Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Single-molecule, eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering kan een aanvulling zijn op single-molecule FRET-metingen bij het bestuderen van eiwitstructure subpopulaties en conformaties, vooral in gevallen waarin verschillende structurele subpopulaties rapporteren over stabiele lokale structuren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het verschillende site-specifieke structurele subpopulaties vangt op basis van de nabijheid van de kleurstofetiketteringsplaats naar de eiwitoppervlakken. Single-molecule, eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering kan worden toegepast op elk biomoleculair systeem van belang om verschillende, lokale, structurele subpopulaties te onderzoeken.

Begin met het bereiden van 25 picomolaire Sulfo-Cy3-gelabelde alfa-synucleïne in meetbuffer in een eiwitarme bindingsbuis. Voeg 100 microliter van één milligram per milliliter BSA toe aan de 18-kamer microscopiedekselschuif en incubeer gedurende één minuut en gooi vervolgens de BSA weg. Voeg 100 microliter van 25 picomolair Sulfo-Cy3-gelabeld alfa-synucleïnemonster toe aan de kamer van de afdekschuif.

Voeg vervolgens voor de gegevensverzameling een druppel ultrapioneel water toe aan de bovenkant van de wateronderdompelingsobjectieflens met hoog numeriek diafragma, bevestig de afdekschuif in de podiumkamer en installeer vervolgens de assemblage aan de bovenkant van de microscooptrap. Breng de objectieflens naar boven totdat de waterdruppel bovenop de objectieflens aan de onderkant van de schuif van de afdekplaat smeert en open de lasersluiter. Wanneer de objectieflens naar boven beweegt, inspecteer je het patroon van de luchtige ringen op een CCD-camera.

De eerste ring vertegenwoordigt de focus op de water/glas interface en de tweede ring vertegenwoordigt de focus op het raakvlak tussen het glas en de monsteroplossing. Verhoog de hoogte van de objectieflens met 75 micrometer om de laserfocus diep in de oplossing te brengen om de autofluorescentie van het glazen oppervlak van de afdekslip te minimaliseren. Stem het laservermogen af op de objectieflens ongeveer 100, microwatt.

Begin met het verwerven van de gedetecteerde fotonen voor een vooraf gedefinieerde tijd. Open de Jupyter-notitieblokken en open vervolgens het voorbeeldnotitieblok. Laad het fretbursts en photon-hdf5 databestand.

Gebruik het histogram van de interfotontijden om de achtergrondsnelheden te berekenen voor elke 30 seconden van gegevensverzameling. Verplaats een tijdvenster van één foton tegelijk voor 20 opeenvolgende fotonen en verzamel de fotongegevens als de momentane fotonsnelheid F ten minste 11 keer groter is dan de achtergrondsnelheid voor die periode van de gegevensverzameling. Bereken de burstgrootte en hoeveelheid fotonen in een burst, de burst-duur, het tijdsverschil tussen de laatste en eerste fotondetectietijden in een burst, de burst-helderheid, de grootste waarde van de momentane fotonsnelheid in een burst en de burst-scheiding, het tijdsinterval tussen opeenvolgende bursts.

Plot het histogram van burst-helderheidswaarden met de gebeurtenissenas in een logaritmische schaal. Definieer de bursthelderheidsdrempel als de minimale bursthelderheidswaarde van waaruit het histogram een vervallend patroon vertoont en selecteert de bursts met helderheidswaarden die groter zijn dan de burst-helderheidsdrempel. Voor de burst mean fluorescence lifetime measurement plot het histogram van foton nanotime voor alle fotonen in de geselecteerde bursts met de foton counts as in een logaritmische schaal.

Definieer de nanotijddrempel als de minimale nanotijdwaarde van waaruit het histogram van fotonnnanotijden een vervalpatroon vertoont. Selecteer alleen die fotonen met nanotijden groter dan de nanotijddrempel. Bereken het algebraïsch gemiddelde van alle geselecteerde fotonnnanotijden.

Trek de nanotijddrempel af van het algebraïsche gemiddelde van de foton nanotijd. De verkregen waarde is de gemiddelde fotonnnanotijd van de burst, recht evenredig met de gemiddelde fluorescentielevensduur. Plot het histogram van alle burst mean fluorescentielevens.

De centraal verdeelde subpopulaties van de fluorescentielevensduur kunnen verschijnen. De subpopulaties met gemiddelden met een lagere waarde vertegenwoordigen de moleculaire soorten met Sulfo-Cy3 die niet sterisch werden belemmerd, terwijl de subpopulaties met gemiddelden met een hogere waarde de molecuulsoorten met S-Cy3 vertegenwoordigen die meer sterisch werden belemmerd. Voor de langzame, tussen-burst dynamica beoordeling, plot het histogram van de burst scheidingstijden met een scheidingstijdas in een logaritmische schaal.

Selecteer deze optie om alle paren van de opeenvolgende bursts op te slaan die worden gescheiden door minder dan een maximale scheidingstijd die de subpopulatie van hetzelfde molecuul definieert. Plot een histogram of een scatterplot van de gemiddelde fluorescentielevensduur van de eerste en tweede bursts voor alle paren van de bursts die terugkeerden onder een bepaalde scheidingstijddrempel. De histogrammen van de gemiddelde fluorescentielevensduur van een enkel, S-Cy3-gelabeld, alfa-synucleïne-56-molecuul toonden aan dat de eerste subpopulatie een karakteristieke fluorescentielevensduur van 1,6 nanoseconden had en alfa-synucleïneconforme toestanden vertegenwoordigde met weinig eiwitoppervlakken in de buurt van residu 56.

De tweede subpopulatie had een karakteristieke fluorescentielevensduur van 3,5 nanoseconden en vertegenwoordigde alfa-synucleïne conformatietoestanden met meer eiwitoppervlakken in de buurt van residu 56. Van de niet-amyloïde bètacomponentsegmenten van alfa-synucleïnemoleculen is bekend dat ze een spiraalvormige haarspeldstructuur aannemen bij binding aan SDS-blaasjes, wat werd bevestigd als een enkele florescence-levenspopulatie met een karakteristieke levensduur van ongeveer drie nanoseconden en afwezigheid van de subpopulatie met de karakteristieke levensduur van 1,6 nanoseconden. Het histogram van de scheidingstijden tussen opeenvolgende, single-molecule bursts rapporteert terugkerende moleculen voor de scheidingstijden sneller dan 100 milliseconden, waarbij de eerste en tweede bursts ontstaan uit hetzelfde molecuul.

Het gemiddelde fluorescentielevensduur histogram van alle single molecule-bursts toonde subpopulaties met een korte karakteristieke levensduur, evenals met een lange karakteristieke levensduur, wat aangeeft dat individuele moleculen overgangen tussen verschillende gemiddelde levensduurwaarden langzamer konden ondergaan dan burst-duurtijden. Binnen burst-scheidingstijden van maximaal 100 milliseconden was er een fractie van moleculen die begon als een eerste burst in de kortlevende subpopulatie en terugkeerde als een tweede burst binnen de langlevende subpopulatie. Terwijl de fractie van moleculen die begon als een eerste uitbarsting in de langlevende subpopulatie en terugkeerde als een tweede uitbarsting binnen de kortlevende populatie, de overgangen tussen de twee subpopulaties binnen 10 tot 100 milliseconden aangeeft.

Het belangrijkste om te onthouden bij het analyseren van de experimentele resultaten is om fluorescentiesignalen met één molecuul goed te scheiden van de achtergrond en om uitbarstingen te analyseren met voldoende foton nanotijden. De ontwikkeling van smPIFE maakte de weg vrij voor onderzoekers om nucleïnezuureiwitinteracties op het niveau van één molecuul te onderzoeken. Deze vooruitgang legt de basis voor het bestuderen van lokale structurele dynamica binnen eiwitten.