Toepassing van CRISPR-interferentie (CRISPRi) voor genuitschakeling bij pathogene soorten leptospira

Mijn naam is Jarlath Nally, en ik maak deel uit van het onderzoeksteam hier in het National Animal Disease Center in Ames, Iowa, en we werken aan leptospirose. Leptospirose is een verwaarloosde ziekte. Het is een wereldwijde ziekte.

En echt, we hebben een zeer beperkt begrip van hoe deze unieke groep bacteriën infectie veroorzaken. De presentatie van vandaag gaat dus over het bieden van een overzicht van een nieuw hulpmiddel dat beschikbaar is om de evaluatie van pathogene mechanismen van leptospirose te vergemakkelijken door specifiek specifieke genen uit teschakeling die worden uitgedrukt door leptospira, met behulp van een techniek die CRISPR-interferentie wordt genoemd. Het vermogen om newtonkolonies te selecteren is echter erg afhankelijk van het leveren van de beste groeimedia voor deze kieskeurige leptospira's.

Dus, ten eerste, gaan we je voorstellen aan Rick Hornsby, die heel kort een nieuw medium introduceerde om deze kieskeurige bacteriën te verspreiden. En dan stellen we je voor aan Louis Fernandez, die zal praten over de CRISPR interferentie methodologie om doelgenen binnen leptospira het zwijgen op te leggen. Hallo, ik ben Rick Hornsby.

Sinds hun identificatie door Anada meer dan 100 jaar geleden, zijn leptospira's meestal geïsoleerd en vermeerderd bij 29 graden Celsius, een temperatuur die noch de omgeving noch de lichaamstemperatuur van het gastheerlichaam van zoogdieren weerspiegelt. 10 jaar geleden begon USDA ERS met het onderzoeken van verbeteringen op leptospira media en uit dit onderzoek werd Hornsby-Alt-Nally media ontwikkeld. Met behulp van deze media zijn clinici en onderzoekers in staat geweest om leptospira's sneller te isoleren en te vermeerderen uit veldgevallen en in vitro onderzoek bij een temperatuur en in een omgeving die de gastheer van zoogdieren nauwer nabootst.

We blijven deze media optimaliseren, maar zoals het er nu uitziet, heeft de HAN aangetoond dat het potentieel is om veterinaire en menselijke klinische isolaties in vitro onderzoek en de ontwikkeling van effectievere vaccins voor de preventie van leptospirose aanzienlijk te verbeteren. Hallo, ik ben Louis Fernandez. Tot nu toe bleef de pathogenese van leptospirose ondergespannen, voornamelijk vanwege het gebrek aan effectieve en gemakkelijk uit te voeren genetische buizen.

Hier gaan we een nieuwe techniek beschrijven genaamd CRISPR interferentie of CRISPRi. En deze techniek is heel eenvoudig omdat we slechts twee componenten hoeven uit te drukken, een DNA-bindend eiwit genaamd dode Cas9, of dCas9, en een chimerisch RNA-molecuul genaamd single-guide RNA. En de complexe dCas9 en guide RNA gaan base pairing maken naar ons doelgen en daarmee transcriptie verminderen of zelfs blokkeren.

Ook door gebruik te maken van de nieuw beschreven HAN-media, zouden we de kolonievormingstijd voor een mutant herstel drastisch kunnen verkorten. De eerste stap is het definiëren van de protospacer die in de guide RNA zal worden opgenomen. Deze reeks bestaat uit 20 nucleotiden die de basiskoppeling met de gewenste gendoelen definiëren.

Dien een nucleotidesequentie in bij de webserver CHOPCHOP, met parameters gedefinieerd voor streptococcus pyogenes, Cas9 en protospacer aangrenzend motief, NGG. Selecteer op basis van de resultaten protospacers met de beste scores binnen de min-trend. Het NGG-motief wordt niet opgenomen in de uiteindelijke reeks.

We hebben de lipL32-promotor gebruikt voor het uitdrukken van de single-guide RNA, die de variabele 20 nucleotiden op vijf-priemgetal zal bevatten op een geconserveerde dCas9-steiger. Na het verkrijgen van de cassette wordt deze gedegradeerd naar de PMaOri. dCas9 plasmide op de Xma1 beperkingssite.

Voor conjugatie worden leptospiracellen gekweekt bij 29 of 37 graden celsius in HAN-media. Een dag voor een vervoeging worden donorgegaliseerde cellen gekweekt in LB-media aangevuld met diaminopimelic acid, DAP en spectinomycine. Vervolgens, op de dag van vervoeging grill de verzadigde E.coli culturen in LB plus DAP.

In een bioveiligheidskap monteerde u het filterapparaat door het membraanfilter bovenop de glazen basis te plaatsen, gevolgd door een glazen trechter van 15 ML. Beide stukken worden door deze veerklem bij elkaar gehouden. Sluit vervolgens het glas aan op een vacuümpomp en voeg vijf ML leptospiraculturen toe aan de trechter.

Voeg vervolgens de E.Coli beta 2163-stam toe die de plasmide van belang bevat. Het volume zal variëren afhankelijk van de optische dichtheid van de cultuur. We streven naar een-op-een cel pipersion.

Draai de vacuümpomp, nu vloeistoffen komen we door het membraan en cellen zullen er bovenop worden geconcentreerd. Neem het filter en plaats het op EMJH plaat plus DAP, bicurier kant naar boven. Incubeer de platen 24 uur lang op 29 graden Celsius.

Haal vervolgens de filters terug van de platen en plaats deze in een conische buis van 50 ML. Gebruik één ML vloeibare HAN-media om de cellen uit het filter te herstellen door middel van pipetten. Visualiseer de teruggewonnen cellen door microscopie in het donkere veld.

In dit stadium zijn equivalente aantallen E.coli en leptospiras te zien. 100 tot 200 microliter wordt gebruikt om de bacteriën te verspreiden op HAN-platen die spectinomycine bevatten. In dit stadium wordt DAP weggelaten en zal E.coli niet groeien.

Platen worden geïncubeerd bij 37 graden celsius en 3%CO2. Kolonies moeten tussen de acht en 10 dagen zichtbaar zijn. Leptospira interrogans kolonies zijn een beetje lastig te visualiseren.

Hier laten we overwoekerde kolonies zien om het gemakkelijker te maken om ze te zien. Voeg 100 microliter vloeibare HAN toe aan 1,5 ML buizen voor het terugwinnen van de mutanten. Het wordt aanbevolen om ten minste drie kolonies van elke plaat te nemen.

Met behulp van een pipetpunt worden individuele kolonies uit de platen gehaald. Agger wordt naar verwachting alleen genomen. Kolonies moeten worden genomen van controleplaten die MTP PMaOri bevatten.

dCas9 plasmide. En platen met leptospira's die plasmide bevatten met zowel dCas9 als guide RNA ontworpen voor het doelgen. De teruggewonnen cellen kunnen nu worden gevisualiseerd onder donkere veldmicroscopie om de aanwezigheid van leave viable leptospiras te bevestigen.

Na visualisatie van verlofleptospiras, cellen overbrengen naar vloeibare HAN-media die spectinomycine bevatten. Na kweekgroei kunnen cellen nu worden hersteld voor het dempen van bevestiging en fenotype-evaluatie. Als antilichamen tegen de doeleiwitten beschikbaar zijn, is immunoblot een eenvoudige methodologie om de demping te evalueren.

Leptospiras die pMAOri bevatten. dCas9 alleen, of met de gids RNA Cas worden geëvalueerd door PCR, hout flankerende primers. DMT plasmide zal resulteren in een band van ongeveer 300 basispaar en een slechts soort van ongeveer 700 wordt bereikt wanneer de guide RNA cassette aanwezig is.

Immunoblots met behulp van hele celextracten worden uitgevoerd voor het dempen van bevestiging, lipL32 eiwitexpressie wordt afgeschaft in cellen die plasmiden bevatten uitgedrukt in dCas9 en begeleiden RNA gericht op dit gen. En zowel link a als link B ontbreken in cellen die de guide RNA bevatten, is specifiek voor beide genen. De controlelipL41 is op alle rijstroken te zien.

Dus we hebben CRISPR interferentie gebruikt op leptospira interrogans, we hebben het ook gebruikt op verschillende extra pathogene soorten leptospira. We hebben het gebruikt om specifieke genen het zwijgen op te leggen, en om de expressie van kleine niet-coderende RNA's het zwijgen op te leggen. Ons onderzoeksinteresse is het begrijpen van pathogene mechanismen van infectie, dus we kijken meestal naar het identificeren van variantiefactoren, maar het is duidelijk dat u uw eigen gen naar keuze en volgens uw eigen onderzoeksgebied het zwijgen kunt opleggen.

En dat kan bijvoorbeeld beweeglijkheid zijn of begrijpen hoe leptospira's in de omgeving of het metabolisme blijven bestaan. In ieder geval moet u in staat zijn om een specifieke mutant te genereren waarmee u functionele genomica kunt uitvoeren en de biologische betekenis van het betreffende gen kunt begrijpen. Dus van ons allemaal hier in het National Animal Disease Center, wensen we u veel succes met uw onderzoek.