium door een vers medium en zorg ervoor dat alle cysten aan het gerecht blijven zitten. Observeer de cellen onder een microscoop van dag 13 tot 17 om ervoor te zorgen dat de cellen zich verspreiden.

Voeg op dag 15, na het eenmaal spoelen van de cellen met één milliliter DPBS, één milliliter Dispase-oplossing toe en incubeer bij 37 graden Celsius. Verwijder na vijf minuten de Dispase-buffer en spoel de culturen voorzichtig af met één milliliter DPBS. Voeg vervolgens 10 milliliter medium twee toe aan elke schaal van 10 centimeter en incubeer in een incubator van 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide.

Na 24 uur maken adherente culturen zich spontaan los en verzamelen zich tot retinale organoïden. Verzamel drie dagen na het losmaken de cellen uit de celkweekschaal in een buis van 15 milliliter. Wanneer de organoïden bezinken, verwijdert u het supernatant uit de buis en brengt u de organoïden over naar een nieuwe niet-hechtende petrischaal met 10 milliliter medium twee gedurende de volgende vier dagen.

Een week na de onthechting verander je het medium naar medium drie en kweek je vanaf deze dag de organoïden in medium drie. Op dag 27 van de retinale organoïde cultuur is de optische blaasjesarchitectuur duidelijk en ongeveer 90% van de organoïden vertoont deze structuur. De eerste detectie van het retinoblastoom vindt plaats op dag 45 en het wordt voelbaar op dag 50.

Wanneer het groeit tot dag 90, worden de optische blaasjesstructuren voornamelijk omhuld door het retinoblastoom. Het retinoblastoom kan nu worden geïsoleerd en verder worden gekweekt als een cellijn. Op dag 105 wordt meer dan 80% van de retinale organoïden volledig omhuld door het retinoblastoom.

Deze organoïden brengen de proliferatiemarker Ki67 en de oncogenmarker SYK sterk tot expressie in vergelijking met de H negen afgeleide retinale organoïden, wat wijst op tumorigenese. Bovendien toont een hoge expressie van de kegelprecursormarker ARR3 en fotoreceptorprecursormarker CRX in de retinoblastoomorganoïden aan dat ze afkomstig zijn van kegelvoorlopercellen. Inferieure en superieure resultaten tijdens de drie morfologische stadia van de generatie van retinoblastoom worden hier weergegeven.

Gedifferentieerde en ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden op basis van hun morfologie. De ongedifferentieerde cellen worden gekozen voor de vorming van retinoblastoom. Op dag vijf moet de gegenereerde bol hol zijn in plaats van vast.

Het retinoblastoom is afgeleid van de retinale organoïden die de architectuur van optische blaasjes vertonen. Er wordt geen retinoblastoom gegenereerd uit de inferieure organoïden. Tijdens het uitvoeren van de procedure moeten alle tips worden gekoeld en moet de keldermembraanmatrix op vier graden worden gesmolten voordat deze in de buis wordt toegevoegd.

Dit is een belangrijke stap voor dit differentiatieprotocol.