Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

Single-molecule FRET kan dynamica vastleggen die plaatsvindt op nanometerafstanden, wat de juiste schaal is voor het biosyntheseproces van ribosomale eiwitten. Ribosoom werkt door meerdere factoren en componenten allosterisch te coördineren, wat intrinsiek inhomogeen is. Single-molecule methode kan elk ribosoom volgen zonder te worden beperkt door dit inhomogene gemiddelde effect.

Deze methode zal onthullen hoe antibiotica de ribosoomfunctie remmen om nieuwe geneesmiddelen te ontwikkelen voor medicijnresistente bacteriële infecties. Begin met het bereiden van de PRE door de initiatie EFTU, NOG en PAG mix te mengen in de verhouding van één-op-twee op-twee bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten. Na incubatie zuivert u de PRE met behulp van 1,1 molair sucrosekussen ultracentrifugatie gedurende een nacht bij 100.000 keer G.Bereid de POST door de initiatie EFTU, WG en PHE-mix te mengen in een verhouding van één op twee bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Na incubatie zuivert u de POST met behulp van 1,1 molaire sucrosekussen ultracentrifugatie gedurende de nacht bij 100.000 keer G.Reinig de microscoopglasglaasjes met zes paar gaten met een diameter van één millimeter en de nummer 1,5 microscoopglasdeksels. Bak de schone glaasjes en coverslips drie uur lang op 300 graden Celsius en bedek de coverslip vervolgens met aminosaline. Leg in een schone laminaire kap één deklip plat op het oppervlak.

Laat voorzichtig 60 microliter PEG-oplossing op de bovenrand vallen en leg er vervolgens nog een coverslip op, zodat het capillaire effect de oplossing ertussen verspreidt, zodat er geen bubbels worden gevormd. Herhaal deze stappen voor nog twee paar coverslips. Bewaar deze coverslips in een lege tipdoos gevuld met water en incubeer ze gedurende drie uur in het donker.

Na drie uur scheidt u de coverslips, spoelt u af met water in drie opeenvolgende smeltkroezen en zuivert u met een droge stikstofstroom. Trek scherpe pipetpunten door de gaten op de glazen platen tot ze goed passen. Schraap de scherpe uiteinden eraf tot ze helemaal vlak zijn met het glasoppervlak en knip vervolgens een dubbelzijdige tape met het kanaalpatroon erop.

Plak het op de glazen platen aan de vlakke kant. Plak de gecoate dekplaat op de dubbelzijdige tape en druk erop om een strakke afdichting van de monsterkamer te maken, zorg ervoor dat de gecoate kant naar binnen is gericht. Schakel de computer en de microscoopschakelaar in.

Start de laserbesturingsinterface en schakel de laser in. Druk op de inschakelen-knop op de laserbesturingskast om de laser op te warmen. Schakel de camera's in en start het aan de microscoop gekoppelde softwareprogramma.

Klik de bovenste sluiter uit en klik de lamp aan. Bereid de TAM10 voor met Tween-buffer door 10 microliter van 5%Tween-20 toe te voegen aan één milliliter TAM10-buffer. Bereid de deoxy-oplossing door drie milligram glucoseoxidase in een kleine microcentrifugebuis te wegen en voeg er 45 microliter catalase aan toe.

Draai de buis voorzichtig om de vaste stof op te lossen. Draai gedurende één minuut op 20.000 keer G in een microcentrifuge en neem het supernatant. Bereid 30% glucose-oplossing, 200 millimolar Trolox-oplossing en 0,5 milligram per milliliter streptavidin-oplossing volgens de instructies in het tekstmanuscript.

Voeg één druppel beeldolie toe aan het grasdoel. Plaats de monsterkamers op het doel. Vul de kamer met 10 microliter streptavidin-oplossing en wacht één minuut.

Was de kamer met 30 microliter TAM10 met Tween-buffer en verzamel de doorloopoplossing met een gevouwen filtreerpapier. Wacht een minuut na het wassen. Verdun de ribosoomcomplexen PRE of POST tot 10-15 nanomolaire concentraties met TAM10 met Tween-buffer.

Laad 20 microliter van het ribosoommonster in het kanaal en wacht twee minuten. Maak de beeldvormingsbuffer met 50 microliter TAM10-buffer en 0,5 microliter elk van deoxyglucose en Trolox-oplossing. Meng ze goed.

Spoel de kamer met 30 milliliter van de beeldvormingsbuffer. Stel de camera in voor het verkrijgen van beelden. Klik de bovenste sluiter aan en de lamp uit.

Start de camera-acquisitie en verspreid de beelden in drie vensters die twee afzonderlijke camera's en de overlay vertegenwoordigen. Selecteer onder het acquire-menu capture timelapse en klik vervolgens op automatisch vastleggen. Stel de juiste bestandsnaam, bestandspad en het aantal lussen in en klik op Nu uitvoeren.

Sluit het pop-upvenster zodra de afbeeldingsacquisitie is voltooid en open vervolgens het verkregen ND-bestand. Klik op ROI, eenvoudige ROI-editor en kies de optiecirkel. Selecteer de ROI op de afbeelding en klik op voltooien wanneer deze is voltooid.

Klik op meting, tijdmeting om de gegevens weer te geven als een plot of een spreadsheet. Open het tabblad Export om de exportparameters in te stellen en klik vervolgens op exporteren om de intensiteiten op te slaan. Open ten slotte het bestand dat is geëxporteerd met behulp van een geschikte toepassing.

De afstand van het L27-etiketteringsresidu tot het A-site of P-site tRNA is respectievelijk 61 of 52 angstrom, wat overeenkomt met een FRET-efficiëntie van 0,47 en 0,65. Florescentie-intensiteiten van de donor- en acceptorkanalen werden opgehaald en uitgezet als timelapses. Na het bleken van de donor naderden beide sporen de uitgangswaarde omdat er geen excitatie direct op de acceptor kon optreden.

Na het bleken van de acceptor nam de donorintensiteit toe omdat minder reactieroutes de excitatie-energie afvoerden. De individuele ribosomen vertoonden verschillende fluctuaties als gevolg van de wiebelende beweging van de tRNA's, die afstandsfluctuaties tot de L27 veroorzaakten. Andere methoden zoals Puromycine assay, assay, toeprinting assay en mass spec zijn complementair aan single-molecule FRET methode en onthullen meer details over eiwitsynthese.

Single-molecule FRET heeft een brede toepassing omdat veel biologische processen plaatsvinden in het nanometerbereik en op milliseconde tijdschalen. Door de juiste kleurstoffen op de juiste posities te labelen, kunnen veel andere dynamieken worden onthuld.