Macrofaagdifferentiatie en polarisatie in een M2-achtig fenotype met behulp van een menselijke monocytachtige THP-1 leukemie cellijn
2 augustus 2021
M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.
Ontstekingsremmende tumor geassocieerde macrofagen zijn gekoppeld aan progressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol is een gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Momenteel is er geen gevestigd model voor ontstekingsremmende THP-1 polarisatie.
Dit protocol maakt gebruik van adequate rustperioden en een langdurig polarisatieproces om een duidelijk M2-achtig macrofaagsubtype te creëren. Tumorontwikkeling, bijvoorbeeld bij darmkanker en weefselremodellering, worden gecontroleerd door ontstekingsremmende macrofagen. Onder studies die hun functie onderzoeken, zorgt gestandaardiseerde creatie van een duidelijk M2-achtig subtype voor reproduceerbare bevindingen.
Begin met het instellen van een timer voor 150 seconden. Verwijder de bevroren injectieflacon met de THP-1-cellijn uit de vloeibare stikstof en ontdooi de injectieflacon onmiddellijk bij 37 graden Celsius in een schoonwaterbad, start de timer zodra de injectieflacon in het waterbad wordt geplaatst. Maak de dop los om de druk los te laten die is opgebouwd als gevolg van het ontdooiproces, zodat de buisopening niet in contact komt met het water om verontreiniging te voorkomen.
Ontdooi de celsuspensie totdat een ijschip van ongeveer vier millimeter groot in de injectieflacon achterblijft en ga onmiddellijk verder met de volgende stap. Breng de vloeibare fase van de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter met negen milliliter warme groeimedia. Breng vervolgens een milliliter van deze warme mediumcelsuspensie over in de THP-1-injectieflacon en terug naar de buis van 15 milliliter om de resterende ijschip te smelten en spoel de injectieflacon door om ervoor te zorgen dat er geen cellen achterblijven.
Meng de suspensie voorzichtig door deze op en neer te pipetten met een pipet van één milliliter. Verwijder ongeveer 10 microliter van het monster om de cellen te tellen op levensvatbaarheid met trypan blue. De cellen met helder cytoplasma zijn levensvatbaar, een blauw cytoplasma duidt op celdood.
Draai tijdens het tellen de warme celsuspensie gedurende zeven minuten bij 37 graden Celsius op 200 keer G. Verwijder het supernatant volledig en resuspend de cellen in groeimedium om een celdichtheid van 500.000 cellen per milliliter te bereiken. Meng de suspensie voorzichtig en breng elk 22 milliliter over in T75-celkweekkolven.
Bewaar de kolven rechtop in een incubator bij 37 graden Celsius met een kooldioxideconcentratie van 5% en wissel de groeimedia om de drie tot vier dagen uit. Bereid de celsuspensie voor om de cellen met een dichtheid van 300.000 per milliliter per put in 24-well celkweekplaten te zaaien. Meng het medium voorzichtig en bereid aliquots van 26 milliliter in 50 milliliter buizen.
Breng één milliliter van het celbevattende medium over in elke put van een plaat met 24 putten. Meng de media voorzichtig door het op en neer te pipetteren tussen de overdrachten door. Bewaar de vers bereide werkoplossing van PMA op ijs en voeg 100 nanogram PMA per put toe.
Incubeer de platen in de couveuse zonder verdere behandeling gedurende 72 uur. Verwijder na 72 uur het groeimedium en vervang het door één milliliter vers groeimedium, zodat u de bodem van de putten niet raakt met pipetpunten. Laat de cellen nog 96 uur rusten in de couveuse.
Verwijder het groeimedium en vervang het door één milliliter vers groeimedium. Voeg 20 nanogram interleukine 4 en 20 nanogram interleukine 13 per put toe. Laat de cellen vervolgens 48 uur rusten in de couveuse.
Herhaal het hele proces na 48 uur en laat de cellen nog 48 uur rusten in de couveuse. Verwijder het groeimedium en vervang het door één milliliter vers groeimedium. Laat de cellen vervolgens 48 uur rusten in de couveuse.
Verwijder het warme celmedium uit elke put en vervang het door een mengsel van één milliliter ijskoude PBS zonder calcium en magnesium en 5% FBS. Plaats de celplaat dan onmiddellijk gedurende 45 minuten op ijs. Na 45 minuten op ijs schraap je de cellen af met behulp van mini-celschrapers.
Breng de losgemaakte macrofagen voorzichtig over naar koude PBS en 5% FBS in een buis van 15 milliliter die op ijs wordt gehouden. De macrofagen afgeleid van de polarisatiemethode tonen de expressie van CD14, evenals CD11b-markers. De monocyten- en macrofaagmarkers CD14 en CD11b werden uitgedrukt in respectievelijk 70,9% en 74,7% van de cellen.
Cellen vertoonden lage oppervlakteniveaus van de M1-achtige marker CD80 in 0,2% van de cellen en hoge oppervlakteniveaus van de M2-achtige marker CD206 in 62,6% van de cellen. Omdat THP-1-cellen in medium de neiging hebben om naar de bodem van een injectieflacon te zinken en gemakkelijk te activeren zijn door mechanische stress, is het voorzichtig mengen en hanteren van de cellen belangrijk. M2-achtige macrofagen worden reproduceerbaar gemaakt en zijn gekarakteriseerd met behulp van QR-TPCR, ELISA en flowcytometrie.
Dit is de basis voor het onderzoeken van ontstekingsremmende mechanismen bij de ontwikkeling van kanker of weefselremodellering.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol biedt een uitgebreide handleiding voor het differentiëren en polariseren van THP-1 monocyt-achtige cellen tot M2-achtige macrofagen binnen 14 dagen. M2-achtige tumorgeassocieerde macrofagen (TAM) zijn gekoppeld aan tumorprogressie en een slechte prognose bij kanker, waardoor dit model essentieel is voor het bestuderen van hun anti-inflammatoire effecten in de tumoromgeving.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- M2-achtige TAM's zijn geassocieerd met cancerprogressie.
- Er is een gebrek aan gevestigde modellen voor anti-inflammatoire THP-1 polarisatie.
- De gestandaardiseerde creatie van verschillende macrofaagsubtypen is cruciaal voor reproduceerbaar onderzoek.
- Anti-inflammatoire macrofagen spelen een rol bij tumorontwikkeling en weefselremodellering.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol te bieden voor het genereren van M2-achtige macrofagen.
- Om de rol van TAM in de tumoromgeving te onderzoeken.
- Om het begrip van ontstekingsremmende mechanismen bij kanker te vergroten.
Gebruikte methoden
- Differentiatie van THP-1 monocyten tot macrofagen.
- Langdurig polarisatieproces om een M2-achtig fenotype te bereiken.
- Opname van rustperioden tijdens het protocol.
- Standaardisatie van methoden om reproduceerbaarheid te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie en polarisatie van THP-1 cellen tot M2-achtige macrofagen.
- Vestiging van een betrouwbaar model voor het bestuderen van TAM-functies.
- Inzichten in de ontstekingsremmende rollen van M2-achtige macrofagen bij kanker.
- Potentiële implicaties voor therapeutische strategieën gericht op TAM.
Conclusies
- Het protocol maakt de reproduceerbare generatie van M2-achtige macrofagen mogelijk.
- Inzicht in de functies van TAMs kan bijdragen aan benaderingen voor kankerbehandeling.
- Verder onderzoek is nodig om het therapeutische potentieel van het targeten van M2-achtige macrofagen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol vult een kritische leemte in het immuno-oncologisch onderzoek door een gestandaardiseerde methode te bieden voor het genereren van M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen uit THP-1-cellen, waardoor reproduceerbaar onderzoek naar immunosuppressieve mechanismen bij kanker mogelijk wordt. Het model ondersteunt targetvalidatie en mechanische risicoreductie voor therapieën die gericht zijn op het moduleren van macrofaagpolarisatie in de tumoromgeving. Door het vaststellen van een betrouwbaar M2-achtig fenotype wordt de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische studies verhoogd die de functie van TAM koppelen aan tumorprogressie en weefselremodellering.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar het M2-achtig macrofaagfenotype als therapeutisch doelwit bij de progressie van kanker.
- Operationele waarde: Biedt een consistent cellulair model voor de validatie van doelwitten die betrokken zijn bij macrofaagpolarisatieroutes.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een gestandaardiseerde macrofaagpopulatie voor het screenen van immunomodulerende verbindingen die de expressie van M2-markers beïnvloeden.
- Operationele waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van assays met gedefinieerde eindpunten, zoals expressieniveaus van CD206 en CD80, voor het profileren van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de preklinische evaluatie van middelen die de polarisatie van TAM's in tumor-achtige contexten moduleren.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale beoordeling van de stabiliteit en functie van M2-achtige macrofagen mogelijk over de polarisatietijdlijn van 14 dagen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een gevalideerd macrofaagmodel te leveren voor target-engagement en functionele screening voorafgaand aan lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over M2-polariserende signalen en hun rol bij tumorbevorderende ontsteking.
- Screening: Levert reproduceerbare macrofaagpreparaten voor kwantitatieve beoordeling van de effecten van verbindingen op polarisatiemarkers.
- Analytics: Maakt flowcytometrie-, qRT-PCR- en ELISA-uitlezingen mogelijk om CD206, CD80, CD14 en CD11b als polarisatieindicatoren te meten.
- Translationeel Onderzoek: Modelleert de betrokkenheid van M2-achtige TAM bij tumorprogressie en weefselremodellering voor preklinische continuïteit.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor immunologie- en oncologieteams die onderzoek doen naar macrofaag-gemedieerde drugresistentie.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in TAM-gerelateerde fenotypes door gestandaardiseerde generatie van M2-achtige macrofagen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid tussen laboratoria via gedefinieerde intervallen voor differentiatie, rust en polarisatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare preklinische gegevens te verschaffen over interventies gericht op macrofagen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van consistente M2-achtige macrofaagreacties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celkweek, flowcytometrie en het hanteren van cytokines.
- Is afhankelijk van toegang tot incubatoren, veiligheidskabinetten en apparatuur voor celtelling en levensvatbaarheidsbeoordeling.
- Maakt standaardisatie van de dosering en timing van PMA, IL-4 en IL-13 tussen gebruikers noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het vertalen van bevindingen naar primaire humane monocyten of in vivo-modellen.
- Omvat praktische beperkingen zoals donorvariabiliteit in primaire cellen en de noodzaak van aseptische technieken tijdens langdurige kweek.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:56
Culturing and Maintenance of THP‐1 Monocyte-like Cells
2:59
Seeding of THP‐1 cells and Differentiation into M0 Macrophages
4:01
Polarization of M0 Macrophages into M2‐like Macrophages
4:39
Detaching and Harvesting Macrophages for Flow Cytometry
5:14
Results: Macrophage Differentiation and Polarization into an M2‐Like Phenotype
5:56
Conclusion
