Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Microben die gastheer geassocieerd zijn, vormen dit zeer complexe ecosysteem dat echt beeldvorming nodig heeft om begrepen te worden. Door middel van dit deeltje laten we je zien hoe je door het kleuringsproces kunt gaan en visualisatie van de gastheermicrobioominterface kunt bereiken. Het begrijpen van de biologie van gastheer-geassocieerde bacteriën vereist een goed begrip van hun lokalisatie binnen micro-omgevingen.

En deze techniek zal ons in staat stellen om individuele taxa te visualiseren binnen gastheeromgevingen, evenals binnen de context van andere bacteriën. Door deze techniek zal het mogelijk zijn om te bepalen welke bacteriën mogelijk door het gastheerweefsel zijn doorgedrongen, en om te bepalen of belangrijke kenmerken zoals het gastheerslijm kunnen zijn uitgeput. Bereid vers methacarn in een compatibele container met 60% absolute methanol, 30% chloroform en 10% ijsazijn.

Snijd met behulp van scherpe en schone hulpmiddelen darmsegmenten van de muizen voor beeldvorming. Minimaliseer het verstoren van het monster zoveel mogelijk en behandel de secties bij hun ribbels om te voorkomen dat het beeldvormingsgebied wordt beïnvloed. Bevestig het monster zo snel mogelijk na de dissectie om degradatie te voorkomen.

Plaats de darmsecties in histologiecassettes door voorzichtig een rand van het weefsel vast te houden met een pincet. Sluit de cassette en dompel deze volledig onder in een verse methacarnoplossing, zodat de oplossing niet ouder is dan enkele uren na het onderdompelen van de cassettes. Voor klinische monsters die worden verzameld in een klinische suite zonder toegang tot een zuurkast, gebruikt u een polyethyleen opslagcontainer met een klep die in het deksel is gesneden en die de doorgang van de histologiecassettes mogelijk maakt.

Plak deze klep dicht wanneer er geen monsters worden doorgegeven om te voorkomen dat giftige dampen ontsnappen. Doe de paraffine in een hittebestendige container en smelt een nacht in een oven op 60 graden Celsius. Was het weefsel door de vloeistof in de daarvoor bestemde afvalcontainer uit te gieten en achtereenvolgens te incuberen in absolute methanol, absolute ethanol en xyleen zoals beschreven in het teksthandschrift.

Open de cassettes iets om de paraffine binnen te laten zonder de weefselsegmenten te verliezen met dubbele handschoenen of een pincet. Dompel de cassettes onder en sluit ze in de container met gesmolten paraffine. Plaats de container terug in de oven van 60 graden Celsius en zorg ervoor dat de cassettes gevuld zijn met paraffine en er geen grote luchtbellen achterblijven.

Haal na incubatie gedurende twee uur de container uit de oven. Verwijder met een tang voorzichtig de cassettes. Verwarm de oven op 60 graden Celsius en verwarm een Coplin-pot voor.

Voeg voldoende volume xyleen toe in een glazen fles om de glazen glijden in de pot twee keer te bedekken en plaats parafilm rond het deksel om verdamping van de xylenen te voorkomen. Laat de temperatuur van de xylenen 60 graden Celsius bereiken. Bereid de FISH-hybridisatieoplossing voor zoals vermeld in het tekstmanuscript.

Plaats de dia's in de Coplin-pot, zorg ervoor dat de secties niet in contact komen met andere dia's of de pot en bak de dia's gedurende 10 minuten op 60 graden Celsius. Vul in de zuurkast de Coplin-pot met voorgewarmde xylenen uit de oven, zorg ervoor dat u niet direct op de monsters giet en mogelijk de weefsels losmaakt. Zet de Coplin pot terug in de oven van 60 graden.

Giet gebruikte xylenen in een goede afvalcontainer, zorg ervoor dat de weefselsecties op de glazen dia's niet worden verstoord en gebruik een tang om te voorkomen dat de glaasjes uit de Coplin-pot vallen. Vul de Coplin-pot aan met de resterende xylenen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast. Incubeer de secties in 99,5% ethanol gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder na de incubatie de dia's uit de Coplin-pot. Veeg de achterkant van de dia's af op een laboratoriumdoekje of een papieren handdoek en droog kort aan de lucht totdat de ethanoldruppeltjes verdwenen zijn. Maak zeer nauwe cirkels rond elke weefselsectie met behulp van een vloeistofblokker of PAP-pen om het uitbreidingsgebied te beperken dat door de hybridisatieoplossing moet worden bedekt, waardoor inktcontact met de sectie wordt vermeden.

Bereid de hybridisatieoplossing voor en voeg 0,5 microgram sonde toe voor elke 50 microliter van de gebruikte oplossing. Pipetteer de oplossing op de secties op de dia. Overlay de sectie met flexibele plastic coverslips, zodat het gebruikte vloeistofvolume het hele gedeelte bedekt.

Maak een vochtige kamer met een pipetpuntdoos met doekjes of papieren handdoeken die zijn gedrenkt met overtollige hybridisatieoplossing of PBS om vochtigheid te bieden. Incubeer de glijbaan in de vochtige kamer bij 45 tot 50 graden Celsius gedurende ten minste drie uur, afhankelijk van de sonde die is ingesteld om de verdamping te verminderen. Verwijder de plastic coverslips en incubeer de dia's in FISH wasbuffer in een Coplin-pot die beide voorverwarmd zijn tot 50 graden Celsius.

Plaats de Coplin pot terug in de oven van 50 graden Celsius gedurende 10 tot 20 minuten. Verwijder de FISH wasbuffer en vervang deze door PBS in de Coplin pot. Direct na het bijvullen van de Coplin pot met PBS, decanteer de PBS.

Verwijder de glijden uit de pot en pipetteer de counterstain bovenop het hele gedeelte, terwijl u ervoor zorgt dat u het weefsel niet raakt met de pipetpunt. Incubeer bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten. Was de vlekken drie keer snel met verse PBS.

Veeg de achterkant van de dia's tegen een doekje of papieren handdoek en laat het grootste deel van de PBS van de secties verdampen, geholpen door een vacuümleiding die is aangesloten op een pipetpunt. Monteer de secties met behulp van een montagemedium. Bevestig de coverslips op de dia door langs de randen van de coverslip te schilderen met heldere nagellak, waarbij u ervoor zorgt dat u uit de buurt van de rand van de dia blijft.

Laat het op kamertemperatuur inwerken. Afbeeldingen van distale dikke darm van muis mono-gekoloniseerd met Muribaculum intestinale en de ene bi-gekoloniseerd met Muribaculum intestinale en Bacteroides thetaiotaomicron worden hier getoond. De monsters werden gekleurd met een FISH-sonde drie prime cyanine-3 gelabeld specifiek voor Muribaculum isolaat en ook tegengekleurd met het rhodamine-gebonden lectine UEA-1 en DAPI.

De afbeeldingen van secties gekleurd met cyanine-3 FISH, DAPI en gecombineerde cyanine-3 FISH- en DAPI-kanalen tonen de lokalisatie van Muribaculum intestinale. Alle bacterievormige en bacterie-sized DAPI-signalen zijn gelabeld met cyanine-3 in de monokolonisatietoestand. In de bi-kolonisatietoestand zijn er naast deze cyanine-3 en DAPI dubbel positieve cellen DAPI-gekleurde bacteriële cellen die zoals verwacht cyanine-3 negatief zijn.

Met uitzondering van langere filamenteuze bacteriën zijn grotere DAPI-positieve structuren plantaardig materiaal of kernen van gastheercellen. Een darmsegment dat is gesneden op een diepte die een zicht biedt op het lumen en longitudinale weergaven van het epitheel en een ondiep sectiesegment dat alleen doorsneden van crypten en geen constante slijmlaag of bacteriën onthult, bewijst dat ondiepe sectie geen luminale plakjes van de darm zal opleveren. Ongelijke weefsel- of coverslipdekking resulteert in wazige en ongelijk verlichte tegelscans.

Een voorbeeld van normale achtergrond en hoge achtergrond worden hier ook getoond. Naarmate we meer te weten komen over de microbiota, is het echt duidelijk geworden dat bulktests zoals sequencing niet genoeg zijn om echt te bepalen wat er gebeurt tussen verschillende microbiële soorten en hoe ze met elkaar interageren. En daarvoor hebben we echt beeldvorming nodig.

Dit type techniek heeft een aantal echt belangrijke ontdekkingen mogelijk gemaakt, bijvoorbeeld dat het ontbreken van vezels uit het dieet dunner wordt van de slijmlaag en mogelijk infectie door pathogenen veroorzaakt, zoals studies van de Martins-groep, evenals studies naar de effecten van osmotische diarree en hoe de uitputting van de slijmlaag echt van invloed is op zowel de gastheer als de microbiota. En dit waren studies gedaan door de Sonnenberg-groep, evenals onze groep.