Eencellige karakterisering van calciuminstroom en HIV-1-infectie met behulp van een Multiparameter Optofluidic Platform

Dit protocol kan real-time kinetiek vastleggen op een enkelcellig niveau. We kunnen individuele celparameters meten als reactie op hiv-infectie en vroege signaleringsgebeurtenissen koppelen aan vertraagde stappen van de virale levenscyclus. Dit is een geïntegreerd schaalbaar alternatief voor traditionele beeldvormingsmethoden met behulp van een nieuw optofluidic-platform voor het sorteren, cultiveren, weergeven en automatiseren van één cel.

Dit is de eerste gevestigde methode voor nanofluïdische, high-throughput, longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming. Deze techniek kan in grote lijnen worden gebruikt om cellulaire signaalkinetiek en dynamische moleculaire interacties in verschillende ziektetoestanden te bestuderen. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk om over te brengen hoe het experiment is opgezet, hoe cellen optisch in pennen worden gesorteerd en hoe infusies via de chip kunnen worden opgezet.

Bereid om te beginnen verse Fluo-4 AM-laadoplossing door 25 microliters van 100X geconcentreerd reinigingsmiddel en 2,5 microliter 1,000X Fluo-4 AM toe te voegen aan een buis van 1,5 milliliter en vervolgens vortex om te mengen. Pipetteer 2,5 milliliter kweekmedia in de laadoplossing en keer om om te mengen. Centrifugeer twee miljoen MT-4 cellen op 500 maal G gedurende drie minuten, verwijder vervolgens media en resuspendeer de pellet in twee milliliter van de bereide Fluo-4 AM laadoplossing.

Pipet opnieuw opgehangen cellen in een 35 millimeter Petrischaal. Incubeer gedurende 15 tot 30 minuten op 37 graden Celsius en incubeer vervolgens nog eens 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis en centrifugeer de cellen gedurende drie minuten op 500 maal G en verwijder vervolgens het supernatant.

Resuspendeer de celkorrel door een milliliter van het kweekmedium in te pipetten en centrifugeer gedurende drie minuten op 500 maal G om te wassen. Resuspendeer de celkorrel door het kweekmedium in te pipetten met een concentratie van twee miljoen cellen per milliliter voor ten minste 50 microliter. Om een chip te bereiden met de bevochtigingsoplossing, die het pennen van cellen vergemakkelijkt, laadt u centrifugebuizen met twee milliliter bevochtigingsoplossing en 50 milliliter gedeioneerd water op het instrument met een nieuwe optofluidische chip en voert u de natte spaanfunctie uit die de chip zal overspoelen met de bevochtigingsoplossing.

Incubeer de chip op 50 graden Celsius en spoel de chip drie keer door met water. Zodra het spoelen van water is voltooid, spoelt u de chip met drie cycli van 250 microliter kweekmedia. Vul de celsuspensie van de vorige stap aan met één per 100 delen F127-reinigingsmiddel voor het laden om de kans te verkleinen dat cellen aan de spaankanalen blijven plakken.

Gebruik de instrument export naald om cellen te importeren uit een 1,5 milliliter centrifuge buis met de belasting werking en klein volume importeren voor een vijf microliter cel pakket volume. Pencellen met behulp van een geoptimaliseerde opto-elektronische positionering of OEP-spanning van 4,3 volt en vijf micrometer per seconde kooisnelheid met behulp van de auto-penfunctie, die afzonderlijke cellen automatisch detecteert, ze omringt met een OEP-kooi en ze naar een nabijgelegen pen verplaatst. Als cellen van belang blijven na automatisch schrijven, gebruikt u de handmatige penfunctie om doelcellen en een doelpen te selecteren.

Zodra het pennen is voltooid, spoelt u de chip met drie cycli van 250 microliter kweekmedia om eventuele resterende niet-getinte cellen uit de chip te wissen. Na het schrijven van cellen, verkrijg fluorescerende beelden van cellen in FITC, Texas Red en DAPI kanalen om de baseline Fluo-4, mCherry en autofluorescentie te meten. Giet HIV-1 in de microchip bij een concentratie van 13 nanogram HIV-1 NLCI per twee miljoen cellen door de suspensie langzaam via de exportsaald in de chip te gieten.

Onmiddellijk na hiv-1 toevoeging, herhaaldelijk verkrijgen van beelden in de FITC en DAPI kanalen over een 10-minuten durende tijd cursus. Verkrijg beelden in de Texas Red- en DAPI-kanalen op één, twee, drie en vier dagen na infectie. Deze methode werd gebruikt voor de identificatie en clustering van hiv-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen via mCherry-meting.

Cellen met een verandering in mCherry signaal groter of lager dan 40,000 gemiddelde fluorescerende intensiteit werden geclusterd in de mCherry hoge of mCherry lage populatie respectievelijk. Deze clusters werden geanalyseerd op calciuminfluxkinetiek door intracellulair calcium te meten met behulp van Fluo-4 fluorescentie herhaaldelijk gedurende een tijdsverloop van negen minuten, wat vroege calciuminstroom in hiv-geïnfecteerde cellen aantoonde. Een significante positieve correlatie tussen calciuminstroom en mCherry florescentie werd waargenomen.

Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om te beginnen met de cellen binnen het exponentiële groeibereik voor zowel virusproductie als infectie, omdat overwoekerde cellen zullen resulteren in een dramatische afname van het signaal van deze test. Werken met HIV-1 kan gevaarlijk zijn. Daarom moeten BSL-2-praktijken zoals aangegeven in de OSHA Bloodborne Pathogen Standard altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Deze techniek is opwindend omdat het ons in staat zal stellen om eencellige fenotypische of transcriptieveranderingen onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. Dit heeft een breed potentieel voor het correleren van de impact van stimuli op moleculaire paden in veel celtypen.