Name: 5-Ethynyl-2-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer een EdU/pH3-duallabelprotocol voor celcyclusanalyse in Drosophila neurale stamcellen. Deze methode categoriseert neuroblasten in G1-, S- en M-fasen voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Swiss National Science Foundation (projectsubsidie 31003A_173188; www.snf.ch) en de Universiteit van Bern (www.unibe.ch) aan BS. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

1. Voorbereiding van reagentia en voorraden voor click-it EdU-test
OPMERKING: Raadpleeg de tabel met materialen en tabel 1 voor meer informatie over de kit en reagentia die bij de kit zijn geleverd.
<ol><li>Breng de injectieflacons op kamertemperatuur voordat u de oplossingen bereidt.</li>
	<li>Bereid een voorraadoplossing van 10 mM EdU (component A) door toevoeging van 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO, component C). Meng goed en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid een werkoplossing van Alexa Fluor 647-azide (component B) voor door 70μL DMSO (component C) toe te voegen. Meng goed en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid een 1x-oplossing van Click-iT EdU-reactiebuffer (component D) door 4 ml van deze oplossing te mengen met 36 ml gedeïoniseerd water. Bewaar de resterende oplossing bij 2-6 °C.</li>
	<li>Maak een 10x bouillon (200 mg/ml) van het Click-iT EdU bufferadditief (component F) door 2 ml gedeïoniseerd water toe te voegen. Meng goed en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bewaar Hoechst 33342 (component G) bij 2-6 °C. DMSO (component C) bewaren in een exsiccator bij -20 °C. OPMERKING: Handschoenen moeten worden gebruikt om DMSO en Hoechst te hanteren.</li>
</ol>2. Dissectie van derde instar larvale hersenen en EdU-opname
OPMERKING: Het protocol voor hersendissecties is eerder beschreven12. Voordat u met dissecties begint, moet u ervoor zorgen dat voldoende hoeveelheden van de EdU- en PFA-oplossingen worden bereid en ontdooid zoals beschreven in 2.6 en 3.1.
<ol><li>Bereid 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door 25,6 g Na2HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl en 2 g KH2PO4 toe te voegen aan 1 l gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 7,4 en bereid vervolgens een 1x-oplossing in gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Voeg Schneiders dissectiemedium (SM) toe aan twee opeenvolgende depressies van een glazen (3 of 9) depressieglasvlekplaat. Voeg 1x PBS toe aan de volgende opeenvolgende depressie.</li>
	<li>Pluk met behulp van een tang zwervende derde instarlarven en plaats op een weefsel bevochtigd met PBS om vliegenvoedselresten te verwijderen. Plaats de larve in de depressie met PBS en vervolgens in de opeenvolgende depressie met SM.</li>
	<li>Verwijder met een fijne tang 3/4e van het onderlichaam van de larve.<ol>
<li>Pak voorzichtig de larvale mondhaken vast met een tang en houd de cuticula aan het andere uiteinde vast met de andere tang.</li>
		<li>Keer de kop van de larve binnenstebuiten door de mondhaken naar binnen te duwen en tegelijkertijd het weefsel aan het andere uiteinde af te pellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observeer de larvale hersenen met bevestigde denkbeeldige schijven. Verwijder andere weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd en breng de hersenen over naar de volgende opeenvolgende depressie met SM.</li>
	<li>Ontdooi de 10 mM EdU stockoplossing. Bereid een oplossing van 100 μM door deze voorraad van 10 mM te verdunnen in SM.</li>
	<li>Voeg 100 μL van deze 100 μM EdU+SM oplossing toe in een andere depressie op de Pyrex plaat. Incubateer ~5-10 ontleedde hersenen in 100 μL 100 μM EdU+SM oplossing gedurende 2 uur bij 25 °C. OPMERKING: Omdat NB's eenmaal in ~ 2 uur delen, heeft dit protocol tot doel één volledige celcyclus te analyseren. Gebruik intacte hersenen alleen voor verdere stappen. Gooi hersenen weg die beschadigd zijn tijdens dissectie.</li>
</ol>3. Fixatie en immunostaining
<ol><li>Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in een zuurkast.<ol>
<li>Voeg 4 g paraformaldehydepoeder toe aan 80 ml 1x PBS in een bekerglas op een magneetroerder en verwarm tot 60 °C. Om PFA op te lossen, voeg een paar druppels van 1 N NaOH toe. Controleer de pH en pas deze indien nodig aan op 7,0 met een paar druppels van 1 M HCl.</li>
		<li>Stel het volume in op 100 ml met 1x PBS. Vul de PFA-oplossing aan en bewaar tot 1 maand bij 2-6 °C. Voeg 0,3% niet-ionisch wasmiddel (zie de tabel met materialen)toe aan de PFA-oplossing voor een efficiënte fixatie van grote weefsels zoals de larvale hersenen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng na EdU-opname de hersenen over naar microcentrifugebuizen van 0,6 ml die 4% PFA bevatten. Incubeer bij kamertemperatuur op een nutator gedurende 15 min. Tik op de buis op de laboratoriumbank zodat de hersenen zich op de bodem van de buis nestelen.</li>
	<li>Verwijder de PFA en was 3 keer met PBS + 0,3% niet-ionisch wasmiddel (PBST) bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat elke wasbeurt minstens 10 minuten duurt op een nutator. Verwijder na de laatste wasbeurt PBST, voeg een blokkerende oplossing (PBST + 5% runderserumalbumine) toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdund anti-Miranda-antilichaam (1:250) en anti-pH3-antilichaam (1:200) in PBST (beide antilichamen in dezelfde buis). Verwijder de blokkerende buffer en voeg de primaire antilichaamoplossing toe. Incubeer een nacht bij 2-6 °C op een nutator. OPMERKING: Miranda is een membraaneiwit dat aanwezig is op CB NBs. Het dient om deze grote ronde cellen in het CB-gebied te identificeren13.</li>
	<li>Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was 3 keer met PBST. Zorg ervoor dat elke wasbeurt 10 minuten duurt op een nutator bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid secundaire antilichaamoplossing voor door 1:500 verdunde Alexa Fluor 488 anti-Rabbit en Alexa Fluor 568 anti-Rat toe te voegen aan PBST. Verwijder de PBST en voeg de secundaire antilichaamoplossing toe aan de ontlede hersenen. Incubeer een nacht bij 2-6 °C in het donker, op een nutator, en was 3 keer met PBST (stap 3.5).</li>
</ol>4. EdU-detectie, DNA-kleuring en montage
<ol><li>Om de EdU-detectiecocktail te bereiden, mengt u de componenten (zie tabel 2)in een buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Verwijder na de laatste wasbeurt (stap 3.6) PBST en voeg de EdU-detectiecocktail toe aan de ontlede hersenen. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten op een nutator. Was 2 keer met PBST gedurende 10 minuten elk, in het donker.</li>
	<li>Verdun voor DNA-kleuring Hoechst 33342 (component G) 1:2.000 in PBST om een oplossing van 5 μg/ml te bereiden.</li>
	<li>Verwijder PBST na de tweede wasbeurt (stap 4.2) en voeg 500 μL 5 μg/ml Hoechst-oplossing toe aan de ontleedde hersenen. Incubeer in het donker gedurende 10 min. Verwijder Hoechst en was eenmaal met PBST gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Tik op de buis op de laboratoriumbank en laat de hersenen tot rust komen. Haal de PBST uit de buis, maar laat slechts 50-100 μL achter.</li>
	<li>Snijd het uiteinde van een micropipettetip van 200 μL en breng de hersenen voorzichtig over op een schone glazen dia. Verwijder overtollige PBST van de dia door te deppen met filtreerpapierstroken. Pas op dat het filterpapier de hersenen niet raakt.</li>
	<li>Plaats een druppel in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium op de hersenen en oriënteer de hersenen zodanig dat het ventrale zenuwstreng naar de dia is gericht en de lobben naar boven gericht. Rangschik de hersenen in een enkel bestand, zodat het gemakkelijker is om de hersenen serieel in beeld te brengen.</li>
	<li>Plaats voorzichtig een deklap bovenop de hersenen. Plaats de glijbaan 's nachts op 2-6 °C. OPMERKING: Het montagemedium hardt uit bij nachtopslag, zodat het niet nodig is om de deklip af te dichten met nagellak.</li>
</ol>5. Beeldvorming
OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de laserscanmicroscoop en het olie-onderdompelingsobjectief dat in dit protocol wordt gebruikt.
<ol><li>Selecteer in de acquisitiesoftware de doelstelling 63x.</li>
	<li>Doe een druppel dompelolie op de coverslip net boven de gemonteerde hersenen om het weefsel gemakkelijker door het oculair te lokaliseren.</li>
	<li>Gebruik het DAPI/Hoechst 33342-kanaal om de hersenen via het oculair te vinden en schakel vervolgens over naar de acquisitiemodus in de software.</li>
	<li>Stel 4 kanalen in om Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) en Alexa Fluor 647 (EdU) in beeld te brengen. Gebruik de kleurstofassistent, die automatisch de excitatielasers en emissiefilters voor de geselecteerde kleurstoffen instelt.</li>
	<li>Stel het gezichtsveld zo in dat het de hele hersenkwab omvat. Stel je het volledige volume van de hersenkwab voor door z-stacks te verkrijgen die 0,8 μm uit elkaar staan. Sla alle afbeeldingen van een beeldbewerkingssessie op in een *.lif-bibliotheekindeling.</li>
</ol>6. Beeldanalyse
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de analyse van verkregen beelden en hoe cellen te sorteren in G0/G1-fase, S-fase, S>G2/M (progressie van S naar G2/M) en M-fase met behulp van de ImageJ-software.
<ol><li>Download Fiji (Fiji is ImageJ) vanaf de volgende URL: https://fiji.sc/. Open Fiji en sleep de LIF-bestanden naar Fiji. OPMERKING: Fiji is een versie van ImageJ die vooraf is geïnstalleerd met verschillende plug-ins14. Het overbrengen van .lif-bestanden naar Fiji opent de Plug-in Bio-formats, die nodig is om de .lif-bestanden te verwerken. Bio-formaten plugin is ook vereist om beeldbestanden gegenereerd van sommige andere microscoop merken, bijvoorbeeld nd2 bestanden gegenereerd met een Nikon microscoop te openen. Deze plug-in wordt vooraf geïnstalleerd met Fiji.</li>
	<li>Selecteer Gegevensbrowser op het tabblad Stapelweergave en gebruik virtuele stapel op het tabblad Geheugenbeheer in de plug-in bio-indelingen. OPMERKING: Lif-bestanden met z-stacks van 8-10 hersenen zijn vaak 300-400 megabytes groot. Op computers met weinig RAM kan het openen van een paar van dergelijke bestanden het beschikbare RAM-geheugen op ImageJ snel uitputten en verdere beeldverwerking voorkomen. Virtuele stack is 'read-only', heeft geen hoog RAM-geheugen nodig voor verwerking en is een ideale optie om grote datasets op Fiji te laden.</li>
	<li>Observeer de meerkanaalsafbeelding die wordt weergegeven in ImageJ. Wijzig de kleur van de kanalen in de menubalk met het gereedschap Afbeelding | kleur | kanalen. Observeer de Miranda-gelabelde NB's als grote ronde cellen in het CB-gebied.</li>
	<li>Teken een interessegebied (ROI) met behulp van de ellipstool over elke NB om te voorkomen dat de NB twee keer wordt geteld.<ol>
<li>Selecteer in de menubalk ImageJde optie | tools analyseren | ROI-manager. Markeer alle NBs in de huidige z-sectie en druk op t nadat u elke cel hebt gemarkeerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra alle NBs in de huidige z-sectie zijn gemarkeerd, wijzigt u de kanalen in pH3 en EdU en telt u handmatig het aantal EdU-positieve NBs, pH3-positieve NBs, NBs die positief kleuren voor zowel EdU als pH3, en NBs die niet kleuren voor beide markers.</li>
	<li>Zoek naar NBs in volgende z-secties, verwijder oude ROI's en voeg nieuwe ROI's toe om KB's in verschillende stacks te tellen.</li>
	<li>Maak een spreadsheet met de volgende kolommen: 1. EdU- pH3-: deze sectie vertegenwoordigt de dubbelnegatieve cellen die zich in de G0/G1-fase van de celcyclus bevinden; 2. EdU+: de cellen in deze categorie hebben EdU opgenomen en ondergaan DNA-replicatie (S-fase); 3. EdU+ pH3+: deze dubbelpositieve cellen hebben de S-fase voltooid en zijn gevorderd tot de G2- of M-fase; 4. pH3+: deze NB's ondergaan mitose.</li>
	<li>Bereken percentages van NBs aanwezig in alle bovenstaande 4 categorieën voor elke lob. Bereid een staafdiagram voor met behulp van de spreadsheetsoftware met de gepoolde gegevens voor percentages VAN KB's in elke categorie.</li>
</ol>

<ol><li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li>
<li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review+of+regulation%2C+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li>
<li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li>
<li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894(2015).</li>
<li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+regulation+by+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers%3A+A+comparative+study+with+Ki67%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461(2010).</li>
<li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913(2020).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li>
<li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miranda%2C+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division%2C+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li>
<li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NVX-412%2C+a+new+oncology+drug+candidate%2C+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015(2012).</li>
<li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53%2Fp21%28WAF1%29+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li>
<li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+S-phase+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Developing S-phase control.</a> Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li>
<li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li>
<li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29-coupled-fluorescence-intensity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517(2017).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li>
<li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

EdU-opname en de daaropvolgende 'klik'-reactie met celdoorlatend azide biedt praktische voordelen van deze techniek ten opzichte van de BrdU-methode die eerder werd gebruikt7. Deze reactie wordt echter gekatalyseerd door Cu(I)-ionen en verschillende kleurstoffen kunnen onstabiel zijn in de aanwezigheid van deze koperkatalysator, zoals duidelijk wordt geadviseerd door de Click-it EdU-kitfabrikant. Wanneer immunostaining-experimenten waren uitgevoerd na het uitvoeren van de EdU-detectiestap, werd de...

De celdelingscyclus bestaat uit een G1-fase (eerste gapfase), een replicatieve/S-fase, een G2-fase (tweede gapfase) en een M-fase (mitotische fase). Door deze fasen ondergaat de cel dramatische veranderingen in cellulaire transcriptie, vertaling en reorganisatie van cytoskeletmachines1,2. Als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen kunnen cellen tijdelijk ophouden te delen en rustig (G0) of differentiëren worden en permanent ophouden te delen3. Andere scenario's, zoals DNA-schade, kunnen voortijdige differentiatie of apoptoseveroorzaken 3,4. Reactie op dergelijke signalen wordt gemedieerd door controlepunten voor de celcyclus, die fungeren als een bewakingssysteem om de integriteit van essentiële cellulaire processen te waarborgen voordat de cel zich verbindt aan de volgende fase van de delingcyclus5. Daarom moeten studies naar genen die DNA-replicatie, checkpoints en mitotische machines reguleren, mogelijke celcyclusprogressiedefecten analyseren die kunnen optreden in mutante cellen of bij siRNA-knockdown van deze genen. Bovendien kunnen dergelijke analyses worden gebruikt om de algehele celgezondheid en cellulaire reacties op medicamenteuze behandeling te testen.
5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) is een thymidine-analoog dat tijdens replicatie in het DNA wordt opgenomen6. Deze methode werd uitgebreid gebruikt om cellen in de S-fase te identificeren. De cellen worden vervolgens echter onderworpen aan strenge DNA-denaturatieprocedures om detectie van BrdU mogelijk te maken door het gebruik van anti-BrdU-antilichamen6. Deze harde behandeling kan cellulaire epitopen beschadigen en verdere karakterisering van het monster door immunostaining voorkomen. EdU-opname en daaropvolgende detectie door een kopergekatalyseerde,'klikreactie' met kleine, celdoorlatende, fluorescerend gelabelde azidekleurstoffen elimineert de noodzaak van agressieve denaturatieprocedures7. Deze methode kwam daarom naar voren als een praktischer alternatief voor BrdU-integratie.
Verder is pH3 beschreven als een betrouwbare marker voor mitotische / M-fasecellen8. Histon H3 is een DNA-geassocieerd kernhitoneiwit dat rond de late G2-fase tot vroege M-fase wordt gefosforyleerd en tegen het einde van anafase8wordt gedefosforyleerd. Verschillende commerciële antilichamen kunnen worden gebruikt om pH3 te detecteren met behulp van standaard immunostainingprotocollen. Dubbele kleuring van EdU en pH3 zou daarom de detectie van cellen in zowel S-fase als M-fase mogelijk maken. Bovendien zouden cellen in de G1- en vroege G2-fase voor geen van de markers positief kleuren.
Drosophila neurale stamcellen of neuroblasten (NBs) bieden een goed gekarakteriseerd stamcelmodel waarbij cellen zich asymmetrisch delen om één identieke zelfvernieuwende NB en een ganglionmoedercel (GMC) te produceren, die is vetgemest voor differentiatie9. Daarnaast maken verschillende genetische hulpmiddelen en NB-specifieke antilichamen dit systeem geschikt voor genetische manipulatie en live-cell imaging. Bijgevolg hebben verschillende studies NBs gebruikt om genen te bestuderen die asymmetrische delingen en bepaling van het lot van cellen reguleren9. Verschillende populaties van NB's bestaan in de centrale hersenen (CB) en de optische kwab (OL) van de larvale hersenen9; Cb-nbb's werden gebruikt voor de huidige studie. Deze derde instar larvale CB NBs zijn grote cellen die ook geschikt zijn voor het bestuderen van factoren die de mitotische spindelassemblage reguleren. Een protocol om progressiedefecten van de celcyclus te analyseren zou een essentieel hulpmiddel zijn in dergelijke studies.
Protocollen die eerder zijn gepubliceerd, gebruikten commerciële kits, zoals Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, die verschillende reactiecomponenten en azidekleurstoffen bieden die zijn getagd met een verscheidenheid aan Alexa Fluor-kleurstoffen voor EdU-opname en -detectie10. De reagentia die bij dergelijke kits worden geleverd, zijn echter niet compatibel met sommige fluorescerende tags die vaak worden gebruikt met secundaire antilichamen. Deze EdU-detectiekit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit geleverd met Alexa Fluor 647-geconjugeerde azidekleurstof) werd getest in Drosophila derde instar larvale NB's, en co-kleuring werd geprobeerd met antilichamen tegen pH3 en Miranda, een marker voor NBs. Verder werden Alexa Fluor 568- of Cy3-gelabelde secundaire antilichamen gebruikt voor de detectie van Miranda-etikettering op het plasmamembraan van NBs11. De verwachte signaalintensiteit en het kleuringspatroon (niet-gepubliceerde resultaten) werden echter niet waargenomen met deze secundaire antilichamen wanneer immunostaining werd uitgevoerd na EdU-detectie.
Voor EdU-opname vereiste het door Daul en collega's beschreven protocol voeding van de larven met Kankel-White-medium gemengd met EdU en broomfenolblauw (BPB)10. De larven voedden zich met het EdU- en BPB-spiked voedsel, dat te zien was aan de blauwe kleur bij inname in de larvale darm. Hoewel deze methode werd gebruikt voor EdU-opname in Mms19-functieverlies (Mms19P) derde instarlarven, voedden de Mms19P-larven zich blijkbaar niet omdat er nauwelijks een blauwe kleur werd gedetecteerd in de larvale darm (ongepubliceerde resultaten). De Mms19P-larven vertonen drastische ontwikkelingsmisvormingen en stoppen uiteindelijk in het derde instarstadium. Dit kan op de een of andere manier het voedingsgedrag van de derde instarlarven beïnvloeden en het EdU-voedingsprotocol ongeschikt maken voor dergelijke gevallen.
Na bestudering van de beschikbare literatuur en uitgebreid werken aan de standaardisatie van essentiële stappen, werd een alternatieve aanpak voorgesteld voor EdU/pH3 dual-labeling in Drosophila NBs, waarvoor geen EdU aan larven hoeft te worden gevoerd. Een eerdere studie gebruikte dubbele EdU / pH3-kleuring om de celcyclus in OS's te analyseren, maar presenteerde geen gedetailleerd protocol4. Dit vormt een onnodige hindernis voor laboratoria die deze methode proberen te implementeren. Bovendien kan het evalueren van de compatibiliteit van verschillende reagentia met de EdU-kit en het uitvoeren van verdere optimalisatie een tijdrovend proces zijn. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol dat betrekking heeft op EdU-opname in ontleed larvale hersenen en immunostaining met anti-pH3-antilichamen, gevolgd door confocale microscopie en beeldanalyse om NBs toe te wijzen aan vier verschillende categorieën: G0 / G1-fase, S-fase, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fase. De stappen die moeten worden geoptimaliseerd, worden beschreven en tips gegeven voor beeldanalyse van grote datasets. Bovendien wordt de EdU / pH3-uitlezing in wild-type NBs geanalyseerd en vergeleken met Mms19P NBs, waarvan onlangs werd gemeld dat ze een celcyclusvertraging11.

<table><tbody><tr><td>vliegstammetjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td><td>Bloomington stock center</td><td>#15477</td><td>P-element insertie in het derde exon van Mms19</td></tr><tr><td>&nbsp;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td><td>Gegenereerd in huis</td><td></td><td>eGFP-getagged Mms19-eiwit uitgedrukt in Mms19p achtergrond</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington stock center</td><td>#3605</td><td>wild-type stam (w;+;+)</td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td></td><td></td><td>Verdunning</td></tr><tr><td>Rat anti-Miranda</td><td>Abcam</td><td>Ab197788</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pH3</td><td>Cell Signaling</td><td>9701</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rat Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>112-165-167</td><td>1/150</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A27034</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Reagens/Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount montagemedium</td><td>Polysciences Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Click-it EdU incorporatiekit, Alexa Flour 647</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&rsquo;s Drosophila-medium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA) fractie V</td><td>Merck</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fischer Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>niet-ionogene detergent</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (Imagej)</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRISM</td><td>Graph pad software</td><td>Versie 5</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft office</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscoop met 63x olie-immersie, 1.4 NA Plan-apochromat objectief</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount montagemedium</td><td></td><td></td><td>wateroplosbaar, niet-fluoriserend montagemedium</td></tr><tr><td>Pyrex 3 of 9 depressieglas spotplaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

In vivo celcyclusprogressieanalyse wordt routinematig uitgevoerd in studies naar genen die mitose en DNA-replicatie reguleren. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is gebruikt om replicatieve / S-fase progressie te onderzoeken, terwijl antilichamen tegen fosfo-histon H3 zijn gebruikt om mitotische kernen en cellen te markeren. Een combinatie van beide labels zou de classificatie van G0/G1 (Gap-fase), S (replicatief) en M (mitotisch) mogelijk maken en dienen als een belangrijk hulpmiddel om de effecten van mitotische gen-knockdowns of nulmutanten op de progressie van de celcyclus te evalueren. De reagentia die worden gebruikt om EdU-gelabelde cellen te markeren, zijn echter niet compatibel met verschillende secundaire antilichaam-fluorescerende tags. Dit bemoeilijkt immunostaining, waarbij primaire en gelabelde secundaire antilichamen worden gebruikt om pH3-positieve mitotische cellen te markeren. Dit artikel beschrijft een stap-voor-stap protocol voor de dual-labeling van EdU en pH3 in Drosophila larvale neurale stamcellen, een systeem dat uitgebreid wordt gebruikt om mitotische factoren te bestuderen. Daarnaast is er een protocol voor beeldanalyse en kwantificering om gelabelde cellen toe te wijzen in 3 verschillende categorieën, G0/ G1, S, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fasen.

De bi-lobed Drosophila derde instar larvale hersenen is gebruikt als een modelsysteem om fundamentele cellulaire en ontwikkelingsprocessen te bestuderen9. De focus van de huidige studie was om een protocol te presenteren voor analyse van celcyclusprogressie in EdU- en pH3-gelabelde NBs van de CB-regio(figuur 1). De CB NB's zijn onderverdeeld in type I en type II en vertonen het karakteristieke asymmetrische delingpatroon9. Elke type I ...

Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

In dit protocol geven we niet alleen een gedetailleerde uitleg van elke stap van EDU-integratie en immunostaining, maar geven we ook uitleg over beeldacquisitie, beeldverwerking en geven we enkele tips voor het analyseren van grote datasets. Deze techniek maakt de toewijzing van cellen in G1-, S- en M-fasen mogelijk. Dit zal met name nuttig zijn voor celcyclusanalyse op studies naar niet-mutaties die mitotische genen beïnvloeden.We verwachten dat mensen twee tot drie maanden worstelen als ze geen voorkennis of ervaring hebben met deze techniek. Voeg om te beginnen Schneider's dissectiemedium of SM toe aan twee opeenvolgende depressies van een glanzende spotplaat en voeg PBS toe aan de daaropvolgende depressie. Pluk met behulp van een tang zwervende derde instarlarven en plaats ze op een weefsel gerammeld met PBS om vliegenvoedselresten te verwijderen.Plaats de larve in de depressie met PBS gevolgd door de opeenvolgende depressie met SM. Gebruik vervolgens onder een dissectiemicroscoop een fijne tang om driekwart van het onderlichaam van de larve te verwijderen. Pak dan voorzichtig de larvale mondhaken met één tang en houd de cuticula van het andere uiteinde vast met de andere tang. Draai de larvenkop binnenstebuiten door de mondhaken naar binnen te duwen en tegelijkertijd het weefsel aan de andere kant af te pellen.Observeer de larvale hersenen met bevestigde denkbeeldige schijven. Verwijder andere weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd en breng de hersenen over naar de daaropvolgende opeenvolgende depressie met SM. Voeg 100 microliter 100 micromolaire EDU SM-oplossing toe aan een andere depressie op de Pyrex-plaat en incubeer ongeveer 5 tot 10 ontleedde hersenen in deze oplossing gedurende 2 uur bij 25 graden Celsius. Verwijder na fixatie en immunostaining PBST en voeg de EDU-detectiecocktail toe aan de ontlede hersenen.Incubeer ze vervolgens bij kamertemperatuur in het donker op een neutater. Was de monsters na 30 minuten tweemaal met PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt in het donker. Bereid voor DNA-kleuring 5 microgram per milliliter Hoechst 33342-oplossing.Verwijder PBST na de tweede wasbeurt en voeg 500 microliter van de Hoechst-oplossing toe aan de ontleedde hersenen en incubeer ze vervolgens in het donker. Verwijder na 10 minuten de Hoechst en was de monsters met PBST gedurende 10 minuten. Tik de buis op de laboratoriumbank en laat de hersenen tot rust komen.Verwijder de PBST uit de buis en laat 50 tot 100 microliter achter. Snijd het uiteinde van een micropipetpunt van 200 microliter en gebruik deze om de hersenen over te brengen op een schone glasplaat. Verwijder access PBST van de dia door deze te deppen met filterpapierstroken.Laat het filterpapier de hersenen niet raken. Plaats een druppel van een in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium op de hersenen en oriënteer de hersenen zodanig dat de ventrale zenuwstreng naar de glijbaan is gericht en de lobben naar boven gericht. Rangschik de hersenen in een enkel bestand, zodat het gemakkelijker is om de hersenen serieel in beeld te brengen.Plaats voorzichtig een afdekslip bovenop de hersenen en incubeer de dia 's nachts bij 2 tot 6 graden Celsius. Selecteer uit de acquisitiesoftware de doelstelling van 63 keer. Plaats een druppel dompelolie op de afdekplaat net boven de gemonteerde hersenen om het weefsel gemakkelijker door het oculair te lokaliseren.Gebruik het dappy Hoechst 33342-kanaal om de hersenen via het oculair te vinden en schakel vervolgens over naar de acquisitiemodus in de software. Stel 4 kanalen in om Hoechst 33342, Alexa floor 4 8 8, Alexa floor 5 6, 8 en Alexa floor 6 4 7 te bebeelden. Gebruik de kleurstofassistent om de geselecteerde kleurstofexcitatielasers en emissiefilters automatisch in te stellen.Stel het gezichtsveld zo in dat het de hele hersenkwab omvat. Stel je het volledige volume van de hersenkwab voor door deze belasting 0,8 micron uit elkaar te krijgen. Sla alle afbeeldingen van een beeldbewerkingssessie op in een dot L I F-bibliotheekindeling.Voor beeldanalyse opent u Fiji en sleept u de LIF-bestanden naar Fiji. Selecteer gegevensbrowser op het tabblad Stapelweergave en gebruik virtuele stapel op het tabblad Geheugenbeheer in de plug-in bio-indelingen. Observeer de meerkanaalsafbeelding die wordt weergegeven in afbeelding J. Wijzig de kleur van de kanalen in de menubalk met behulp van het gereedschap Afbeelding, Kleur en Kanalen.En monitor de Miranda gelabelde neuroblasten, die verschijnen als grote ronde cellen in het centrale hersengebied. Teken een interessegebied met behulp van de ellipstool over elke neuroblast om te voorkomen dat de neuroblast twee keer wordt geteld. Selecteer in de J-menubalk van afbeelding de optie Analyseren, hulpprogramma's en ROI-beheer.Markeer alle neuroblasten in de huidige Z-sectie en druk op T na het markeren van elke cel. Zodra alle neuroblasten in de huidige Z-sectie zijn gemarkeerd, wijzigt u de kanalen in pH3 en EDU en telt u handmatig het aantal EDU-positieve neuroblasten, pH3-positieve neuroblasten, EDU- en pH3-positieve neuroblasten en neuroblasten die niet kleuren voor beide markers. Zoek naar neuroblasten en daaropvolgende Z-secties, verwijder oude ROI's en voeg nieuwe ROI's toe om neuroblasten in verschillende stapels te tellen.Maak een spreadsheet en bereken percentages neuroblasten die aanwezig zijn in alle vier de categorieën voor elke kwab. Bereid een staafdiagram voor met behulp van de spreadsheetsoftware, met de poolgegevens voor percentages neuroblasten in elke categorie. Centrale hersenneuroblasten van derde instar larvale hersenen gemarkeerd met Miranda, EDU en pH3 worden hier getoond.Cellen werden toegewezen aan G1/G0, S, SG2/M en M fasen. In EDU pH3-analyse werd een significant hoger percentage MMS19, functieverlies neuroblasten gevonden in de M-fase in vergelijking met neuroblasten van het wilde type. MMS19:eGFP-expressie in de MMS19-achtergrondverlies van functie redde het aandeel cellen in de M-fase tot wildtypeniveaus.Het is belangrijk om geen beschadigde hersenen te gebruiken voor volgende stappen. En ED-oplossing moet vers worden bereid voordat met dissecties wordt begonnen. Deze asset kan worden gebruikt als een snelle eerste screening om defecten in specifieke celcyclusfasen te identificeren.Dit zou dan kunnen worden gevolgd door een meer gedetailleerde analyse van een bepaalde fase.

5-ethynyl-2-deoxyuridinephospho-histone-h3-dual-labeling-protocol-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Een protocol voor celcyclus analyse gemaakt van...

Live-Cell Cycle Analysis van<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels met de Attune Acoustic Focusing Cytometer en Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Toediening van twee analogen van thymidine, Edu en BrdU, bij zwangere muizen maakt de analyse van de celcyclus en in neurale voorlopercellen in de embryonale hersenen van muizen. Deze werkwijze is nuttig om de effecten van genotoxische stress, zoals ioniserende straling, tijdens de hersenontwikkeling bepalen.

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol beschrijft hoe je een Drosophila S2-cellijn genereert die gevoelig is voor kleine molecuulremmers van kinesin-5. Het gebruik van deze cellen in een op cellen gebaseerde foutcorrectie-assay wordt ook geschetst.

Het genereren van een &quot;gehumaniseerde&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellijn Gevoelig voor farmacologische remming van Kinesin-5

Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.

Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

We beschrijven twee complementaire protocollen om de S-faseduur in S. cerevisiae nauwkeurig te bepalen met behulp van EdU, een thymidine-analoog, dat in vivo is opgenomen en gedetecteerd met behulp van Click-chemie door microscopie en flowcytometrie. Het zorgt voor de eenvoudige karakterisering van de duur van DNA-replicatie en over het hoofd geziene replicatiedefecten in mutanten.

Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae

Het volgende protocol presenteert de detectie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus met behulp van celcyclussynchronisatie gevolgd door RPA2-immunofluorescerende kleuring.

Visualisatie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Leer een EdU/pH3-duallabelprotocol voor celcyclusanalyse in Drosophila neurale stamcellen. Deze methode categoriseert neuroblasten in G1-, S- en M-fasen voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

5-Ethynyl-2-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen (Video) | JoVE Journal

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

Meer video's verkennen