In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter
22 februari 2022
We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux mogelijk
Methoden die in dit protocol worden beschreven, zullen een waardevol platform bieden om de functionele rijping van ICM's voor cardiale herprogrammeringsstudies te beoordelen. De calciumflux wordt uitsluitend waargenomen in ICM's en biedt een manier om de functionele rijping van ICM te evalueren. Deze muizenstam vereenvoudigt de evaluatieprocedures en verbetert de reproduceerbaarheid van de resultaten.
Dit protocol is een nieuwe methode om de functionele rijping van ICM's in het veld van cardiale herprogrammering te evalueren. Het kan ook worden toegepast om cardiomyocytendifferentiatie en hartfunctie te evalueren. Begin met het verkrijgen van acht tot 10 pups, P0 tot P2 pups om 10 miljoen neonatale cardiale fibroblasten of NCF's te isoleren.
Verdoof de pups diep door onderkoeling. Observeer de harten onder de fluorescentiemicroscoop om ervoor te zorgen dat het hart met het gewenste genotype calciumflux vertoont, aangegeven door GCaMP3 met kloppende harten. De andere genotypen vertonen geen fluorescentie.
Na isolatie van de harten, snijd ze in vier stukken zodat ze losjes met elkaar verbonden zijn. Was ze meerdere keren grondig in ijskoude Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing, of DPBS, in een plaat van zes centimeter om de bloedcelvervuiling in de geïsoleerde cellen te beperken. Verteer de harten met acht milliliter warme 0,25% Trypsine-EDTA in 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.
Gooi het Trypsin-supernatant weg en voeg vijf milliliter van 0,5 milligram per milliliter warm type twee collagenase toe aan de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank. Vortex het mengsel grondig en geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na de incubatie, opnieuw, vortex het mengsel grondig en laat het onverteerde weefsel bezinken door de zwaartekracht.
Verzamel het supernatant in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter koud fibroblastmedium. Verdun de cellen met fibroblastmedium zodanig dat de zaaidichtheid ongeveer twee tot 2,5 keer 10 tot de vierde cel per kubieke centimeter bedraagt. Zaai vervolgens de cellen in gerechten of borden.
De aangehechte fibroblasten moeten op de tweede dag na het zaaien een ovale tot ronde vorm hebben. Zaai op dag nul de NCF's tot de dichtheid van ongeveer één tot twee keer 10 tot de vierde cel per kubieke centimeter in fibroblastmedium. Vervang op dag één het kweekmedium door een virusbevattend medium voor elke put naar wens.
Vervang op dag 2, 24 uur na de virusinfectie, het virusbevattende medium door een regulier ICM-medium. Beoordeel de calciumionenflux met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij kamertemperatuur. Observeer de GCaMP3-positieve cellen onder het 10X-objectief en zorg ervoor dat het spontane cellen laat zien die kloppen in het brightfield-kanaal.
Harten met het juiste genotype vertoonden calciumionenflux gesynchroniseerd met kloppen, gevisualiseerd als GCaMP3-flourescentie. Terwijl er geen fluorescentie werd waargenomen in controleharten. Geïsoleerde NCP's bevestigden zich binnen twee uur aan de put en vertoonden een dag na het zaaien een ovale tot ronde vorm.
De calciumionenoscillatie vertoonde GCaMP3-fluorescentieverandering tussen het maximum en het minimum en de calciumionoscillatie van dergelijke cellen veranderde periodiek. Na de introductie van IMAP was het aantal kloppende clusters significant hoger dan dat in de gecontroleerde groep, aangezien het aantal GCaMP3-positieve cellen met calciumionenflux voor een hoogvermogensveld was toegenomen in de met IMAP-medium behandelde groep. NPF's moeten vers worden bereid en gezond zijn na isolatie.
Een snelle procedure van hartisolatie, snijden en een goede verteringstijd kan helpen om vermindering van de levensvatbaarheid en conditie van de cel te voorkomen. Deze methode biedt een manier om functioneel gerijpte ICM's te identificeren voor cardiale herprogrammeringsonderzoekers. Met meerdere verdere evaluatiemethoden kan men een beknopter begrip krijgen van functionele gerijpte ICM's.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe muis-reporterlijn, αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, voor het beoordelen van cardiale herprogrammering. Het vastgestelde protocol maakt de evaluatie van geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's) mogelijk, afgeleid van neonatale cardiale fibroblasten (NCF's), via calciumfluxanalyse.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Cardiale herprogrammering
- Geïnduceerde cardiomyocyten
- Calciumfluxanalyse
Achtergrond
- Het αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muismodel faciliteert cardiaal onderzoek.
- Neonatale cardiale fibroblasten kunnen efficiënt worden geconverteerd naar iCM's.
- Calciumflux dient als een belangrijke indicator voor de functionele rijping van iCM's.
- Deze methode verbetert de reproduceerbaarheid in cardiale herprogrammeringsstudies.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar platform te creëren voor het beoordelen van de functionele rijping van iCM's.
- Om evaluatieprocedures in onderzoek naar cardiale herprogrammering te vereenvoudigen.
- Om inzicht te bieden in de differentiatie van cardiomyocyten en de hartfunctie.
Gebruikte methoden
- Isolatie van neonatale cardiale fibroblasten uit pups van P0 tot P2.
- Conversie van NCF's naar geïnduceerde cardiomyocyten.
- Beoordeling van functionele rijping via calciumfluxmeting.
- Evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en de cardiale functie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle conversie van NCF's naar functionele iCM's.
- Calciumflux die uitsluitend in iCM's wordt waargenomen, wijst op rijping.
- Verbeterde reproduceerbaarheid van resultaten in studies naar cardiale herprogrammering.
- Protocol dat toepasbaar is voor het evalueren van cardiomyocyt-differentiatie.
Conclusies
- Het αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muismodel is een waardevol instrument.
- Calciumfluxanalyse is effectief voor het beoordelen van de rijping van iCM's.
- Deze methode kan het onderzoek naar cardiale herprogrammering en functie bevorderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het beoordelen van de functionele rijping van geïnduceerde cardiomyocyten blijft een kritieke flessenhals bij cardiale herprogrammering voor regeneratieve therapieën. Dit protocol biedt een directe, op reporters gebaseerde uitlezing van de calciumflux, waardoor een objectieve evaluatie van de functionele maturiteit van iCM mogelijk wordt, wat doelvalidatie en mechanisch risicobeheer in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door transcriptionele herprogrammering te koppelen aan functionele elektrofysiologische output, wordt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen verbeterd en worden portfoliobeslissingen over strategieën voor cardiaal herstel geïnformeerd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door de aflevering van transcriptiefactoren (MGT) te koppelen aan functionele calciumtransiënt-metingen in gereprogrammeerde cellen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van GCaMP3-fluorescentie om succesvol gereprogrammeerde iCM's te isoleren, waardoor de afhankelijkheid van indirecte markers zoals genexpressie wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Calciumflux dient als een functionele biomarker die biologische risicoreductie en doelwitbetrouwbaarheid ondersteunt bij cardiac reprogramming-benaderingen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Vestigt een gestandaardiseerd, op fluorescentie gebaseerd platform voor het kwantificeren van de calciumstroom als een kwantitatieve afhankelijke variabele in iCM-rijpingsassays.
- Reproduceerbaarheid: De reporter-muizenlijn waarborgt een consistente detectie van functionele iCM's over verschillende experimenten heen, wat bijdraagt aan de standaardisatie van de assay.
- Schaalbaarheid: Compatibel met fluorescentiemicroscopie en aanpasbaar aan imaging-systemen met een hogere doorvoersnelheid voor het screenen van de herprogrammeringsefficiëntie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Biedt een ziekte-relevant systeem om de functionele rijping van iCM's in vitro te beoordelen, wat de brug slaat tussen ontdekking en preklinische validatie.
- Translationele continuïteit: Maakt longitudinale beoordeling van de iCM-rijping mogelijk, van vroege herprogrammeringsstadia tot functionele elektrofysiologische competentie.
- Mechanische risicovermindering: Calciumflux-metingen helpen om structureel herprogrammeerde cellen te onderscheiden van functioneel rijpe iCM's, waardoor fout-positieve resultaten worden verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie naar preklinische evaluatie, waarbij specifiek functionele beoordeling mogelijk wordt gemaakt na transcriptionele herprogrammering maar vóór in vivo validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door vast te stellen of herprogrammeringsfactoren niet alleen merkerexpressie induceren, maar ook functionele calciumhuishouding.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare biologische systemen met kwantitatieve calciumflux-uitlezingen voor de vergelijking van verbindingen of condities.
- Analytica: Genereert fluorescentiegebaseerde temporele gegevens over de frequentie en amplitude van calciumoscillaties, wat statistische vergelijking van herprogrammeringscondities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro herprogrammeringsresultaten met functionele cardiomyocyten-fenotypen die relevant zijn voor preklinische modellen.
- Bedrijfbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar reporterplatform dat toepasbaar is op meerdere cardiale herprogrammeringstargets en differentiatieprotocollen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt directe meting van functionele rijping, waardoor mechanistische ambiguïteit in herprogrammeringsresultaten wordt verminderd.
- Operationele waarde: Verbetert standaardisatie en reproduceerbaarheid door de specificiteit van genetische reporters, waardoor variabiliteit door antilichaamgebaseerde methoden wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door moleculaire herprogrammering te koppelen aan functionele elektrofysiologische gereedheid.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van herprogrammeringsstrategieën mogelijk op basis van functionele iCM-opbrengst en rijpingskwaliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in muizenfokkerij, isolatie van hartweefsel en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot de αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenlijn en virale afleversystemen voor MGT.
- Vereist gestandaardiseerde kweekcondities en timing voor consistente iCM-inductie en beoordeling van de calciumflux.
- Aanpassing aan alternatieve fibroblastbronnen of soorten kan validatie van de reporter-specificiteit en de getrouwheid van de calciumsignalering vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van spontane contractie voor de visualisatie van de flux en potentiële variabiliteit in de transfectie-efficiëntie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
