Synthese en karakterisering van multimodale faseverandering porfyrinedruppels

Dit protocol is belangrijk omdat het de volledige procedure biedt voor het maken van druppels van de lipidefilm naar lipide-oplossing naar microbubbels en vervolgens naar druppels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud voor het condenseren van microbubbels in druppels. Alleen al door te koelen en te wervelen, kunnen druppels worden gemaakt zonder dat er druk nodig is.

Een visuele demonstratie is van cruciaal belang omdat een eenvoudige test om te zien of de microbubbels met succes zijn gecondenseerd, is door de verandering in doorschijnendheid visueel te controleren. Kimoon Yoo, een masterstudent in het Gang Zheng-laboratorium, demonstreert de procedure. Verwijder met behulp van een decapper de aluminiumafdichting op de serumflacon en breng één milliliter van de lipide-oplossing over naar een 1,85 milliliter borosilicaatglasmonsterflacon met een fenolschroefdop door de lipideoplossing door de binnenwand te laten stromen zonder bubbels te creëren.

Bereid u met de injectieflacon met het monster van 1,85 milliliter voor om met behulp van de gaswisselaar in de hoofdruimte van de monsterflacon in de hoofdruimte van de monsterflacon te stromen. Zorg ervoor dat alle kleppen op de gaswisselaar goed gesloten zijn en dat de pomp is uitgeschakeld. Open de klep van het spruitstuk en maak voorzichtig de bijbehorende naald los van het spruitstuk.

Open drukventiel A en drukventiel B en draai de gasflesklep ongeveer 1/16 tot 1/8 tegen de klok in om deze gedeeltelijk te openen. Open de T-handgreepklep en ontdek de injectieflacon met het monster met de lipide-oplossing. Plaats de spruitstuknaald boven de vloeibare luchtinterface van de injectieflacon, draai de luchtregelaarklep langzaam met de klok mee totdat de naald van de luchtregelaar iets uit de rustpositie beweegt en laat het perfluorkoolstofgas gedurende 30 seconden voorzichtig in de kopruimte van de injectieflacon stromen, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bellen ontstaan.

Stel indien nodig de luchtregelaarklep in. Na 30 seconden, zorgvuldig en snel bewaarde de monsterflacon zonder de injectieflacon te veel te bewegen. Zowel de gasflesklep, de T-handgreepklep, luchtregelaarklep, drukklep A, drukklep B en spruitstukklep.

Schede de naald voorzichtig om, label vervolgens de monsterflacon en sluit de hals af met wasfolie die met de klok mee gaat. Bewaar de injectieflacon met monster in het donker en bij vier graden Celsius gedurende ten minste 10 minuten of maximaal 24 uur. Plaats ongeveer 100 gram droogijs in een geïsoleerde container op plaats van gewoon ijs in een andere geïsoleerde container.

Haal een eerder bereide decafluorbutaan serumflacon op 1,5 inch 20 gauge naalden, een plastic spuit van één milliliter, een container van 200 milliliter, een metalen tang en een thermometer. Plaats de injectieflacon met het monster met de lipide-oplossing in het mechanische roerwerk en roer gedurende 45 seconden. Er moet een verandering in kleur en doorschijnendheid zijn.

Na het mechanisch roeren zet u de monsterflacon rechtsboven, afgeschermd van licht en begint u met aftellen van 15 minuten om de injectieflacon af te koelen en de grootte van de microbubbels te selecteren. Wanneer het aftellen 10 minuten heeft bereikt, vult u een container met ongeveer 200 milliliter isopropanol en koelt u deze af tot min 20 graden Celsius met droogijs met behulp van een metalen tang. Nadat de microbubbels gedurende 15 minuten zijn geselecteerd, zoekt u naar de geselecteerde partitie in de monsterflacon.

Houd de injectieflacon met de monsterflacon rechts omhoog, maak de monsterflacon voorzichtig los en zuig ongeveer 0,7 milliliter van de onderste scheidingswand op met een 1,5 inch naald van 20 gauge bevestigd aan een plastic spuit van één milliliter. Zorg ervoor dat geen van de bovenste scheidingswanden is teruggetrokken en veeg niet met de spuit om de luchtzakken te verwijderen. Richt op de middelste cirkel op de rubberen stop, steek een andere naald van 20 gauge in een decafluorbutaan serumflacon terwijl u de naald in de buurt van de bovenkant van de serumflacon houdt om te ventileren en breng vervolgens de naald in met de grootte geselecteerde microbubbels.

Breng langzaam de grootte van de geselecteerde microbubbels over. Laat de vloeistof voorzichtig langs de binnenwand van de decafluorbutaan serumflacon glijden. Zodra alle geselecteerde microbubbeloplossing is overgebracht, verwijdert u de naald met de spuit, maar houdt u de ontluchtingsnaald erin om de negatieve druk te verlichten.

Voeg kleine hoeveelheden droogijs of isopropanol bij kamertemperatuur toe aan het isopropanolbad om ervoor te zorgen dat de badtemperatuur tussen min 15 en min 17 graden Celsius ligt. Met de 20 gauge ontluchtingsnaald ingebracht in de buurt van de bovenkant van de serumflacon, plaatst u de serumflacon en het isopropanolbad, waarbij het microbubbelniveau onder het niveau van de isopropanol blijft, maar de hals van de injectieflacon erboven en met tussenpozen de serumflacon gedurende twee minuten zwenkt om de microbubbels te condenseren. Draai de serumflacon niet continu in de isopropanol en laat de oplossing niet bevriezen.

Draai ongeveer vijf seconden rond en til de serumflacon uit de isopropanol. Controleer op ijskernvorming en hervat het wervelen in isopropanol. Als er ijsvorming is, draai de serumflacon dan in de lucht totdat deze verdwijnt.

Verwijder na de condensatie van twee minuten de serumflacon uit het isopropanolbad en verwijder de ontluchtingsnaald. De microbubbels moeten zijn gecondenseerd tot druppeltjes zoals aangegeven door de verandering in doorschijnendheid. Veeg de serumflacon af, label deze en plaats deze op gewoon ijs in een donker geïsoleerde container totdat deze klaar is voor gebruik.

Ongeopende druppels met een intacte aluminium afdichting moeten maximaal zes uur stabiel zijn zolang het gesmolten ijs indien nodig wordt vervangen. Wanneer u klaar bent voor gebruik, verwijdert u de aluminium afdichting met de decapper. Na gebruik van dit protocol werden voorgecondenseerde, grootte geselecteerde microbubbels en post-gecondenseerde druppels gedimensioneerd op een Coulter-teller met een diafragma van 10 micron.

De maatgegevens voor de 30% pyro-lipideformulering worden getoond. De statistieken op basis van de maatgegevens worden hier weergegeven. Met behulp van een verhouding van voor- en nagecondenseerde gemiddelde diameters toonden de resultaten aan dat naarmate het pyro-lipidegehalte toenam, de concentratie afnam en de gemiddelde diameter toenam.

De representatieve absorptiemetingen van het 30% pyro-lipidedruppelmonster worden getoond. Dit toonde aan dat de intacte assemblages verschillende optische eigenschappen hebben, zoals weerspiegeld door verschillende pieken in vergelijking met de individuele niet-gemonteerde lipidecomponenten. Representatieve florescentiemetingen van het voorgecondenseerde microbubbel, post-gecondenseerde druppelmonster met 30% pyro-lipide worden hier getoond, waarbij verschillende fluorescentiepieken worden aangetoond voor intacte monsters in de verstoorde vorm.

Representatieve echografiebeelden van het 30% pyro-lipidedruppelmonster dat bij verschillende drukken is afgebeeld, worden getoond. Bij lage drukken werd alleen achtergrondsignaal van luchtbellen waargenomen die vastzaten van de agarsynthese. Bij een iets hoger vermogen werden een paar microbubbels gegenereerd, wat wordt aangetoond door het verschijnen van heldere spikkels.

Er werden meer microbubbels gegenereerd naarmate de druk toenam. Het is belangrijk om te onthouden dat de condensatietemperatuur hier is geoptimaliseerd voor deze specifieke druppelschaalformulering. Verschillende shell formuleringen kunnen een andere temperatuur vereisen.